王晓艳[1]2003年在《NGX6基因对结肠癌细胞的作用及机制研究》文中研究表明结肠癌是最常见的消化道肿瘤之一，其发病机制涉及到多个抑瘤基因的失活和瘤基因的激活，尤其是抑瘤基因的失活。Vogelstein建立的结肠癌“APC→K-ras→DCC→p53→nm23”的多种瘤基因及抑瘤基因的突变和缺失的发病机制模式不能解释全部结肠癌的发生，且结肠癌细胞株发病机制的研究结果表明结肠癌的发病机制存在多样性，因此寻找新的抑瘤基因已成为揭示结肠癌发病机制的关键。我校肿瘤研究所细胞遗传室采用定位候选克隆的方法在9p11.1-12区域克隆了一个新基因NGX6，Genbank登录号：AF188239，其高表达可明显抑制鼻咽癌细胞系的生长，可能为抑瘤基因侯选者。并有研究初步证明NGX6在结肠癌，尤其是在有远处转移的结肠癌中表达下调或缺失。本研究通过脂质体介导NGX6转染结肠癌细胞系，进一步阐明NGX6在结肠癌发生发展中的作用及其分子机制。 我们通过脂质体转染方法将真核表达载体pcDNA3.1(+)/NGX6导入结肠癌细胞株HT-29细胞中，并用G418筛选，PCR、RT-PCR和点杂交鉴定，建立了稳定表达NGX6基因的HT-29细胞系。通过生长曲线、MTT、软琼脂集落形成、流式细胞术、裸鼠成瘤等方法探讨NGX6对HT-29结肠癌细胞系生物学行为的影响。借助免疫组化、免疫荧光、蛋白印迹等方法研究NGX6在体内、体外影响结肠癌细胞系生长的作用机制。 研究结果表明：转染了NGX6基因的HT-29细胞系的生长速度明显减慢，倍增时间由转染前的23.0小时延长至34.5小时；MTT显示NGX6转染组细胞在490nm处的吸光度较未转染组明显下降(p＜0.05)；软琼脂集落形成率降低(p＜0.05)；NGX6转染后HT-29细胞在裸鼠体内成瘤明显延缓，博士学位论文 中文摘要－－w＊”移植瘤体积大小和重量较HT上9组和 PCDNA3．1（）空载体转染组有所减少，将叁组肿瘤进行病理切片，均为低分化腺癌，无组间差异，显示NGX6基因对裸鼠移植瘤生长具有抑制作用。因此，推断NGX6基因重表达在体内及体外均可逆转HT亿9结肠癌细胞系的恶性表型。 细胞周期调控机制的紊乱导致细胞失控性生长与分裂，显示出其恶性特征，故肿瘤又是一种细胞周期病。研究中采用流式细胞仪分析了细胞周期及细胞周期素的改变，结果显示稳定表达NGX6的HT七9细胞系 G／G；期细胞分布较对照组明显增加，S期细胞数减少；细胞凋亡率在转染前后无明显变化；cyclin E、cyclin B、cyclin DI的表达量下降，以 cyclin E和cyclin DI的改变最为明显。Western blot验证 cyclin E、cyclin DI在NGX6转染前后的变化，与流式细胞仪检测结果一致，以上结果说明在结肠癌细胞系中NGX6可宜主要通过下调cyclin E、cyclin DI的表达，延缓细胞周期的G；－S的进程，从而抑制HT七9细胞的过度增殖。 生物信息学预测NGX6具有－个EGF－like domain。研究表明转染NGX6后的鼻咽癌细胞系的EGFR和酪氨酸激酶传导通路上的MAPK磷酸化程度均较转染前明显降低，提示NGX6可能为EGFR的负性调控因子。为进一步探讨其在结肠癌细胞系的作用机制，本研究采用免疫组化、免疫荧光、蛋白印迹技术检测酪氨酸激酶传导通路上主要蛋白分子及细胞周期调控蛋白cycl＊s、CKI在转染NGX6前后的变化。结果显示：转染NGX6后细胞信号传导通路上的EGFR、K1as、p－JNK、c寸un均有不同程度的下调。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物家族成员P27在转染NGX6后上调；P16在NGX6转染前后HT《9结肠癌细胞系中均无表达，免疫组化结果与Wes朽＊ bio亡结果一致。c寸un的免疫荧光结果提示cJun主要分布于胞核，部分位于胞浆，且NGX6转染后核内cJun的分布较转染前减少。以上结果表明NG涨可能抑制酪氨酸激酶传导通路的信号传导、下调细胞周期素eye＊n E、cycl in DI和上调似 k27）的表达而阻滞细胞周期的进行，抑制细胞的 2博士学位论文 中文摘要增殖。 为了明确ATGX6蛋白在细胞中发挥作用的部位；我们进一步将NGX6MyC融合蛋白的真核表达载体系统pCMV十yC通过瞬时转染将该重组体导入HT－29结肠癌细胞系。采用兔疫荧光的方法检测NGX6－MyC融合蛋白的定位，荧光显微镜观察结果，显示该融合蛋白位于细胞胞浆内，少部分存在于胞膜上。根据生物信息学预测NGX6全长编码的蛋白具有两个跨膜区，去跨膜区后NGX6定位于胞浆的结果，推测NGX6编码的蛋白可能在胞浆中合成后，定位于膜上，分泌到胞外发挥其抑瘤作用。 为进一步研究了NGX6在体内作用的分子机制，实验中还采用免疫组化的方法分析了 EGFR． K－ras、c－Jun和 p27在NGX6转染前后细胞株所致的移植瘤中的表达变化。结果表明NGX6转染在移植瘤内亦可降低EGFR、K－ras和cJ八n的表达，上调p27的表达，与体外NGX6的作用机制一致，结果表明NGX6在体内也通过影响EGFR介导的酪氨酸激酶信号传导通路的激活及CKI家族P27的表达抑制肿瘤的增殖。更为重要的是发现NGX6在移植瘤中抑制血管内瘤栓形成，提示NGX6可能与结肠癌细胞的转移有关。借助
