李福兵[1]2005年在《睾丸内注射精子载体法介导基因转移实验研究》文中提出精子载体法介导基因转移是以精子为载体,在受精时将外源目的基因导入卵母细胞,制备转基因动物的简单而高效的方法之一。该方法不仅操作方便,不需要昂贵的仪器设备,而且对操作人员的技术要求也不高。目前研究者主要采用将精子与外源DNA简单共孵育即体外精子载体法进行转基因方法和转基因动物的制备的研究。由于精浆等多种因素的影响以及处理方式的不同,采用该法得到的转基因阳性率不稳定,不同实验室得到的结果差异很大,甚至矛盾。睾丸内注射外源DNA进行基因转移的方法(体内精子载体法)可以有效的避开精浆作用,同时避免了精子由于复杂处理而造成的损伤,对保证精子的受精能力和受精后的胚胎发育有十分重要的作用。山羊是进行乳腺生物反应器的首选动物,但是山羊进行睾丸注射转基因的研究国外还没有报道,更没有建立稳定、有效的睾丸内注射精子载体法介导基因转移的转染体系。该研究可以丰富精子载体法基因转移的内容,对其他动物应用该方法进行转基因研究可以提供有价值的参考。本实验针对可能影响睾丸内注射精子载体法介导基因转移中的主要因素,探讨不同注射部位、不同DNA注射剂量,注射后不同作用时间对转染后精子阳性率的影响,并且用转染的山羊精子制备转基因胚胎,研究睾丸内注射精子载体法的可行性以及建立优化睾丸内注射技术体系。本实验将地高辛标记的pEGFP-N1质粒DNA分别进行输精管注射和睾丸组织多点注射,于注射后20、30、40天采集精液,提取精子基因组DNA,PCR和Southern杂交检测基因在精子中的整合,原位杂交方法检查精子转染外源基因的阳性率。然后分别将3、4、5,6 ml质粒DNA用睾丸组织多点注射方法处理4头川东白山羊,注射后20、30、40,50天进行精子原位杂交和表达GFP的荧光检测,利用睾丸内注射后40天的4头山羊精液,体外获能后,分别与20枚体外成熟培养的卵母细胞行体外受精,检测胚胎荧光表达。注射后50、60、90,120天检测GFP在左侧长轴中部睾丸组织的表达。结果PCR和Southern杂交检测为阳性,表明外源基因整合到精子基因组上;睾丸内多点注射优于输精管注射;睾丸内多点注射后40天的精液行体外受精实验结果分别有1、3、12、6枚胚胎表达GFP,PCR检测荧光胚胎为阳性胚胎;将5 ml
叶华虎[2]2003年在《山羊精子介导基因转移的实验研究》文中指出精子介导基因转移（Sperm-mediated gene transfer, SMGT）是以精子为载体，在受精时将外源目的基因导入卵母细胞，是目前转基因动物研究中简单而高效的方法学之一。SMGT的核心是高效、稳定的体外受精技术和精子转染技术，前者不仅有利于获得大量的胚胎来源，而且还对胚胎质量以及胚胎移植后的胎儿发育和动物个体获得有重要影响，后者是提高转基因动物成功率的关键和保证。由于国内外目前在山羊体外受精和精子转染方面的研究尚不成熟，影响了我们即将开展的以精子介导方法为基础的转基因山羊乳腺生物反应器课题进程。为此，本实验对山羊体外受精技术和精子转染技术展开研究，以建立SMGT技术平台，为转基因山羊乳腺生物反应器的研制奠定基础。本研究共分为5部分，第一、二、叁部分分别就体外受精技术中的3个关键环节：卵母细胞成熟、精子获能和受精、早期胚胎体外培养进行研究，探讨体外受精影响因素，优化培养系统，建立稳定的体外胚胎生产体系。第四部分对精子供体选择、外源DNA转染精子的影响因素、精子内化转运机制以及转染方法的优化组合进行探讨，建立山羊精子高效转染方法。第五部分利用已建立的体外受精技术和精子转染技术，生产转基因胚胎，探讨精子介导基因转移的可行性、效率及稳定性。第一部分的卵母细胞成熟实验中，首先利用Hoechst33342染色检查了山羊卵巢卵泡发育特征，发现70%以上的直径>2mm卵泡卵母细胞处于GVⅡ~GVBD期，根据Hyttle的卵母细胞发育理论，这些卵已完成“获能”，是体外成熟的首选卵源；而直径<2mm卵泡卵母细胞主要处于GVⅠ期（70.8~73.1%），“获能” 过程尚未完成，体外成熟和继续发育能力有限，培养价值不高。