邵晓云[1]2004年在《水牛胎儿成纤维细胞体外培养及相关问题的研究》文中进行了进一步梳理1．本实验探讨了适合水牛胎儿成纤维细胞(BFF)体外培养的体系。组织块法培养的水牛胎儿原代成纤维细胞生长状态良好，增殖旺盛；细胞经4℃预冷的胰蛋白酶室温下消化，可传代培养至32代；细胞冷冻保存解冻后复苏率达70％～80％；染色体分析结果显示，二倍体细胞所占比例始终保持在80％～90％之间，各代细胞(5th、10th、15th)之间差异不显着(p＞0.05)；巢式PCR法支原体污染检测结果发现，第9、18、28代细胞呈阴性，第32代细胞呈阳性。结果表明，该培养体系比较适合水牛胎儿成纤维细胞的培养；培养至15代的BFF细胞核型相对比较稳定；培养至28代的BFF未受支原体感染。 2．探讨胰岛素和条件培养液对低密度水牛胎儿成纤维细胞增殖的影响。结果显示，添加胰岛素(2IU／mL)的培养液组细胞的平均增殖指数显着高于条件液组和对照组(3.49±0.07 vs 1.47±0.29，2.97±0.17；p＜0.05)，而条件培养液组细胞的平均增殖指数不及对照组，呈显着差异(1.47±0.29 vs 2.97±0.17；p＜0.05)。同时，细胞增殖指数随细胞密度的逐渐增大而呈上升趋势，其中8个／滴(50 μl)细胞的平均增殖指数显着高于1个／滴和2个／滴细胞(3.11±0.46 vs 2.09±0.83，2.48±0.61；p＜0.05)。由此表明，适宜浓度的胰岛素对水牛胎儿成纤维细胞的增殖具有促进作用；单个细胞在体外能培养增殖，但其增殖速度低于群体培养。 3．探讨不同的处理方法和处理时间对水牛胎儿成纤维细胞周期的影响。流式细胞仪周期时相分析结果显示，血清直接饥饿处理或梯度饥饿处理后其G_0／G_1期成纤维细胞的比例均显着高于一般培养组(88.40±0.75％，87.00±0.78％ vs 84.09±1.16％；p＜0.05)，但血清直接饥饿组和梯度饥饿组之间无显着差异(p＞0.05)。用血清直接饥饿法处理水牛胎儿成纤维细胞3d时的G_0／G_1期细胞比例显着高于0d、1d、2d、6d的细胞比例(p＜0.05)，但3d、4d、5d的G_0／G_1期细胞比例之间差异不显着(p＞0.05)。结果表明，血清直接饥饿和梯度饥饿法均能有效地使水牛胎儿成纤维细胞同步于G_0／G_1期；血清直接饥饿处理细胞3d可取得较好的细胞周期同步化效果。
罗军[2]2012年在《水牛胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特性的研究》文中研究指明水牛是中国南方地区较为重要的一种家养动物,在农业耕作上一直将其作为劳力使用。近些年来随着对水牛研究的不断深入,其经济利用价值逐渐显现出来,特别是将其作为生物反应器生产目的蛋白。目前尚未建立生物学特性明确的水牛细胞系,限制了在细胞水平研究和长期保存水牛种质资源,也妨碍了通过将稳定表达外源基因的细胞作为核移植供体,获得基因改造水牛的研究。因此,建立水牛细胞系并对其进行生物学特性的研究非常重要。从南宁市内屠宰场获取88只水牛胎儿,对其耳缘、肾脏、皮肤进行原代培养,从分离获得的成纤维细胞中挑选出形态正常、生长动力学较好的细胞系,最后挑选出2个水牛胎儿皮肤成纤维细胞系(BFSF101107、 BFSF101007)、1个水牛胎儿耳缘成纤维细胞系(BFEF)、1个水牛胎儿肾脏成纤维细胞系(BFKF)、1个水牛胎儿肾脏扁平状成纤维细胞系(BFKF-Flat)。然后对这些细胞系分别进行生长动力学测定、冻存前/复苏后活率测定、微生物污染检测、核型分析、同工酶检测、荧光蛋白转染效率、细胞周期分析。这5个细胞系生长动力学测定结果所绘制的生长曲线都为“S“型；细胞冻存前、复苏后都具有较高的活率；微生物污染检测的结果均为阴性。对这些细胞系进行核型分析和同工酶分析检测是否存在细胞交叉污染,结果显示这些细胞绝大多数含有48条染色体(20代),同工酶电泳图谱显示细胞系之间没有交叉污染。相同转染条件下,在绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白的表达效率上BFSF101107的最高,在表达强度上BFKF-Flat的最强。接着,对各细胞系第20代细胞进行细胞周期分析,结果BFSF101107与他细胞系相比,细胞之间染色体均一性好、畸变概率低。因此,基于细胞的后续研究可以依据这些细胞系的不同生物学特性进行相应的选择。在无抗生素条件下,成功建立了2个水牛胎儿皮肤成纤维细胞系(BFSF101107、BFSF101007)、1个水牛胎儿耳缘成纤维细胞系(BFEF)、1个水牛胎儿肾脏成纤维细胞系(BFKF)、1个水牛胎儿肾脏扁平状成纤维细胞系(BFKF-Flat),并成功将各细胞系传至第30代。从各细胞系检测指标上来看,皮肤来源的成纤维细胞要优于其他组织来源的,本研究的结果为其他大型动物成纤维细胞系的建立提供了参考。