郭勤, 廖曼甜, 连平, 王晓艳, 沈守荣[2]2008年在《NGX6抑制结肠癌细胞HT-29侵袭转移的分子机制研究》文中提出目的探讨NGX6基因对结肠癌细胞系HT-29体外侵袭转移的影响及产生的分子机制。方法以叁组结肠癌细胞株HT-29、pcDNA3.1(+)/HT-29、pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29为研究对象,采用Transfilter Cell Invasion Assays、细胞外基质黏附实验和划痕标记染料示踪实验探讨NGX6基因对结肠癌细胞系HT-29体外侵袭转移的影响。为了明确分子机制,采用RT-PCR、Western blotting、细胞免疫荧光实验分别从细胞水平、mRNA水平和蛋白质水平检测NGX6对WNT信号传导通路中的关键分子β-catenin的影响,通过荧光素酶报告基因分析测定法检测NGX6对结肠癌HT-29细胞系中Wnt通路的关键分子Tcf4及下游靶基因cyclinD1的活性的影响,通过Western blot方法检测NGX6对Wnt通路下游靶基因c-myc、cyclinD1的表达的影响,运用RT-PCR方法检测NGX6对Wnt通路下游基因COX-2的影响。结果NGX6基因抑制结肠癌细胞HT-29的侵袭转移,能够恢复HT-29细胞的细胞间间隙连接(GJIC)能力;其机制为NGX6基因抑制β-catenin在细胞内总蛋白和核蛋白水平的表达,抑制Tcf4启动子活性,从而抑制下游靶基因cyclinD1启动子活性,降低c-myc、cyclinD1蛋白表达水平以及COX- 2mRNA表达水平。这说明NGX6很可能是Wnt信号通路中的负性调控子,这很可能是NGX6抑制结肠癌增殖和转移的机制之一。结论NGX6基因通过抑制WNT信号通路发挥抑制HT-29细胞的增殖和降低HT-29细胞的侵袭转移能力的作用。
连平[3]2010年在《NGX6基因对结肠癌血管形成及凋亡影响的研究》文中指出NGX6基因是中南大学肿瘤研究所分子遗传室在对鼻咽癌研究中筛选克隆出的一个新基因(Genbank号AF188239)。生物信息学分析显示：NGX6基因cDNA全长2134bp,编码蛋白含338个氨基酸,预测分子量37kDa,含有2个跨膜结构域,胞外区含有1个表皮生长因子(EGF)样结构域和3个糖基化位点,胞内区较短,含有一个酪氨酸激酶磷酸化位点。前期对NGX6基因的研究中发现：NGX6在鼻咽癌活检组织、鼻咽癌上皮细胞株中表达下调甚至缺失,在正常鼻咽组织中存在明确的表达；NGX6基因在结直肠癌中亦存在不同程度的表达下调,且伴有淋巴结转移的结直肠癌样本当中NGX6表达下调的比例(15/16)远高于无淋巴结转移的结直肠癌样本(25/34)；利用高通量的组织芯片进行的原位杂交实验发现,NGX6基因的表达在有转移的肿瘤组织下调更明显,且与临床分期相关；将NGX6基因分别转染鼻咽癌和结肠癌细胞之后可以使鼻咽癌细胞和结肠癌细胞的恶性表型得到部分逆转(通过细胞周期、细胞生长曲线、软琼脂集落形成、裸鼠接种等实验获得的数据)；并使鼻咽癌和结肠癌细胞的基因/蛋白质表达谱发生某些改变及表皮生长因子受体的磷酸化水平下降；利用绿色荧光蛋白发现NGX6的亚细胞定位主要是细胞膜。NGX6基因作为具有一个酪氨酸激酶磷酸化位点的膜蛋白,提示了NGX6基因参与细胞内信号传导的一种可能。NGX6基因胞外区含有1个表皮生长因子(EGF)样结构域,EGF样结构域主要和受体一配体间交互作用有关,提示NGX6基因在细胞信号传导中应与有生长因子样结构的膜蛋白有着协同或拮抗作用。同时前期研究证明NGX6基因可以使表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化水平下降,提示NGX6基因可能调控EGFR通路,影响NF-κB的活化,影响肿瘤的发生、发展。在前期研究工作的基础上,结合对NGX6基因生物信息学特征分析的结果,本研究为进一步对NGX6基因功能的探讨做了如下实验：1.利用已构建好的pcDNA3.1(+)／NGX6／HT-29结肠癌细胞,通过鸡胚绒毛尿囊膜血管(CAM)形成实验,将结肠癌细胞接种到鸡胚绒毛尿囊膜,发现NGX6基因抑制了鸡胚绒毛尿囊膜血管的形成；将结肠癌细胞接种到裸鼠腋前皮下,发现NGX6基因抑制了结肠癌种植瘤的生长,将种植瘤切片分析证实NGX6基因抑制了结肠癌种植瘤内血管的形成,抑制了种植瘤血管内癌栓的形成,并且抑制了结肠癌的转移；RT-PCR实验表明NGX6基因下调了结肠癌细胞及结肠癌种植瘤内VEGF的表达。这些实验结果表明NGX6基因抑制了结肠癌的血管形成,进而影响了肿瘤的发展及转移。2.通过PI／Annexin-V双染流式细胞仪检测发现,对于在体外培养的结肠癌细胞,转染了NGX6基因的与未转染的比较,凋亡并无差别,基本上全都是正常的活细胞；通过EMSA分析结肠癌细胞核蛋白,转染了NGX6基因的结肠癌HT-29细胞NF-κB激活明显受到抑制；将结肠癌细胞接种到裸鼠腋前皮下,将种植瘤通过PI／Annexin-V双染流式细胞仪检测发现转染了NGX6基因的与未转染的比较,凋亡率明显增高；与化疗药物5-Fu联用后,NGX6基因明显诱导了结肠癌细胞的凋亡。这些实验结果说明NGX6基因通过抑制结肠癌细胞NF-κB的激活,促进了结肠癌细胞的凋亡。NGX6基因抑制VEGF的表达以及NF-κB的激活间接说明NGX6基因在细胞信号传导中与EGFR信号通路起拮抗作用。本实验说明NGX6基因能抑制肿瘤血管形成以及诱导肿瘤细胞凋亡,此结果为证实NGX6基因是一个抑瘤基因提供一个强有力的证明。结肠癌的侵袭转移是其致命的威胁,本研究中发现NGX6基因抑制了结肠癌的转移,此结果表明NGX6基因对结肠癌患者预后有着积极的影响作用。但是要确定NGX6基因具体的生物学功能以及更为详尽的机制有待以后进一步的研究。