本实验选择直径>2mm卵泡卵母细胞为卵源，比较在不同培养液中的成熟发育率，以优化成熟培养系统。发现M199+10% EGS (estrous goat serum , EGS)+ 10% GFF (goat follicles fluid, GFF)+ 15 IU/ml FSH (follicle stimulating hormone, FSH) + 30 IU/ml LH (luteinizing hormone , LH) + 1μg/ml E2 (17-β estradiol , E2)培养液中的成熟率和卵裂率最高，分别为73.1%和38%，显着高于其他培养系统；超微结构进一步证实，在该培养液中成熟的卵母细胞，结构与自然成熟卵基本一致。表明该系统不仅提高成熟率，而且促进胞质充分成熟。第二部分的精子获能实验中，主要研究了不同钙离子载体（calcium ionophre A23187,IA）浓度对精子顶体反应率和精子存活时间的影响，实验设置了0.2、0.5、0.8、<WP=10>1.1μmol/L 4个实验组，其中0.2μmol/L处理组的精子寿命最长，达到13 h左右，顶体反应发生率高（超过60%）；受精实验结果表明，0.2μmol/L IA作用8min处理的获能精子，受精率（68.6%）和卵裂率（40%），均显着高于传统的肝素获能处理组（分别为57.8%和24.3%），超微结构进一步证实，IA处理后的精子培养5 h，67.5%的获能精子已完成顶体反应，具有正常受精能力。IA获能系统的建立，避免了肝素对精子结合外源DNA的干扰，为精子高转染方法的建立奠定了基础。第叁部分的早期胚胎培养实验中，探讨了简单培养基mSOF（modified synthesis oviduct fluid, mSOF）和组织培养基M199、共培养系统以及卵裂发生时间对胚胎发育的影响。结果表明，mSOF提高卵裂率和8-cell胚胎发育率，而M199能有效支持8-cell以后的胚胎发育，共培养系统是克服胚胎体外发育阻断的有效方法。因此，本实验建立了分阶段共培养体系：即在受精后1~3天以mSOF+BSA（bovine serum albumin, BSA）+CC（cumulus cell monolayer，CC）为培养基，4~7天更换为M199+EGS+CC。在该系统培养的受精卵，2-cell、8-cell和桑胚率分别为46.5%、55.8%和40.8%；早期卵裂胚（受精后30 h内）在该培养系统中的桑胚率高达47.5%，提示分阶段共培养方法是提高山羊早期胚胎体外发育的良好体系。根据以上实验结果，我们建立了如下山羊体外受精技术体系：选择直径>2mm卵泡卵母细胞，在M199+10% EGS + 10% GFF + 15 IU/ml FSH + 30 IU/ml LH + 1μg/ml E2中培养27 h，与0.2μmol/L IA作用8min处理的获能精子共孵育12~14 h，受精卵1~3天培养于mSOF+BSA+CC，4~7天更换培养液为M199+EGS+CC。该系统具有稳定、高效等特点，卵母细胞成熟率超过70%，卵裂率为38.7%~46.3%，桑胚率40.8%~47.3%，卵裂率和桑胚率高于国内同类报道。第四部分的精子转染实验中，我们利用DIG末端标记技术和免疫组化技术研究精子转染效率。预实验发现，4只种公羊精子转染阳性率有明显差异，其中1号最低，2号最高，3、4号居中。因此，实验重点对1号和2号进行了研究，结果表明，山羊精子具有自发结合外源DNA能力，结合部位集中在精子头部核后帽区，结合的外源DNA首先“挂”在膜表面，继而被内化转运到细胞内，但并非所有的结合DNA都被内化。死精子特别是质膜破裂的死亡精子对外源DNA的结合能力显着高于质膜完整的精子（79.4%~81.1% vs 54.8%~58.6%），但死精子不能完成外源DNA的内化转运过程，DNaseⅠ消化后的阳性率低于1%。活精子的转染效率受多重因素影响，其中精浆、动物个体和精子质膜是最重要的叁大因素。精浆主要抑制结合，同时也影响内化转