黄奔[3]2007年在《水牛胚胎生殖样细胞分离培养及相关研究》文中研究指明1．从形态观察、碱性磷酸酶染色、表面抗原的免疫组化检测、多能性的标志基因表达和体外分化潜能等方面对水牛胚胎生殖样细胞(EG-likecells)的生物学特性进行了研究。结果发现，水牛EG样细胞形成多层结构的克隆，有明显的边界与饲养层分开，与小鼠的ES／EG克隆形态相似。通过组化染色发现，水牛EG样细胞表达AP、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4以及OCT-4。另外，RT-PCR结果显示，Fgf4除外，水牛EG样细胞均表达OCT-4、NANOG、SOX2、FOXD3、GP130、STAT3和HEB基因。将细胞延迟培养2个星期后，可以观察到成纤维样细胞，神经样细胞，肌样细胞和上皮样细胞的分化形成。悬浮培养的水牛EG样细胞可以形成简单拟胚体和复杂拟胚体(EB)，复杂拟胚体仍然表达FOXD3、GP130、STAT3以及HEB基因，但已经无法检测出OCT-4、NANOG和SOX2这叁个基因。此外，叁个胚层标志基因的表达也在复杂拟胚体检测出来，分别是内胚层KERATIN-14(Endoderm)，中胚层GATA4、ACTA2(Mesoderm)以及外胚层TUBB3(Ectoderm)，表明这些水牛EG样细胞可在体外分化形成叁个胚层。以上结果表明，水牛EG样细胞具有与人和小鼠ES／EG相似的生物学特性。2．探讨了水牛EG样细胞分离培养及传代的影响因素(性别、胎龄、分离方法、饲养层及细胞因子)。结果发现，雄性胎牛组的单位胎牛克隆数和克隆直径都显着高于雌性胎牛组(5.77±6.34 vs 1.03±2.64；227.76±83.84vs．102.34±40.59，P＜0.05)。80～90 dpc胎牛组的单位胎牛原代克隆形成数为1.60±2.63个，显着低于其他各组(P＜0.05)，其形成的克隆直径(190.63±65.11)，也显着低于除70～80 dpc组以外的其他各组(P＜0.05)，并且80～90 dpc组的最高传代数仅为3代，而其他各组都达到或超过了6代。对于单位胎牛原代克隆形成数和克隆直径，机械组都显着高于胰酶消化组(8.087±6.935 vs 1.765±4.747；216.95±77.41 vs140±38.76，P＜0.05)。BEF饲养层组的各代克隆形成数都显着高于其它各组(P＜0.05)，STO饲养层组的传代数仅为5代，而MEF(小鼠胎儿成纤维细胞)和BEF(水牛胎儿成纤维细胞)组为8代以上。在F_1代，添加20ng／mLLIF+20ng／mLbFGF+20ng／mLSCF或20ng／mL LIF+40ng／mL bFGF+40ng／mL SCF组的克隆形成数显着高于添加10ng／mLLIF+10ng／mL bFGF组和对照组；在F_2-F_8代，添加20ng／mLLIF组的克隆形成数显着高于添加10ng／mLLIF组。对照组的传代数仅为2代，添加10ng／mL LIF组为5代，而添加20ng／mLLIF组都为8代以上。以上结果表明，(1)胎牛的性别和胎龄以及分离方法对水牛EG样细胞的分离培养效果有显着影响，雄性胎牛优于雌性胎儿，小于80dpc的胎儿由于大于80dpc的胎儿，机械分离方法优于酶消化法；(2)BEF饲养层利于水牛EG样细胞的传代培养；LIF对水牛EG样细胞的传代培养有重要作用，而bFGF和SCF的作用不明显。3．对基因转染水牛胚胎生殖样细胞(EG-like cells)的影响因素及利用转GFP基因EG样细胞制备嵌合体囊胚的可行性探讨。结果发现，脂质体浓度为8μL／mL和12μL／mL的转染率显着高于2μL／mL和4μL／mL(33.6％，36.2％vs 13.3％，16.8％；P＜0.05)；质粒DNA 2μg／mL组的转染率显着高于质粒DNA 1μg／mL和4μg／mL组(28.8％vs 14.5％，15.2％；P＜0.05)；不同代数水牛EG样细胞(0、2、4、8)所获得的表达GFP基因克隆率之间差异不显着(19.8％vs 22.9％vs 25.8％vs 19.0％vs 16.9％；P＞0.05)；将转染GFP基因的阳性水牛EG样细胞注入到8-16细胞水牛胚胎后的囊胚发育率与注入转染GFP基因阳性水牛胎儿成纤维细胞(BEF)的囊胚发育率差异不显着(35.6％vs 33.3％；P＞0.05)，但EG样细胞组获得10个表达GFP的囊胚，而BEF组则没有获得表达GFP的囊胚。以上结果表明，0-8代的水牛EG样细胞均可用于GFP基因转染研究，适宜的脂质体量和质粒DNA浓度分别为8μL／mL和2μg／mL；水牛EG样细胞具有胚胎嵌合能力，而成纤维细胞则无此能力。4．对不同代数水牛EG样细胞以及转染GFP基因的EG样细胞的核移植效果进行了研究。