王晓艳, 沈守荣, 刘芬, 李晓玲, 范松青[4]2006年在《NGX6基因对人结肠癌细胞HT-29细胞周期的影响》文中进行了进一步梳理NGX6基因是新克隆的候选抑瘤基因,研究表明NGX6重表达可抑制结肠癌细胞的增殖.为进一步研究NGX6对细胞周期的影响,采用流式细胞仪检测NGX6重表达对结肠癌细胞HT-29细胞周期的影响,发现NGX6重表达可增加HT-29细胞在G0/G1期的分布比例,减少了S,G2,M期细胞数.利用蛋白质印迹和流式细胞术分析NGX6转染前后HT-29细胞周期素(cyclins)和细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制物(cyclin-dependentkinaseinhibitor,CKI)的表达变化,发现NGX6可下调HT-29细胞中cyclinE、cyclinD1的表达及上调p27的表达,对cyclinA和cyclinB的表达无明显影响,p16在叁组结肠癌细胞中均无表达.研究结果表明,NGX6在HT-29细胞中通过下调cyclinE、cyclinD1和上调p27的表达,阻滞细胞周期于G0/G1期,从而发挥其在结肠癌中的抑瘤作用.
李予[5]2009年在《抑瘤基因NGX6对结肠癌细胞蛋白质表达谱的影响》文中提出研究背景结肠癌是常见的消化道肿瘤,其发病率及死亡率呈逐年上升趋势,严重地威胁着人类健康。结肠癌是一个多基因、多阶段逐步演变的病理过程,其中抑瘤基因的失活和瘤基因的异常激活在结肠癌的发生、增殖、转移等过程发挥重要作用,因而寻找鉴定有价值的结肠癌相关抑瘤基因/易感基因,阐明其分子机制对揭示结肠癌发病机制,建立有效的分子诊治方法至关重要。NGX6基因是中南大学肿瘤研究所分子遗传室采用定位侯选克隆策略克隆的基因(基因登录号:AF188239),定位于染色体9p21-22,cDNA全长2.1kb,生物信息学分析该基因编码一个338个氨基酸的跨膜蛋白,具有两个跨膜结构,一个EGF-Like domain,多个糖基化位点和多个酪氨酸激酶磷酸化位点。9p21-22区域等位基因杂合性缺失(loss of heteroaygosity,LOH)现象是多种肿瘤中的共同事件,提示该基因为一肿瘤相关基因。在前期研究发现:NGX6在不同分期的结直肠癌中存在不同程度的表达下调,尤其在有转移的结肠癌中其下调率高达93.7%。通过细胞周期、细胞生长曲线、MTT比色法、软琼脂集落形成、裸鼠接种等实验表明NGX6基因可逆转结肠癌细胞的恶性表型;流式细胞术检测发现NGX6可延缓结肠癌细胞从G0/G1期向S期的进程,并可诱导结肠癌细胞的凋亡;体外侵袭转移实验和划痕标记染料发现NGX6可抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用。NGX6基因的上述生物学效应提示:NGX6在结肠癌中发挥着抑瘤作用。我们进一步采用基因芯片技术分析NGX6对结肠癌细胞基因表达谱的影响,结果提示NGX6可能调控EGFR介导的JNK通路和Wnt/β-catenin等信号通路的活性而发挥抗肿瘤增殖和转移作用;通过EMSA发现NGX6可能通过抑制结肠癌细胞NF-κB的激活而诱导结肠癌细胞凋亡;免疫共沉淀技术发现NGX6与ezrin蛋白结合,ezrin是一个“桥梁”蛋白,连接膜蛋白与细胞骨架,在细胞运动、信号传导两条通路上都扮演着重要角色,这一结果表明NGX6在调控细胞黏附及运动中可能占有重要地位。上述研究强烈提示NGX6在结肠癌中发挥抑瘤作用,基因水平的研究提示其抑瘤机制可能为NGX6结合ezrin负调控EGFR介导的相关信号通路的活性而发挥其生物学功能。研究目的生命的最终执行者是蛋白质,NGX6基因对结肠癌中蛋白质组的调控作用如何呢?这是本课题的切入点,目前尚无相关研究报道。本研究在前期工作的基础上,分析结肠癌细胞中NGX6转染前后的差异蛋白表达谱,在蛋白质水平阐明NGX6基因抑瘤的主要机制。研究方法应用荧光差异凝胶电泳(DIGE)和质谱分析技术比较结肠癌细胞HT-29中NGX6转染前后的蛋白质谱的表达变化。具体方法:1)提取细胞蛋白质,并进行Clean-up处理、测量蛋白质浓度,进行2D-DIGE电泳,利用Typhone扫描仪获取图像,Labscan扫面软件扫描进行图谱分析。2)经过图谱分析,以大于1.8倍为标准选取差异蛋白点,挖点,酶解,质谱鉴定差异蛋白质。通过查找差异蛋白质生物信息学功能,明确NGX6在蛋白质水平对结肠癌的抑瘤机制。研究结果结果筛选到12个下调蛋白:nucleolin、90kDa heat shockprotein、tubulin、HNRPH1、Annexin A2、HCRTR1 protein、microtubule-associated protein 6 isoform 1、guanine nucleotidebinding protein,beta-2 subunit、Chain A,Crystal Structure OfA Soluble Dimeric Form Of Oxidised Clic1、Chain A,MolecularBasis For The Recognition Of Phosphorylated AndPhosphoacetylated Histone H3 By、Chain A,Molecular Basis ForThe Local Confomat ional Rearrangement Of Human PhosphoserinePhosphata等,4个上调蛋白:aldehyde dehydrogenase 1、ChainA,X-Ray Structure Of A Deletion Variant Of Human Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Complexe、phosphoglycerate mutase1(brain)、fatty acid binding protein5(psoriasis-associated)等。