范景胜[3]2009年在《山羊CD4基因外显子6多态性与精子内化外源DNA能力的相关性研究》文中提出哺乳动物精子具有自发结合内化外源DNA的能力。精子介导基因转移是转基因效率较高的技术方法之一,但同时存在着极大的随机性和不确定性。DNA的内化转运受到精子质膜分子的严格调控,仅有少量结合的DNA能被内化转运到精子细胞核,极大的降低了精子介导基因转移效率。研究发现精子供体对精子载体法制备转基因动物有显着影响,不同品种的动物精子结合内化外源DNA能力存在显着差异。本研究以精子质膜上的转运系统之一CD4分子为研究对象,通过PCR-SSCP技术分析山羊CD4基因,并与精子内化外源DNA能力进行相关性分析。(1)选取了体况、精液品质相近的南江黄羊、波尔山羊和波尔山羊×川东白山羊杂交一代羊(简称波川F_1)3个品种的种公羊17只,假阴道法采集精液,离心去除精清,与地高辛标记的线性pEGFP-N_1质粒共孵育,免疫组化法检测转染效率;(2)通过PCR-SSCP技术分析了南江黄羊、川东白山羊、波尔山羊和波川F_1代山羊4个品种共97个个体的CD4基因外显子6序列的单核苷酸多态性;(3)对南江黄羊、波尔山羊和波川F_1代山羊3个品种的种公羊CD4基因外显子6多态性与其精子内化转运外源DNA的能力进行相关性分析。主要研究结果如下:1.不同山羊品种的精子内化外源DNA的能力不同。在3个品种中,南江黄羊精子内化外源DNA的能力较高,为(35.994±1.71)%,其次是波川F_1代山羊,为(32.06±3.21)%,波尔山羊最低,为(21.54±2.31)%,南江黄羊、波川F_1代山羊的内化转染效率极显着高于波尔山羊(P＜0.01)。2.在选取的4个山羊品种中,发现CD4基因外显子6存在1个SNP位点。山羊CD4基因cDNA编码区700 bp处存在G/A突变,引起了234位氨基酸发生G/R突变。南江黄羊、川东白山羊检测到AA、AB和BB型3种基因型,波尔山羊和波川F_1代检测到AA和AB型2种基因型。4个山羊品种的PIC、He、Ne从大到小排列是南江黄羊,川东白山羊,最后是波尔山羊和波川F_1代羊。3.山羊CD4基因外显子6的SNP位点与精子内化外源DNA能力存在相关性。在所检测样本中,BB型山羊精子内化外源DNA效率最高(35.26±0.43)%,AA型和AB型山羊精子内化效率分别为(27.83±2.29)%和(29.37±3.28)%。BB型内化效率显着高于AA型和AB型内化效率(0.01≤P≤0.05),表明山羊CD4基因外显子6的SNP位点可能是影响精子内化外源DNA能力的因素之一,其B型等位基因可能是精子内化外源DNA能力的分子标记之一。
崔凯[4]2011年在《精子载体法制备FecB转基因太行山羊技术的研究》文中进行了进一步梳理精子介导的基因转移是指以精子作为外源基因的载体,在受精时将外源基因导入卵母细胞,使受精卵中含有外源基因,是目前转基因动物研究中简单而高效的方法之一。脂质体可用于转基因的研究,利用脂质体可以和细胞膜融合的特点,将外源基因送入细胞内部。本实验利用脂质体介导精子转染的方法,研究了精子在介导基因转移过程中精子与外源基因结合的影响因素,并对精子载体法制备FecB转基因太行山羊进行了初步研究。试验结果如下:1.精子充分离心洗涤后,再与脂质体-DNA复合物混合,可显着提高脂质体介导精子转染外源DNA的效率。DNaseI消化前,洗涤组转染精子阳性率为38%,而未处理精液组精子阳性率为14%;DNaseI消化后,洗涤组转染精子阳性率为21%,而未处理精液组精子阳性率为5%,差异极显着(P <0.01)。