结果发现，不同代数水牛EG样细胞(0、2、4、8)以及胎儿成纤维细胞核移植后的融合卯率、分裂率和囊胚率差异都不显着(82.0％vs 84.5％vs 80.1％vs 78.7％vs 84.0％，67.6％vs 72.9％vs 72.0％vs 62.9％vs 63.1％，11.4％vs 12.4％vs 13.4％vs 10.0％vs 7.1％；P＞0.05)；GFP阳性水牛EG样细胞与未转染的水牛EG样细胞核移植后的融合卵率、分裂率和囊胚率亦无显着差异(79.0％vs 81.0％，62.4％vs 71.4％，11.0％vs 13.3％；P＞0.05)。以上结果表明，O-8代的水牛EG样细胞均可用于核移植，且其核移植重构胚的发育能力不受GFP基因转染的影响。
杨素芳[4]2002年在《水牛卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植的研究》文中进行了进一步梳理1．系统探讨了放线菌酮(CHX)和细胞松弛素B(CB)对水牛卵母细胞孤雌激活的影响。IVM27～28h的水牛卵母细胞经7％酒精(EH)激活处理5min后，经7％酒精(EH)激活处理5min后，置入不同浓度的(0，0.625，1.25，2.5，5μg／ml)放线菌酮(CHX)培养10h，而后固定染色或在胚胎培养液(CM)中继续培养检查激活分裂率。结果培养在0.625和1.25μg／ml CHX的卵母细胞的激活分裂率和总原核形成率明显高于对照组(P＜0.05)，而培养在5μg／mlCHX的卵母细胞的激活分裂率和原核形成率则极显着低于对照组(P＜0.01)。如果在含有0.625μg／ml CHX中添加3μg／ml CB，可明显提高双原核的形成率(38.9％vs15.1％，P＜0.05)和桑椹胚／囊胚发育率(40.7％vs26.8％，P＜0.05)，但对其激活分裂率和总原核形成率无明显影响(P＞0.05)。结果表明，适当浓度的CHX能提高卵母细胞激活效果，适当浓度的CB可抑制卵母细胞第二极体的排出，提高孤雌激活后双原核的比例。 2．对水牛卵母细胞的激活方法进行了进一步的研究。IVM26h水牛卵母细胞经7％EH、钙离子载体(A23187)或离子霉素(Ion)激活处理5min后，在2mmol／L6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)中培养3～4h，然后再培养6～11d观察其胚胎发育情况。结果发现，5μmol／L Ion激活处理水牛卵母细胞分裂率(63.0％vs54.2％，P＜0.05)及原核形成率显着高于EH处理的卵母细胞。激活处理前，无Ca~(2+)培养液孵育时间的长短，对水牛卵母细胞孤雌发育无明显影响(P＞0.05)。如用A23187激活处理水牛卵母细胞，其激活分裂率随着浓度的升高而提高。结果表明，Ion能非常有效地激活水牛卵母细胞。 3．探讨了受体卵母细胞的成熟和去核时间对水牛核移植效果的影响。卵母细胞IVM16～18h与IVM19～21h的成熟率之间有显着差别(43.0％vs 58.2％，P＜0.05)，与22～24h组的成熟率之间有极显着差别(43.0％vs 68.8％，P＜0.01)，而采用盲吸法去核的去核率则随着去核时间的延长而显着下降。在体外成熟16～24h期间，水牛卵母细胞去核时间的不同对核移植后的融合率，分裂率和囊胚发育率没有显着影响。结果表明，水牛卵母细胞的成熟率随着成熟时间的延长不断提高，而去核率呈下降趋势，但对其随后的核移植效果没有显着影响(在IVM16～24h期间)。 4．对采用6-DMAP调整去核操作时间的可行性进行了探讨。水牛卵母细胞先经 水牛卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植的研究 6－DMAP抑制成熟培养3～sh，再在正常成熟培养液中成熟培养16～18h。 结果发现，与直接在正常成熟培养液中成熟培养16～18h的卵母细胞相比， 其融合率，分裂率和囊胚发育率均无显着影响。山此表明，6oMAP可用于 调整水牛卵母细胞的去核操作时间。5．利用Spindle－View系统对水牛卵母细胞成熟培养时间与细胞核和PBl的位置 关系，以及利用该系统提高去核率的可行性进行了探讨。结果发现，随着卵 母细胞成熟时间的延长，卵母细胞的核与PB；的相对距离增大。体外成熟18h， 20h和 22h的卵母细胞，其细胞核与 PB；位置较近的比例较大（分别为 72石％， 67．9％，64刀％），但当成熟时间增加到 24h时，这一比例下降到 57石％（726％ vs 57石％，P＜0刀5），如采用 Spindle－View系统去核贝可消除这种位置变化对去 核率的影响。由此表明，SPindle－View系统可用于提高卵母细胞的去核率。6．探讨了冷冻保存处理对水牛卵巢颗粒细胞核移植效果的影响。结果发现，颗 粒细胞冷冻保存后再进行核移植的融合率明显下降历7．