并通过Western印迹验证了分子伴侣HSP90和AnnexinⅡ在NGX6基因转染HT-29细胞后的表达变化,与质谱分析结果一致。生物信息学分析上述蛋白的功能,发现其均与肿瘤的发生发展密切相关,按功能分类包括:细胞信号转导、细胞周期、细胞凋亡、细胞骨架、运动和细胞代谢。这些基因涉及到与肿瘤增殖、凋亡及转移相关的信号通路:如JNK/SAPK信号通路,Raf-1/MAPK信号通路,IKK/NF-κB信号通路,PI3K-Akt信号通路,凋亡信号通路Bcl-2家族以及Fas凋亡途径等信号通路。这些通路间通过“中间分子”形成复杂的网络调控系统。结论在结肠癌细胞中NGX6基因可改变细胞信号转导、细胞周期、细胞凋亡、细胞骨架、运动和细胞代谢相关蛋白分子的表达,通过影响这些蛋白分子可能调控MAPK、IKK/NF-κB、PI3K-Akt及凋亡通路的活性而发挥其抗肿瘤增殖、转移及促肿瘤细胞凋亡的作用。下一步的工作我们将深入揭示NGX6基因对上述主要信号通路的调控作用。
连平, 郭勤, 彭娅, 肖志明, 刘芬[6]2009年在《NGX6基因联用5-Fu对人结肠癌细胞凋亡的影响》文中进行了进一步梳理目的:探讨侯选抑瘤基因NGX6联用5-Fu对结肠癌细胞凋亡的影响。方法:以稳定转染并表达NGX6基因的HT-29细胞与5-Fu联用作为实验组,以PDTC与5-Fu联用的HT-29细胞作为对照组,通过EMSA检测各组结肠癌HT-29细胞核转录因子-κB(NF-κB)的激活情况,利用MTT比色法检测各组细胞增殖的情况,吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)双染法显微镜观测以及PI/Annexin-V双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果:稳定转染并表达NGX6基因的HT-29细胞以及应用了PDTC的HT-29细胞NF-κB的激活均明显受到抑制;与5-Fu作用的HT-29细胞组比较,5-Fu联合PDTC作用于HT-29细胞后,HT-29细胞增殖受到明显抑制,5-Fu诱导HT-29细胞凋亡作用增强;与5-Fu联合PDTC作用于HT-29细胞的对照组比较,在诱导细胞凋亡以及抑制细胞增殖方面,稳定转染并表达NGX6基因的HT-29细胞与5-Fu联用组和对照组所取得一致的效果,NGX6基因增强5-Fu对HT-29细胞增殖抑制的能力及诱导HT-29细胞凋亡的能力。结论:NGX6基因抑制了肿瘤细胞NF-κB的激活,具有增强5-Fu诱导结肠癌细胞凋亡的能力,其机制可能是抑制肿瘤细胞NF-κB的激活,NGX6基因对肿瘤的治疗及预后起积极作用。
连平, 郭勤, 彭娅, 肖志明, 刘芬[7]2009年在《抑瘤基因NGX6对结肠癌血管形成的影响》文中指出目的:探讨抑瘤基因NGX6对结肠癌血管形成的影响.方法:将HT-29细胞分为3组:pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组(稳定转染并表达NGX6基因的HT-29细胞)、pcDNA3.1(+)/HT-29组(转染空白质粒的HT-29细胞)及HT-29对照组.通过鸡胚绒毛尿囊膜血管形成实验检测结肠癌细胞接种鸡胚血管形成情况.裸鼠成瘤实验观测种植瘤及其对裸鼠的影响,然后对种植瘤进行免疫组织化学实验检测其内部血管生成.RT-PCR检测NGX6基因及VEGF基因在各组细胞中的表达.结果:pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组鸡胚血管形成平均数量较HT-29与pcDNA3.1(+)/HT-29组明显减少(6.2±0.2vs8.6±0.2,8.4±0.3,P<0.05);HT-29组裸鼠明显消瘦且pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组与HT-29和pcDNA3.1(+)/HT-29组种植瘤平均质量、种植瘤微血管密度明显降低(1.83±0.25gvs4.06±0.20g,4.16±0.4g;1.83±0.52vs7.36±1.12vs6.96±1.43,均P<0.05);VEGF在pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29细胞及种植瘤中较其余两组明显降低,而pcDNA3.1(+)/HT-29细胞与未转染的HT-29细胞与种植瘤中呈高表达;且HE染色切片显示HT-29组及PcDNA3.1(+)/HT-29组种植瘤血管内都有癌栓,而PcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29组种植瘤内未见有癌栓形成.结论:NGX6基因能抑制结肠癌细胞HT-29血管的形成,抑瘤基因NGX6的抑癌能力部分是通过抑制血管形成来实现的.