2.脂质体介导法可使外源DNA透过细胞膜内化进入精子胞质或胞核内,精子转染外源DNA用DNaseI消化后能检测到精子中外源DNA的存在。太行山羊精子与外源DNA混合培养后,用荧光原位杂交检测到18.3%的精子结合有外源DNA,脂质体Lipofectamine2000介导后比率增加至38.7%,两法的统计学分析存在显着性差异(P<0.01)。3.利用共培养法转染外源DNA,用DNaseI消化后,能检测到精子中外源DNA的存在,山羊精子具有自发的结合外源DNA的能力。4.对18只太行山羊母羊进行诱导发情处理,精子与FecB基因共孵育后,对发情母羊进行输精,受孕率为51%,共产生后代12只,经过PCR检测,未发现阳性后代。
赵永聚[5]2005年在《精子因素对精子载体法制备转基因山羊影响的研究》文中指出精子具有主动结合、转运、整合外源DNA的能力,并在受精时导入卵母细胞,获得转基因动物。精子介导基因转移(Sperm-mediated gene transfer, SMGT)是目前获得转基因动物简单而高效的方法之一。精子与外源DNA的整合是受到严格调控的一种现象,SMGT方法存在着极大的随机性和不确定性。SMGT方法主要是由外源DNA、精子、转染方法等构成的一个有机整体。但目前研究集中在外源DNA因素,如DNA浓度、片段大小、序列、结构、载体类型等对SMGT方法的影响。SMGT方法离不开精子。精液来源、精液品质、精浆、精子质膜和精液处理方法等构成了SMGT方法的精子因素。但这些精子因素对SMGT方法的影响如何,目前研究还不系统。从这些精子因素出发,筛选精子供体、优化精液处理方法,对提高精子转染外源DNA效率,建立稳定、高效的SMGT方法,提高生产转基因动物效率,也是十分重要的。本文从精子因素出发,研究其对精子载体法生产转基因动物效率的影响,共分为3部分。第一部分研究不同品种、不同年龄山羊的精子转染外源DNA的效率,筛选转染效率高的品种和精子供体。第二部分研究精液冷冻处理对山羊精子转染内化外源DNA效率的影响,并建立一种保证精液品质和稳定、高效的SMGT方法;第叁部分用筛选的精子供体和优化的转染处理方法,将转入外源基因的精子进行人工授精生产转基因山羊,研究精子因素对生产转基因动物效率及对SMGT方法稳定性的影响。在第一部分实验中,比较不同品种、不同年龄山羊的精子转染外源DNA的效率,筛选转染效率高的品种和精子供体。选择2岁川东白山羊、波南F1山羊、波尔山羊和南江黄羊公羊共55只,1~4岁川东白山羊和波南F_1山羊共137只,采集公羊精液,分析精液品质,用通过正交试验设计L_(16)(44)建立的山羊精子和外源DNA处理方法转染,地高锌标记的原位杂交(in situ hybridization)检测方法,比较这些山羊的精子转染效率。结果表明:不同品种、年龄山羊的精子转染外源DNA的效率不同,其中1岁的川东白山羊转染效率最高。首先,不同品种山羊的精子转染内化外源DNA效率不同。其中转染效率较高的是川东白山羊和南江黄羊,最低的是波尔山羊,中等的是波南F1山羊。2岁南江黄羊和川东白山羊的精子转染效率分别为(38.48±17.54)%和(34.62±20.76)%,差异不显着(P>0.05);波尔山羊的为(13.85±8.50)%,与南江黄羊和川东白山羊相比差异极显着(P<0.01)。同样,不同年龄山羊的精子转染内化外源DNA效率不同。川东白山羊精子结合外源DNA的能力随着年龄的增大而有减少的趋势。川