4％VS 78．7％，P＜0．05人 但随后的分裂率，囊胚发育率无显着变化（P＞0刀5）。由此表明，冷冻保存处 理对细胞核的发育潜能无显着影响，但可能损伤细胞表面的微绒毛，进而影 响细胞间的融合。7．探讨了供体细胞培养处理方法对其核移植效果的影响。水牛颗粒细胞和成体 耳部成纤维细胞经正常培养（DMEM＋10％FCS）、血清饥饿培养 （DMEM＋0．5％FCS 5－10d）或 Aphidicolin（APD）结合血清饥饿培养（0．lqghl APD 24h，0．5％FCS 2叶8d）处理后，分别采用电融合法和直接注核法进行核 移植。结果发现，同一供核细胞各处理组间的核移植胚融合率（以颗粒细胞 作供核）和重组胚的囊胚发育率无显着差异T叩．05入 但经APD门4h）和 0．5％FCS乃～10d）培养处理的供体细胞，其重组胚的分裂率显着高于其它组 （P＜0．05），而其它各组间的分裂率无显着差异T＞队05）。结果表明，血清饥 饿处理水牛供体细胞对其核移植没有显着影响，但DNA合成抑制剂APD结 合血清饥饿培养处理供体细胞，可提高其核移植效果。8．对水牛核移植胚胎的体内发育潜能进行了评定。将来自颗粒细胞和成体成纤 维细胞的12枚核移植胚胎移植到6头受体水牛，其中有一头受孕，5头受体 水牛陆续出现返情。受孕母牛妊娠7个月时，发生流产，产下一s．s ig雄性 死胎（来自22岁的摩拉公牛耳部成纤维细胞人 山此表明，来自高龄公水牛 体细胞的核移植胚胎可以发育到妊娠后期。9．探讨了乙醇预激活水牛成体耳部成纤维细胞对其核移植效果的影
邵晓云, 徐绍业[5]2010年在《水牛胎儿成纤维细胞体外培养体系的初步建立》文中研究说明为探讨适合水牛胎儿成纤维细胞(BFF)的体外培养体系,采用常规组织块法和胰蛋白酶消化法原代培养BFF均获得了较多的成纤维细胞,但后者所得细胞的活力不如前者高,且死细胞也较多;传代或冻存成纤维细胞时用4℃预冷的胰蛋白酶室温下消化所得的细胞比37℃热消化的细胞更圆、更有光泽;跟踪32代的细胞冷冻复苏率均达70%～80%;染色体分析结果显示,二倍体细胞所占比例始终保持在80%～90%之间,各代细胞(5th、10th、15th)之间差异不显着(P>0.05)。结果表明,组织块法原代培养、4℃预冷胰蛋白酶室温消化传代细胞的培养体系比较适合水牛胎儿成纤维细胞的培养。
管晓梅[6]2014年在《水牛胎儿成纤维细胞转染hTERT基因及其核移植效果的研究》文中认为胎儿成纤维细胞是常用的体细胞核移植供体细胞类型,但由于存在体外培养代次有限、转基因后损伤大等问题,限制了其在体细胞核移植中的应用。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的核心成分,在端粒酶延长端粒过程中发挥重要的作用。本研究拟通过构建hTERT基因的真核表达载体,导入水牛胎儿成纤维细胞中,以期延长水牛胎儿成纤维细胞的体外培养寿命,获得一株经得起基因修饰和长时间药物筛选的细胞系,从而提高生产转基因克隆动物的效率。首先,本研究成功构建了hTERT基因的两个逆转录病毒表达载体pMXs-hTERT-NEO-GFP和pMXs-hTERT-IRES-NEO;并用组织块培养法分离培养得到了形态良好、增殖能力强的水牛胎儿成纤维细胞；同时,运用逆转录病毒法将构建好的载体pMXs-hTERT-NEO-GFP和pMXs-hTERT-IRES-NEO导入水牛胎儿成纤维细胞；通过高压筛选(800μg/mL G418)和恒压筛选(200μg/mL G418)相结合的方式得到阳性克隆并进行了扩大培养,获得了转hTERT基因的阳性细胞株。其次,比较了导入pMXs-hTERT-IRES-NEO载体的水牛胎儿成纤维细胞(phn-BFF).导入pMXs-hTERT-NEO-GFP载体的水牛胎儿成纤维细胞(phnG-BFF)和未转染胎儿成纤维细胞(BFF)中hTERT基因的相对表达量,发现hTERT基因在第5代和第30代phn-BFF的相对表达量差异不显着(P>0.05),但均极显着高于第5代phnG-BFF和第5代BFF (P<0.01),而第5代phnG-BFF的hTERT基因相对表达量也极显着高于第5代BFF(P<0.01)。同时,还对第30代phn-BFF的核型、细胞周期、端粒酶活性、端粒酶蛋白表达、软琼脂生长能力及p53基因表达量等生物学特性进行检测,结果显示：第30代phn-BFF的核型正常率为85%,其细胞周期与第5代BFF的相比,处于分裂期(S期)的细胞明显增多(phn-BFF38.6%>BFF25.5%,P<0.05),处于合成前期(G0+G1)的细胞减少(phn-BFF45.4%