连平, 郭勤, 彭娅, 肖志明, 刘芬[8]2008年在《抑瘤基因NGX6对人结肠癌细胞凋亡的影响》文中进行了进一步梳理NGX6基因是中南大学肿瘤研究所分子遗传室在对鼻咽癌研究中筛选克隆出的一个新基因.以稳定转染并表达NGX6基因的HT-29细胞为实验组,转染空白质粒的HT-29细胞以及HT-29细胞为对照组,利用PI/Annexin-V双染流式细胞仪检测结肠癌细胞的凋亡情况,通过EMSA分析体外培养的结肠癌细胞及种植瘤细胞内核转录因子-κB(NF-κB)的激活情况.研究结果表明:在裸鼠结肠癌种植瘤中,转染了NGX6基因的与未转染及空白载体组比较,结肠癌细胞凋亡率明显增高;EMSA(electrophoretic mobility shift assay)分析体外培养的结肠癌细胞及种植瘤细胞内核转录因子-κB(NF-κB)的激活情况,发现转染了NGX6基因的细胞NF-κB的激活均明显受到抑制.此研究说明,NGX6基因具有诱导结肠癌细胞凋亡的能力,其可能的机制是抑制了结肠癌细胞NF-κB的激活.
刘芬[9]2007年在《NGX6基因在Wnt/Beta-catenin信号传导通路中的作用机制研究》文中进行了进一步梳理结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,在西方国家结肠癌是癌相关性死亡的主要原因,我国结肠癌的发病率亦呈逐年上升趋势。从分子机制上阐明这一肿瘤的发生过程将会有助于我们更好地诊断和治疗该肿瘤,改善预后。经典的结肠癌癌变模式是由Vogelstein首先提出的,即从APC→K-ras→DCC→P53突变的线性发病模式。然而,最近的研究认为经典的结肠癌癌变模式只能代表少数结肠癌的发生形式,在结肠癌的癌变过程中尚存在多种不同的发生形式。因此寻找新的结肠癌相关的抑瘤基因或易感基因,并阐明其在结肠癌发生发展中的作用,已成为揭示结肠癌发病机制的关键。NGX6基因是中南大学肿瘤研究所分子遗传室采用定位侯选克隆策略克隆的一个侯选抑瘤基因(基因登陆号:AFl88239),定位于染色体9P21-22区。9P21-22区域的等位基因杂合性丢失(loss ofheterozygosity,LOH)现象是人类多种肿瘤中的共同事件,提示NGX6可能为肿瘤相关基因。生物信息学分析该基因cDNA全长2.1Kb,编码一个含338个氨基酸的跨膜蛋白,具有两个跨膜结构(234-256,269-291),胞外区含有一个EGF-like domain(185-221),3个N-糖基化位点(92-95,100-103,172-175)。胞内区较短,含有一个酪氨酸激酶磷酸化位点(257-268),提示NGX6基因可能为一跨膜蛋白,通过其EGF-like domain、酪氨酸激酶磷酸化位点、N-糖基化位点等功能域调控着细胞的增殖、黏附和运动等生物学过程。在我们的前期研究工作中发现:NGX6基因在结肠癌,尤其是有远处转移的结肠癌中表达明显下降甚至缺失,提示NGX6与结肠癌的发生发展密切相关。通过细胞转染、MTT、软琼脂集落形成及裸鼠成瘤等实验证实了NGX6在体内、体外均具有抑制结肠癌细胞增殖的作用。更令人兴奋的是在实验中发现了NGX6可抑制移植瘤内血管癌栓的形成,结合NGX6在结肠癌的表达规律的实验结果,强烈提示NGX6与结肠癌的转移相关。进一步的细胞侵袭、粘附实验和裸鼠移植瘤转移等实验证实了NGX6可抑制结肠癌细胞胞外基质粘附能力和侵袭能力,降低脾内原发灶的肝转移。FCM分析结果表明NGX6可能通过相关的信号传导通路下调cyclinE,cyclinD1和上调CKI家族成员P27的表达,延缓细胞周期G1→S的进程来抑制结肠癌增殖、转移的生物学功能。为明确其可能调控的基因网络,进一步利用cDNA microarray技术研究NGX6转染前后结肠癌细胞系HT-29基因表达谱的变化,发现了一些有价值的线索。NGX6可下调NDRG1、MMP1、ILK、ROCK2、COL11A1基因和上调DKK1、AKAP12、CSE1L、Geminin等基因的表达。其中Wnt/β-catenin信号通路上的相关分子DKK1表达上调,MMP1,ILK,COL11A1表达下调引起了我们的关注。这些分子的表达上/下调均能导致结肠癌中Wnt/β-catenin信号通路的抑制,并能够抑制结肠癌细胞的增殖和转移,而Wnt通路与结肠癌的关系十分密切。NGX6的重表达明显改变了上述分子的表达,这一信息给我们一个强烈提示:NGX6是否主要通过调控Wnt通路的激活和失活而发挥其抑瘤作用?为了明确NGX6与Wnt通路的关系,本论文从NGX6对Wnt通路下游靶分子的影响,结合阻断技术研究Wnt通路对NGX6的反馈调节,NGX6与β-catenin/TCF/LEF转录活化之间的关系深入探讨NGX6在Wnt通路中的可能的作用机制,得到了一些有意义的结果。下游靶基因的转录激活是Wnt通路被活化的最终效应。