叶华虎[6]2005年在《利用精子载体方法研制人组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因羊乳腺生物反应器》文中提出利用转基因动物乳腺生产医药用蛋白,具有产量高和生产成本低等明显优势,前景普遍看好,但动物乳腺生物反应器的获得有赖于可靠的转基因动物生产制备技术作保证。 精子介导基因转移(Sperm-mediated gene transfer,SMGT)被认为是目前操作最简单的转基因动物生产技术,但该方法的重复性差、实验结果不稳定,因此也是一种不成熟的技术体系。基于SMGT的不成熟性,本实验将对SMGT的几个关键环节进行研究,以期建立稳定、高效的SMGT技术平台,同时利用该技术平台研制人组织型纤溶酶原激活剂突变体(variant form of human tissue-type plasminogen activator,mt-PA)转基因羊乳腺生物反应器,为安全高效的溶栓药物mt-PA规模化生产奠定基础。实验结果如下: 1)山羊精子可自发性结合外源DNA,精子对外源DNA的结合和内化能力在不同个体间差异显着(P<0.01)。对于同一供体的精子而言,阻止DNA结合的最主要因素是精浆,离心洗涤后,结合率和内化率可提高数倍。 2)死精子同样能结合外源DNA,但不能将其内化,反复冻融导致质膜破裂的死精子具有更高的结合率,而且与动物个体无关。 3)精浆既可能与DNA形成复合物,改变DNA的物理性质,又可能对游离DNA产生降解,精浆的作用效应呈浓度和时间依赖性;EGTA对精浆的复合效应和降解效应有明显的抑制作用。 4)内化进入精细胞中的外源DNA大部分将被降解,EGTA/ATA能有效保护内化DNA的完整性而不影响精子的其他生物学特性。 5)转染精子用于体外受精,报告基因GFP可被精子介导进入卵母细胞,并在早期胚胎中表达,胚胎阳性率和GFP表达率与精子结合外源DNA的能力相关。 6)精子与山羊乳腺特异性表达pBGC-mtPA线性化质粒DNA共同孵育后,人工受精得到129只羔羊,其中24只PCR阳性(阳性率18.6%),15只Southern blot阳性(阳性率11.6%,15/129)。但转染精子受精能力下降,畸形羔羊增多,生产的转基因羊部分可能是嵌合体或者是部分片段整合。
李兰[7]2007年在《人lactoferrin转基因动物生物反应器模型的研究》文中认为利用转基因动物乳腺生物反应器生产重组蛋白是当今生物技术研究的热点之一。然而，在转基因动物出生之前，重组蛋白能否在转基因动物乳腺细胞中有效表达还很难确认。鉴于此，本研究的目的在于建立了一种简单而有效的转基因方法，用于评估外源蛋白在转基因动物乳腺组织中的特异表达并利用可以有效表达外源基因的转基因载体对山羊体细胞进行体外转染，获得转基因体细胞后进行核移植以期获得转基因克隆胚胎。本研究克隆了人乳铁蛋白基因(lactoferrin，LF)cDNA，利用山羊β-casein基因5’端调控序列来指导人乳铁蛋白基因的乳腺组织特异性表达，从而构建了转基因表达载体pGBC2LF。利用绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为标记基因，借助家兔精子与EGFP基因的共转染和体外受精技术，研究了家兔精子结合与转运外源基因的能力，利用转基因阳性胚胎比例系统地比较了外源DNA浓度、DMSO浓度、线性化和环化DNA的比例等对家兔精子介导基因转移效率的影响。利用DMSO-精子介导基因转移技术(DMSO-SMGT)获得89只LF转基因家兔，其中46只为阳性(51.7％)，21只转基因雌性家兔中有17只(81％)在乳腺组织中能特异表达人乳铁蛋白。这一实验表明，利用DMSO-SMGT技术能够生产转基因家兔，并且人乳铁蛋白能够在家兔乳腺组织中特异表达。将含有人lactoferrin基因和neo基因的乳腺表达载体pGBC2LF线性化后，利用脂质体介导外源基因体外转染了奶山羊胎儿成纤维细胞，经过G418药物抗性筛选后获得了稳定整合人lactoferrin基因的转基因体细胞克隆17个，其中PCR和Southern Blot检测阳性的转基因细胞克隆14个，阳性率82.4％。以LF3和LF20两株转基因体细胞克隆细胞为供体细胞，以超数排卵获得的卵母细胞或屠宰山羊来源的体外成熟的卵母细胞作受体细胞进行了核移植，获得了能够体外早期发育的山羊转基因克隆胚胎。不同转基因细胞系之间的核移植效率差异不显着；而体内成熟卵母细胞作受体的核移植囊胚率为64.8％，体外成熟卵母细胞作受体的核移植囊胚率为51.7％，差异显着(p＜0.05)。该研究证明了山羊转基因体细胞能够支持克隆胚胎的早期发育。