雷钏[7]2015年在《水牛胎儿骨髓间充质干细胞分离培养及基因转染的初步研究》文中指出本研究以水牛胎儿四肢长骨骨髓为分离对象,采用全骨髓贴壁法分离培养水牛胎儿骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs),首先比较了不同胎儿大小和不同血清浓度对水牛胎儿BMSCs增殖效果和分化情况的影响,并对所分离得到的细胞进行生物学特性鉴定；同时探讨了水牛胎儿BMSCs分别培养在常氧条件(20%02)和低氧条件(5%02)下细胞表面抗原、间质标记基因、应力纤维和核型的变化情况；另外,还比较了水牛胎儿BMSCs和水牛胎儿成纤维细胞(BFFs)用不同转染试剂对其转染效果的影响,以期建立一套稳定的水牛胎儿BMSCs分离培养体系和高效转染外源基因的方法。研究结果如下：(1)随着培养基中血清浓度的增加,细胞增殖速度加快；细胞周期检测试验发现15%血清浓度中处于G0/G1期的细胞比例最小(35.8%vs52.4%,P<0.01;35.8%vs51.6%,P<0.01),10%血清浓度和20%血清浓度的差异不显着(52.4%vs51.6%,P>0.05)；但从细胞形态来看随着血清浓度的增加,胞质内出现钙沉积的细胞数量也随之增多。分离自不同大小胎牛的水牛胎儿BMSCs培养在10%血清浓度的培养基中,细胞形态无明显区别均与典型的MSCs细胞形态相似。细胞生长曲线均成“S”型,增殖速率与细胞代数和胎牛大小有关：10cm以下的水牛胎儿不易分离得到其骨髓,10cm～17cm的胎牛来源的BMSCs在3代以内随着代数的增加增殖速度加快,传至4代后,其增殖速度随着代数的增加而下降；17cm以上胎牛来源的BMSCs其增殖速率,第2代高于第1代细胞,第3代开始下降且低于第1代细胞。(2)对所分离得到的水牛胎儿BMSCs进行生物学特性鉴定发现：RT-PCR检测到第3代细胞表达oct4、sox2、nanog等多能因子和CD73、CD90、CD105等细胞表面抗原。免疫荧光分析发现第3代细胞表达OCT4、Nanog和CD73。流式细胞仪检测结果显示：第3代、第5代、第10代、第15代和第20代细胞的CD29和CD44的阳性率均大于95%,造血干细胞表面抗原CD45和内皮细胞表面抗原CD31的阳性率均小于2%。体外诱导分化试验表明第3代细胞可以被定向诱导分化为成骨细胞和成脂细胞。(3)在常氧培养条件下,水牛胎儿BMSCs随着培养代数的增加,CD29+阳性细胞比例逐渐下降；细胞内应力纤维合成受阻,细胞形态由梭形逐渐转变成多边型;培养至10代后,间质细胞标记(mesenchymal marker)基因：snail、slug、fn1、N-Cadhering mRNA的表达水平下降。然而,在低氧培养条件下,免疫荧光染色结果显示：细胞内的低氧诱导因子1、2(HIF-1、HIF-2)的表达被激活,其下游基因twist的表达量亦随之升高,与此同时间质标记基因snail、slug、fn1、N-Cadhering、coll a的表达量亦随之升高；细胞黏附试验表明,低氧条件下细胞的黏附性较于常氧条件下更小,更具有间质细胞特性；细胞免疫荧光染色亦表明：在低氧条件下,水牛胎儿BMSCs的应力纤维较在常氧下合成更稳定,表达量更高。培养于低氧条件下的P3、P10和P20水牛胎儿BMSCs核型分析统计结果表明随着细胞代数的增加,核型正常率下降,培养于低氧条件下的P10、P20细胞核型正常率高于常氧条件下的(4)在转染试剂相同的情况下,相同代数的水牛胎儿BMSCs转染效率显着高于BFFs(15.6%±0.17>13.3%±0.13,P<0.05;23.9%±0.21>19.1%±0.2 2,P<0.05);转染同一种细胞的情况下,转染试剂LipofectamineTM 3000的转染效率显着高于Roche(?) X-tremegene(19.1%±0.22>13.3%±0.13,P<0.05 ;23.9%±0.21>15.6%±0.17,P<0.05)。在此基础上利用LipofectamineTM 3000将带有催乳素(PRL)基因的质粒分别转染了相同代数的水牛胎儿BMSCs和BFFs,水牛胎儿BMSCs转染效率同样显着高于BFFs (18.5%±0.19>16.4%士0.14,P<0.05)；PCR检测结果显示转染的细胞有PRL基因整合。结论：(1)从10-17cm长的水牛胎儿长骨分离的骨髓利用全骨髓贴壁法可以分离得到具有间充质干细胞特性的BMSCs;(2)水牛胎儿BMSCs在10%的血清浓度和低氧(5%O2)条件下体外培养,细胞中HIF-Twist轴被激活,其下游靶基因snail、slug、N-Cadherin、fn1和colla1表达量升高,从而有助于BMSCs维持其间质干细胞的特性和更稳定的核型；(3)在质粒和转染试剂相同的情况下,水牛胎儿BMSCs的转染效率显着高于BFFs。