目前为止,已经发现的Wnt信号通路的靶基因多与细胞增殖、凋亡、转移相关。我们以与细胞增殖,凋亡,分化密切相关的分子c-myc,cyclinD1,c-Jun为研究对象,探讨NGX6对上述Wnt通路直接下游靶分子的影响。我们运用western-blot方法验证NGX6瞬时转染前后结肠癌细胞系SW620中c-myc,cyclinD1,c-Jun的表达,发现转染NGX6基因后c-myc,cyclinD1,c-Jun的表达量较转染前均有下降。该结果也初步提示NGX6对Wnt通路的下游靶基因具有抑制作用。那么NGX6对Wnt通路下游靶分子的抑制主要是通过什么途径发挥作用呢?生物信息学预测:NGX6是一个胞膜和胞浆蛋白,在胞浆中的定位可能是质膜成分和内质网。它的分布具有特征性,主要分布在细胞的膜质结构。因此,我们推测NGX6可能通过参与调节Wnt通路的中上游关键分子而发挥作用,这种作用可能是直接的蛋白交互作用,也可能通过中介分子而发生相互作用,在进一步的研究中寻找NGX6的交互作用蛋白将成为揭示其作用机制的关键。为了探讨Wnt通路与NGX6基因之间是否存在反馈调节作用,我们构建了真核表达载体pcDNA3.1-LEF1~(DN)抑制该通路来研究NGX6的表达改变情况。LEF1是LEF/TCF转录因子家族的一个成员。为了使Wnt信号传递至核内的靶基因,具有N-末端的β-catenin binding domain的全长LEF/TCF蛋白是必需存在的。LEF1的表达在结肠癌中被异常激活,全长LEF1蛋白的表达明显增加,而截短LEF1蛋白的表达几乎沉默。在本文中,我们通过TCF-4荧光素酶报告质粒的方法检测到转染pcDNA3.1-LEF1~(DN)后SW620细胞中TCF-4的荧光素酶活性是下降的,结合Western blot方法验证了Wnt通路下游靶分子的表达,均证实真核表达载体pcDNA3.1-LEF1~(DN)对Wnt/β-catenin信号通路具有抑制作用。本文采用RT-PCR的方法,验证了结肠癌细胞系SW620中瞬时转染pcDNA3.1-LEF1~(DN)前后的NGX6表达变化,发现NGX6的表达在转染后有上升的趋势,提示抑制Wnt/β-catenin信号通路可以上调抑瘤基因NGX6的表达,这说明NGX6与Wnt通路存在着相互反馈调节的可能,但其具体的反馈作用机制尚不明确。Wnt信号通路的核心分子是β-catenin。Wnt途径的活化使大量β-catenin进入细胞核内,与TCF/LEF形成β-catenin/TCF/LEF复合物,从而激活下游靶基因的转录。为了研究NGX6与β-catenin/TCF/LEF转录活化之间的关系,我们在内源性β-catenin含量相对较低的COS-7细胞中瞬时共转染NGX6和外源B-catenin(WT)来研究NGX6对TCF-4转录活性的影响,发现NGX6与外源β-catenin(WT)共转染比外源β-catenin(WT)单独转染的COS-7细胞TCF-4的荧光素酶报告质粒活性明显下降。这一结果给我们一个强烈提示:NGX6可能通过对β-catenin的负性调节作用来发挥它在Wnt通路中的抑制作用。我们对比了COS-7细胞和结肠癌SW620细胞在接受外源NGX6转染,而无外源β-catenin转染的情况下TCF-4转录活性的变化情况,结果发现转染NGX6后两种细胞系中的TCF-4转录活性均下降,同时我们还采用Western blot方法检测了瞬时转染NGX6后上述两种细胞系中核内β-catenin及TCF-4的表达,发现核内β-catenin及TCF-4的蛋白表达水平是明显下降的,SW620细胞的变化更为显着。该研究结果进一步提示我们,NGX6对于β-catenin的抑制作用是确切的,通过对β-catenin的核内聚集的抑制从而减少β-catenin与TCF-4的结合进而减少下游靶基因的转录活化。我们推测NGX6基因调节β-catenin可能的机制:1.增加胞浆内β-catenin的降解,减少其向核内转位,这一作用可能通过NGX6增强β-catenin“破坏复合物”中一个或多个成员的活性从而增加了β-catenin的降解,尤其是GSK-3β磷酸激酶的活性,以及其上游的抑制因子DVL-1;2.参与APC的核内—胞浆穿梭功能:(1)β-catenin/TCF-4复合物形成受到抑制;(2)β-catenin核输出增加;出核的β-catenin在胞浆内进一步被破坏复合物降解;(3)出核的β-catenin移至胞膜与E-cadherin结合增加,使得细胞间的黏附增强从而抑制转移。前期的细胞黏附与侵袭转移实验已经初步证实NGX6可以增强细胞间的黏附,可能参与转移的抑制,那么NGX6在参与负性调节Wnt信号通路中对β-catenin的抑制作用是否也通过促进β-catenin从核内输出至核外,导致核内β-catenin的表达降低,然后在胞浆内促进β-catenin被降解复合物降解或者促进β-catenin与胞膜上的E-cadhrin结合增加从而增加细胞间黏附而发挥作用呢?这些深入的机制探讨还有待更进一步的实验研究。为了更进一步明确NGX6在Wnt通路中的调控机制,我们将继续通过研究NGX6对GSK-3β活性及其磷酸化水平的影响,免疫共沉淀结合质谱技术寻找NGX6交互作用蛋白,通过分析这些蛋白的功能及其与NGX6作用的关键部位来探讨NGX6抑制Wnt通路的真正机制,为揭示结肠癌的发病分子机制提供更多的理论和实验依据。