郑月茂[8]2005年在《转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育》文中研究说明本研究通过PCR 法克隆了2 248 bp 的山羊β-乳球蛋白基因5′端调控序列,以之作为启动子指导人乳铁蛋白基因在山羊乳腺上皮细胞中特异性表达,以验证表达载体构建的合理性和外源基因的表达效率。利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因cDNA 的重组质粒pBLIG,并导入到山羊乳腺上皮细胞,经G418 及PCR 筛选获得阳性细胞,以之作为供体细胞利用核移植技术构建转基因克隆胚。应用PCR 法检测转基因克隆胚中的外源基因,并与荧光观察进行对照,从而实现在转基因克隆胚早期发育过程中对外源基因的检测,为进一步对荧光阳性胚胎进行移植,以期得到转基因动物个体奠定基础。研究结果如下:1. 山羊乳腺上皮细胞传至第15 代时其生长仍正常。山羊乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状,称之为乳球体;大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大;出现部分长形细胞。第15 代细胞表面微绒毛极为发达,细胞质中线粒体和粗面内质网丰富并含有大量脂滴,表明细胞增殖活力旺盛。染色体分析表明,山羊乳腺上皮细胞系稳定,在离体培养条件下细胞未发生转化。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对山羊乳腺上皮细胞培养上清液中的蛋白质进行分离,发现山羊乳腺上皮细胞上清液有3 个条带与标准酪蛋白的3 个条带一致,表明本研究培养的上皮细胞为山羊乳腺上皮细胞,在体外培养条件下能表达山羊酪蛋白。2. 利用PCR 法克隆了山羊β-乳球蛋白基因5′调控序列(2 248 bp),其中包括第一外显子及第一内含子。PCR 产物回收纯化后,克隆在pMD 18-T Vector 的T 位点。质粒标记为pBLG。序列分析表明,该序列与发表的山羊序列同源性达99.70 %。计算机分析表明,此调控序列含有多个调节因子结合位点或反应元件,包括STAT5(MGF)信号转导子和转录激活子5(乳腺因子)结合位点、CCAAT/增强子结合蛋白结合位点、SP1 因子结合位点、Milk box“乳盒”、TBF 因子结合位点、视黄酸反应元件(RARE)、乳腺特异性因子(MSBF)和核因子1(NF1)结合位点等,这提示此调控序列可调控外源基因在乳腺上皮细胞中高效表达,可用于构建乳腺特异性表达载体。3. 将质粒pBLG 和表达载体pEGFP-c1 用AseI 和NheI 双酶切,回收目的片断,T4DNA
沈彦花[9]2016年在《山羊CD320和RanBP9分子遗传分析及功能鉴定》文中研究表明精子介导转基因(Sperm-mediated gene transfer,SMGT)技术是生产转基因动物的有效途径,具有简单、高效等特点。精子具有自动结合、转运、整合外源DNA的能力,并在受精时导入卵母细胞,获得转基因动物。但是SMGT在哺乳动物上存在着极大的随机性和不确定性,转运机制尚不清楚,限制了该方法的广泛应用。精子介导转基因过程中需要多种分子的相互作用,研究报道CD4分子是参与精子介导的重要分子之一。