崔奎青[8]2007年在《转基因体细胞克隆水牛与广西水牛的遗传特性研究》文中认为首先分离培养水牛胎儿成纤维细胞，并检测细胞传代培养过程中的核型稳定性和支原体污染情况。结果发现，组织块法和胰酶消化法均可从水牛胎儿皮肤组织获得大量高活力细胞，15代以前的水牛胎儿成纤维细胞生长良好。分别对体外培养5代、15代、25代和30代的胎儿成纤维细胞染色体分析结果显示，核型的正常率随体外传代增加呈下降趋势，但各代细胞之间差异不显着(P＞0.05)，核型正常比率均在75％以上。设计两对PCR引物对第5、15、25和30代细胞的支原体检测污染情况进行了检测，结果检测细胞样本和阴性对照均为阴性，说明培养到30代以内的水牛胎儿成纤维细胞没有发生支原体污染。上述结果表明，在现有实验条件下水牛胎儿成纤维细胞能进行稳定传代培养，可满足体细胞核移植与转基因操作的需要。在此基础上，对影响水牛胎儿成纤维细胞在极低细胞接种密度条件下生长增殖和细胞集落形成的各种因素进行了系统的研究。结果发现，低密度接种的水牛胎儿成纤维细胞总体细胞集落形成率低于20％；在培养液中添加适宜浓度的胰岛素对水牛胎儿成纤维细胞的增殖具有显着的促进作用；培养液中添加不同浓度的细胞条件培养液，能明显改善细胞的增长；进口血清比自制血清更有利于提高细胞集落形成率；使用多聚赖氨酸做生长介质可以让细胞集落形成率增加，而琼脂和明胶的作用相反。这些研究结果表明，低密度接种的水牛胎儿成纤维细胞集落形成率较低；在培养液中添加胰岛素、条件培养液、进口血清及以多聚赖氨酸为细胞生长介质，可以提高水牛胎儿成纤维细胞集落形成率。对电穿孔法和阳离子脂质体法转染水牛胎儿成纤维细胞的条件进行系统摸索，获得了较好的DNA转染参数。电穿孔法转染时脉冲时间为15ms，电场强度为40～50V／mM时，细胞的死亡率处于20％～50％之间，比较适合外源DNA转入水牛胎儿成纤维细胞。将脂质体与DNA的比例控制在8μL：2μg，可获得较高的转染率。相同培养条件下，脂质体法比电穿孔能获得更多的转基因抗性细胞集落，转染DNA的纯度和细胞的状态也明显影响脂质体法的转染效率。用含有GFP基因的线性化载体pCE-EGFP-IRES-Neo-dNdB通过lipofectamine~(TM2000)转染水牛胎儿成纤维细胞，G418筛选2周后挑取抗性细胞集落扩大培养，对转染外源基因的抗性细胞系的生物学特性进行了分析。结果发现，经过G418筛选后细胞增殖活力下降，细胞爬片HE染色后可看到细胞形态发生变化，凋亡分析发现部分抗性细胞表现出早期凋亡征状，但染色体核型正常率与正常组相比差异不明显。这些结果表明，转染本身或随后的筛选过程会对细胞造成一定的损害。从绵羊基因组扩增得到β-casein基因启动子区到第二内含子区4.1kb的5调控序列，从人基因组克隆得到人血小板生成素(TPO)基因长5.5kb的基因组序列，然后将启动子和TPO定向插入到ploxp骨架上。包含CMV超级启动子的GFP片段从质粒pCE-EGFP-IRES-Neo-dNdB中获得，并定向连接到ploxp-CN-TPO中。经酶切、PCR鉴定，成功获得了包含人TPO基因、绵羊β-casein启动子、GFP标记基因和新霉素抗性基因等长达20kb的转基因载体ploxp-EGFP-CN-TPO。通过脂质体介导将构建好的载体线性化后导入水牛胎儿成纤维细胞中，G418筛选后得到35个抗性细胞集落，扩大培养后其中4个表达GFP绿色荧光。经PCR鉴定目的基因整合的完整性，发现1个为完整转EGFP-CN-TPO基因阳性细胞集落。通过显微操作、电融合的方法将阳性细胞移入体外成熟去核的水牛卵母细胞内构建重组胚，囊胚率显着低于对照组(P＜0.05)，说明供体细胞经过基因转染及长期体外培养筛选对克隆胚胎的早期发育有明显影响；对转基因体细胞构建核移植重组胚外源基因表达进行检测发现，绿色荧光蛋白开始表达于4细胞以后的重组胚，说明转染的外源基因能够在胚胎早期发育过程中表达。为研究广西沼泽水牛核基因组的多态性，采用23对荧光标记微卫星引物，对随机抽取的60个广西本地水牛样本进行了PCR检测，然后联合应用具有多态性的位点进行培养细胞的遗传鉴定。结果发现，23对引物中，有19对可以获得特异性产物且存在多态，平均有效等位基因数为4.0189，基因座ILSTS086含有13个等位基因；各微卫星基因座的平均杂合度变化范围为0.1852～0.4722，ILSTS019基因座平均杂合度最高(0.4722)，而ILSTS017平均杂合度最低(0.1852)；群体基因平均多态信息含量(PIC)为0.6639，19个标记中有18个PIC大干0.5，属高度多态位点。联合应用19个位点对培养细胞的基因组来源进行同一分析，证明培养细胞与供体水牛基因型完全相同，培养细胞基因组来源于供体水牛。研究结果表明，18个微卫星标记可进一步用于水牛亲缘关系的分析研究。为研究广西沼泽型水牛线粒体D-loop区DNA的多态性，比较分析沼泽型水牛与河流型水牛之间的差异，本研究对26头广西本地水牛、8头贵州贵阳水牛、11头广西水牛与河流型水牛杂交后代、9头尼里拉菲和12头摩拉水牛(共4个品种66头水牛个体)的线粒体全长D-loop序列进行了扩增测序。