刘敏姬[10]2011年在《抑瘤基因NGX6的转录调控研究》文中指出[研究背景]结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,近年来结直肠癌的发病率以及死亡率呈逐年上升趋势。目前结直肠癌发生发展的分子机制尚未完全阐明,许多结直肠癌相关基因未被发现。寻找新的结直肠癌相关的抑瘤基因或易感基因,对其功能进行研究,以期找到更多的影响结直肠癌发生发展的关键基因或比较特异的分子标志物,确定结直肠癌的遗传易感因素,阐明其发病的分子机制,对结直肠癌的诊断、预后监测以及新的抗肿瘤药物的研制都具有重要意义。NGX6基因是中南大学肿瘤研究所分子遗传室采用定位侯选克隆策略克隆的一个抑癌基因(基因登陆号：AF188239),定位于染色体9p13.3区域。它在结直肠癌细胞和组织中表达下调。前期研究表明：NGX6能通过抑制核内β-catenin的表达负调控Wnt/β-catenin通路,通过抑制P-JNK核移位负调控SPAK/JNK通路,并下调EGFR-PKC-IKK-NF-κB通路的关键分子和转录因子。过表达NGX6基因可以抑制结肠癌细胞增殖和细胞周期进程,抑制肿瘤血管的生成；降低肿瘤细胞体外侵袭能力,同时恢复肿瘤细胞间隙通讯。为了揭示NGX6基因在结直肠癌细胞和组织中表达下调的分子机制,本课题组前期对NGX6基因的转录调控区进行了初步研究。以NGX6基因mRNA的第一个碱基定义为+1,利用生物信息学分析技术、缺失突变体报告质粒构建技术以及荧光素酶活性分析系统,定位了NGX6基因的近距离启动子区-159/+276,并发现NGX6基因启动子区存在一个大小为约400bp的CpG岛。本课题在前期工作的基础上,对NGX6基因转录调控进行深入研究,希望从调控该基因表达的上游基因的角度,明确该基因具体的表达调控机制,以进一步揭示NGX6基因在肿瘤的增殖、侵袭、转移中的分子机制,深入阐明NGX6基因的生物学功能。[NGX6基因启动子的精细定位]在前期的研究工作中,我们成功克隆并鉴定了NGX6基因启动子,并将NGX6基因的近距离启动子区定位于-159/+276的区域。为了进一步获得NGX6基因的最小启动子序列,依据MatInspector软件分析结果,分别在其近距离启动子片段-159/+276的5’或3’进行缺失不同长度的部分序列,构建了五个缺失突变报告质粒：pGL3 -159/+100、pGL3 +100/+276、pGL3-159/-86、pGL3 -86/+12和pGL3+12/+100。将它们分别转染不同细胞系中,采用荧光素酶活性检测和绿色荧光蛋白活体检测法发现NGX6基因-86/+100的长度为186 bp的区域为其最小启动子区。[NGX6基因启动子顺式作用元件和反式作用因子的鉴定和功能研究]真核基因表达调控体系中最关键的是转录起始水平的调控,其基本机制主要包括顺式作用元件、反式作用因子和RNA聚合酶叁者之间的相互协同作用,其实质是蛋白质与DNA、蛋白质与蛋白质之间的相互作用。在线软件MatInspector分析结果表明,NGX6基因启动子区为一个不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区。它含有多种转录因子结合位点,如：Sp1、Egr-1、NF-Y、P53、MYC-MAX和AP2等。凝胶电泳迁移率(EMSA)证实了NGX6基因启动子区的Sp1(-17/+5)、NF-Y(-36/-18)以及Sp1/Egr(-54/-39)结合位点。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验证实了转录因子Spl和Egr-1与NGX6基因启动子的特异牲结合。本课题组成功构建了核转录因子Egr-1和Spl真核表达载体。利用转基因技术,过表达Egr-1能增强NGX6基因启动子活性并上调NGX6基因的内源性mRNA表达；而封闭内源性Egr-1的表达则抑制了NGX6基因内源性mRNA的表达水平。此外,Erk1/2激酶的抑制剂PD98059可以明显下调结肠癌细胞中Egr-1和NGX6表达水平,EMSA实验证实PD98059可能通过降低细胞核内Egr-1蛋白与DNA的结合活性,进而抑制了NGX6基因的表达。这些结果说明,核转录因子Egr-1是正性调控NGX6基因的转录表达。过表达转录因子Spl能在结肠癌细胞中上调NGX6基因启动子活性；封闭内源性Spl的表达可以明显上调NGX6基因内源性mRNA的表达水平。