早期研究已利用酵母双杂交技术,筛选出与CD4相互作用的候选分子CD320和RanBP9,免疫共沉淀验证了CD320和RanBP9与CD4分子之间在真核细胞中存在相互作用;且克隆了山羊CD320和RanBP9基因序列,并分析其在山羊各个组织中的相对表达量。但是,CD320和RanBP9的遗传多态性及在精子转染外源DNA中的功能尚不清楚。因此,本研究在已有实验基础上,研究了CD320和RanBP9分子的遗传多态性,在山羊睾丸、附睾组织中的表达以及在精子转染外源DNA中的作用,为研究精子介导转基因机制奠定基础,提供数据支持。主要研究方法及结果如下:1、利用PCR-SSCP技术研究了CD320基因外显子3和3’非编码区在3个山羊品种(大足黑山羊,n=40;合川白山羊,n=44;济宁青山羊,n=33)中的多态性。在选取的3个山羊品种中,CD320基因外显子3没有检测到SNPs位点,3’非编码区检测到了SNPs位点,但是,多态性位点都是位于非编码区,没有引起氨基酸的改变。3个山羊品种均只检测到AA型和AB型2种基因型。3个山羊品种的PIC、He、Ne从小到大的排列顺序是合川白山羊、大足黑山羊和济宁青山羊。2、荧光定量PCR研究CD320在山羊睾丸、附睾头、附睾体和附睾尾中的相对表达量。结果表明,CD320基因相对表达量在附睾尾中最高,与其他组织相比差异极显着(P<0.01)。免疫荧光结果表明:CD320蛋白在附睾体和附睾尾中表达量较高,主要集中在附睾小管上皮柱状细胞中表达;另外,CD320蛋白主要在精子的顶体帽处有表达,精子的其他部位不表达。3、精子转染外源DNA实验中,实验组精子与CD320抗体共孵育,阳性精子转染率为9.79%,对照组阳性精子转染率为16.08%,说明CD320抗体封闭CD320之后,精子转染外源DNA的效率显着降低。4、利用PCR-SSCP技术研究了RanBP9基因外显子11和3’非编码区在3个山羊品种(大足黑山羊,n=40,合川白山羊,n=44,济宁青山羊,n=33)中的多态性。结果表明:Ran BP9基因在这3个山羊品种中没有检测到SNPs位点。5、荧光定量PCR研究RanBP9基因在山羊睾丸、附睾头、附睾体和附睾尾中的相对表达量。结果表明,RanBP9基因在附睾体中的相对表达量最高,与其他组织相比差异极显着(P<0.01)。免疫荧光结果显示,RanBP9蛋白在附睾体和附睾尾的上皮柱状细胞中表达量较高,而且,RanBP9蛋白在精子头部除赤道节部位外都有表达,在精子尾部主段也有表达。6、精子转染外源DNA的实验组中,精子与RanBP9抗体共孵育,阳性精子转染率为9.40%,对照组阳性精子转染率为16.08%,抗体封闭RanBP9之后,精子转染外源DNA的效率明显降低。
赵永聚[10]2009年在《精子因素对精子载体法制备转基因山羊的影响》文中研究指明精子具有主动结合、转运、整合外源DNA的能力,并在受精时导入卵母细胞,获得转基因动物。精子介导基因转移(sperm-mediated gene transfer,SMGT)是目前获得转基因动物简单而高效的方法之一。精子因素是影响SMGT方法生产转基因动物的重要方面。本论文结合我们的研究针对转染用山羊(Caprahircus)精液的来源、精子质膜完整性、精液品质及发育阶段等精子因素影响精子结合外源DNA和SMGT方法生产转基因山羊的效率进行了论述,并从这些影响因素入手,提出了筛选精子供体、保持精液品质、调控质膜等措施,提高精子转染外源DNA能力和生产转基因动物的效率。
参考文献：
[1]. 睾丸内注射精子载体法介导基因转移实验研究[D]. 李福兵. 第叁军医大学. 2005
[2]. 山羊精子介导基因转移的实验研究[D]. 叶华虎. 第叁军医大学. 2003
[3]. 山羊CD4基因外显子6多态性与精子内化外源DNA能力的相关性研究[D]. 范景胜. 西南大学. 2009
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