66头水牛912bp的D-loop多重序列比较结果发现了147个多态位点，共形成58个单体型，其中中国沼泽型水牛与河流型水牛后裔单体型明显分成两簇；以牛为外群通过NJ、ML和贝叶斯方法构建的单体型进化树显示，沼泽型与河流型水牛分成明显两大支，河流型水牛聚在一起，而在沼泽型水牛内部又分成两个侧支；观察单体型之间的遗传关系与距离的median joining network网络分析产生叁个区，与进化树分析结果一致；66头水牛D-loop区序列的碱基错配分布分析表明，水牛群体在历史上发生两次独立的群体扩增事件。为进一步验证实验结果，我们从genebank上下载了211条水牛D-loop序列与我们得到的序列整合在一起进行分析，在共有序列878bp区域中，包含了158个多态位点，共获得129个单体型；以牛为外群的进化树分析与单体型网络分析表明，沼泽型水牛分成两簇，所有的河流型水牛聚集成一紧密的簇，与进化树结果一致；碱基错配分布分析结果呈现两个明显的峰，进一步推断水牛群体在历史上发生过两次大的群体扩增。根据上述结果推断：沼泽型水牛与河流型水牛来自不同的家养化事件，沼泽型水牛起源于中国，其祖先可能存在两个基因池。
邓彦飞[9]2012年在《水牛诱导多能干细胞的研究》文中研究表明体细胞诱导为多能干细胞是一种获取多能干细胞的新方法,即采用特异性转录因子,将体细胞重编程为具有干细胞特性的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs),为胚胎干细胞建系困难的家畜提供一种获得多能干细胞的新途径。水牛是我国南方的主要家畜,除了为人类提供肉食和役用之外,其水牛奶营养丰富,是优质的奶源之一。但是,水牛的产奶量低,其各方面的生产性能需要改进。采用干细胞介导的转基因克隆技术可以实现定点打靶转基因操作,是提高水牛生产性能的先进遗传改良技术之一。但是,关于水牛干细胞多能性相关的信号路径和培养条件等研究甚少,水牛胚胎干细胞的建系困难,要应用于基因打靶技术还存在诸多困难。因此,对水牛iPSCs这种新型多能干细胞的研究显得尤为重要。本研究首次采用逆转录病毒载体携带水牛特异性转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin28,对水牛成纤维细胞(BFFs)重编程为水牛诱导多能干细胞(biPSCs)的方法和机理、biPSCs的生物学特性和表观遗传修饰等进行系统的探讨,以期为研究水牛干细胞信号通路和水牛遗传改良奠定基础。同时,本研究也利用iPSCs相关转录因子在物种间的高度保守性,使用水牛源的转录因子,对兔成纤维细胞(RFFs)重编程为兔诱导多能干细胞(RiPSCs)的方法和生物学特性等进行探索,为iPSCs应用于人类再生医学提供动物模型,同时也为兔遗传改良提供的手段之一。1、克隆和分析了水牛iPSCs相关的六个转录因子。参考GenBank中已公布的各个物种Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、 Nanog和Lin28(简称OSKMNL)的序列,设计、合成特异性引物。采用RT-PCR的方法,从水牛胎儿生殖嵴和小肠组织获取水牛OSKMNL的编码序列(CDS)。SV40large T antigen (T)的编码序列采用同样方法从293T细胞获取。测序结果表明,OSKMNLT的基因CDS的长度分别为1083bp、966bp、1434bp、1320bp、903bp、618bp和2130bp。同源性分析表明,水牛OSKMNL氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应序列具有高度的保守性,同源性分别为：Oct4(98%、96%、91%和81%),Sox2(96%、95%94%和94%),Klf4(99%、97%、92%和92%),c-Myc(98%、96%、91%和86%),Nanog (90%、81%、69%和47%),Lin28(98%、97%、89%和91%)。同时,采用PCR从水牛基因组中分段扩取Oct4和Nanog的基因组全长DNA序列。测序后拼接结果表明,水牛Oct4全长4508bp,包括5个外显子和4个内含子；Nanog全长4473bp,包括4个外显子和3个内含子。2、构建了不同的逆转录病毒载体和摸索出适合于生产水牛iPSCs的病毒系统。采用pMSCV和pMX逆转录病毒载体携带绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,探索出能高效感染BFFs,用于生产水牛iPSCs的逆转录病毒系统和操作体系；同时,构建携带水牛特异性转录因子的逆转录病毒载体,建立生产iPSCs的小鼠模型,为水牛iPSCs的生产提供实验平台。