这些结果说明核转录因子Spl也是正性调控NGX6基因的转录表达。[DNA甲基化抑制NGX6基因的表达,去甲基化能恢复其表达]在前期研究中,利用CpGplot和CpGFinder程序在线扫描NGX6的转录调控区,发现NGX6的启动子区-107/+310存在一个CpG岛。Refgene数据库中也搜索到在NGX6基因的转录调控区存在CG频率较高的区域。利用Methylator软件(http://bio.dfci.harvard.edu/Methylator/)对NGX6启动子区进行了预测分析。分析结果显示在NGX6基因的启动子区域存在多个甲基化位点,提示NGX6基因启动子区的这一CpG岛可能是其启动子活性调节的重要调控元件。利用NGX6基因启动子区特异性甲基化和非甲基化引物进行了甲基化特异性聚合酶链反应,发现NGX6启动子在叁株结肠癌细胞系中都呈部分甲基化状态。进一步在结直肠癌组织水平上进行了检测,结果显示NGX6启动子在40例结直肠癌组织中的甲基化水平明显高于40例正常结直肠组织(P<0.05)。将结直肠癌组织中NGX6基因启动子的甲基化状态与结直肠癌临床病例特征进行相关性分析,发现在结直肠癌组织中,NGX6基因启动子甲基化频率与患者的年龄相关(P<0.05)；NGX6基因启动子甲基化频率与结直肠转移具有相关性趋势(P=0.056)；而与患者的性别、Duke's分期、肿瘤部位无明显相关(P>0.05)。亚硫酸盐修饰后测序法的结果表明NGX6基因启动子-233/+150存在多个甲基化位点,其中涉及-54/-39的Spl与Egr-1重迭结合位点,两个位于-17/+5的Spl结合位点。利用SssI甲基转移酶能将腺苷甲硫氨酸中的甲基转移至基因组DNA的CpG位点的非甲基化胞嘧啶“C”上,使原本未甲基化的“C”发生甲基化的特点,选择性地处理了对NGX6基因启动子活性调节起重要作用的Sp1/Egr-1重迭结合位点-54/-39的生物素标记的双链寡核苷酸探针,并进行了凝胶电泳迁移率实验。发现在Spl/Egr-1重迭结合位点DNA甲基化完全抑制了Egr-1核蛋白与DNA的结合,部分抑制了Spl核蛋白与DNA的结合。同样,将NGX6基因启动子荧光素酶报告质粒pGL3-159/+100和绿色荧光蛋白报告质粒pGL3-159/+100/GFP经SssI甲基转移酶处理后,发现他们在结肠癌细胞中丧失了启动子活性。2.5μM的甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷能够逆转NGX6基因启动子在HT-29细胞的甲基化状态,并上调NGX6基因mRNA表达水平。总之,通过本课题研究,我们获得了NGX6基因启动子的精细位置,较系统地阐述了NGX6启动子顺式作用元件和反式作用因子的组成和功能,探索了DNA甲基化对NGX6基因启动子活性、mRNA表达水平的影响及分子机制,并发现NGX6基因启动子区DNA甲基化参与NGX6基因在结直肠组织的转录调控,且NGX6基因启动子区高甲基化状态可能成为结直肠癌的一个潜在分子靶标。这些研究结果将有助于全面了解NGX6基因的生物学功能,明确NGX6基因在结肠癌侵袭、转移中的作用机制,为其潜在的临床应用提供科学的理论和实验依据。
参考文献：
[1]. NGX6基因对结肠癌细胞的作用及机制研究[D]. 王晓艳. 中南大学. 2003
[2]. NGX6抑制结肠癌细胞HT-29侵袭转移的分子机制研究[C]. 郭勤, 廖曼甜, 连平, 王晓艳, 沈守荣. 第九届国际治疗内镜和消化疾病学术会议论文汇编. 2008
[3]. NGX6基因对结肠癌血管形成及凋亡影响的研究[D]. 连平. 中南大学. 2010
[4]. NGX6基因对人结肠癌细胞HT-29细胞周期的影响[J]. 王晓艳, 沈守荣, 刘芬, 李晓玲, 范松青. 生物化学与生物物理进展. 2006
[5]. 抑瘤基因NGX6对结肠癌细胞蛋白质表达谱的影响[D]. 李予. 中南大学. 2009
[6]. NGX6基因联用5-Fu对人结肠癌细胞凋亡的影响[J]. 连平, 郭勤, 彭娅, 肖志明, 刘芬. 中国肿瘤临床. 2009
[7]. 抑瘤基因NGX6对结肠癌血管形成的影响[J]. 连平, 郭勤, 彭娅, 肖志明, 刘芬. 世界华人消化杂志. 2009
[8]. 抑瘤基因NGX6对人结肠癌细胞凋亡的影响[J]. 连平, 郭勤, 彭娅, 肖志明, 刘芬. 生物化学与生物物理进展. 2008
[9]. NGX6基因在Wnt/Beta-catenin信号传导通路中的作用机制研究[D]. 刘芬. 中南大学. 2007
[10]. 抑瘤基因NGX6的转录调控研究[D]. 刘敏姬. 中南大学. 2011
标签：肿瘤学论文; 细胞周期论文; 细胞系论文; wnt信号通路论文; 结肠癌论文; 细胞转染论文; wnt途径论文; 基因合成论文; 肿瘤论文;