结果表明,pMX介导的逆转录病毒系统所生产的假病毒感染BFFs的效率高于pMSCV逆转录病毒系统,pMX逆转录病毒系统更适合用于生产水牛iPSCs;超速离心后的重组假病毒,可以提高感染BFFs的效率；pMX病毒载体介导水牛转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc可以将小鼠成纤维细胞重编程为iPSCs,碱性磷酸酶染色呈阳性,成功建立iPSCs小鼠模型；构建用于生产水牛iPSCs的逆转录病毒载体有pMSCV-EGFP, pMX-EGFP, pMX-Oct4-IRES-GFP, pMX-Oct4, pMX-Sox2, pMX-Klf4, pMX-c-Myc, pMX-Nanog, pMX-Lin28, pMX-LT, pMX-LT-IRES-GFP, pMX-hTERT-IRES-GFP (LT为SV40large T antigen, hTERT为人端粒酶逆转录酶,简称“hT”)。3、优化了水牛iPSCs诱导体系,并探索抑制p53表达来提高水牛iPSCs诱导效率。根据生产iPSCs常用的转录因子组合,探索出生产水牛iPSCs的转录因子组合。同时,在最佳组合条件下,探索SV40large T antigen和p53抑制剂等提高重编程效率的可行性。将AP染色着色较深的iPSCs克隆视为统计对象的阳性克隆。结果显示,OSKM组合得到21个AP阳性克隆, OSNL没有得到阳性克隆,而OSKMNL组合可以将AP阳性克隆数提高到38个；OSKM或OSKMNL结合大T抗原和人端粒酶逆转录酶hTERT可以显着提高AP阳性克隆数,特别是OSKM结合大T抗原可以获得77个AP阳性克隆；虽然BFFs表达Klf4和c-Myc,但是去除Klf4或c-Myc的组合没有克隆产生。经OSKM感染后的BFFs,采用c-Myc,抑制剂pifithrin-α (PFT-α)处理8d,可以将AP阳性克隆数提高到67个。水牛iPSCs体外扩增发现,OSKMT组合获取的水牛iPSCs可以传至10代以上,仍能保持不分化状态和正常的核型,而其它组合只能传至4-6代。TaqMan定量PCR (QPCR)检测发现,p53在水牛iPSCs和“EG-样细胞”中的表达量显着低于在BFFs的表达量；采用大T抗原或PFT-α结合OSKM诱导第6d,发现p53在OSKMT和OSKM+PFT两组的表达量显着低于在同一时期OSKM中的表达量。因此,OSKM组合能将水牛的体细胞重编程为多能干细胞；SV40large T antigen和PFT-α可以通过降低p53的表达从而提高生产水牛iPSCs的效率。4、初步鉴定了水牛iPSCs的生物学特性和重编程中多能基因启动子的甲基化状态。水牛iPSCs的生物学特性研究结果表明,biPSCs具有干细胞的特有属性,并能作为供体细胞生产克隆囊胚。水牛iPSCs克隆的形态与人和猪iPSCs的克隆相似,表达AP、Oct4、Sox2、Nancg、SSEA-1、 SSEA-4、TRA-1-81和E-Cadherin等标志基因；RT-PCR结果表明biPSCs表达干细胞相关基因：Oct4、Sox2、Nancg、Klf4、c-Myc、FOXD3、STAT3、GP130、bFGF2、E-Cadherin和p53等,这些基因也在水牛内细胞团(ICM)和“EG-样细胞”内表达。Taqman荧光定量PCR研究发现,Oct4、Sox2和Nanog在biPSCs完全被激活,并与ICM和“EG-样细胞”的表达模式相当。外源标记基因GFP荧光检测发现,外源转基因在第4代至第6代的biPSCs中开始沉默；进一步RT-PCR检测表明,外源基因在传至10代的biPS1和biPS2中完全沉默,而在其它克隆中仍有表达(如iPS3等)。对Oct4、Nanog、Sox2和E-Cadherin启动子区甲基化状态分析表明,在BFFs中Oct4和Nanog处于高甲基化状态；在pre-biPSCs ('‘不完全重编程”的biPSCs)中Oct4处于高甲基化状态；在完全重编程的biPSCs中,Oct4和Nanog处于低甲基化状态；而Sox2和E-cadherin在BFFs、 pre-biPSCs和biPSCs一直处于低甲基化状态。体外和体内分化实验结果表明,biPSCs可以在体外分化实验中形成拟胚体(EB),并表达叁个胚层的标志基因AFP,GATA4(内胚层,endoderm), ACTA2(中胚层,mesoderm)和TUBB3(外胚层,ectoderm);将biPSCs注入裸鼠体内,可以形成包含叁个胚层各种组织的畸胎瘤,如外胚层的表皮和神经组织(epidermis, neural tissues),中胚层的肌肉和软骨组织(muscle, cartilage)及内胚层的消化道和呼吸道上皮(gut-like epithelium, respiratory epithelium);进一步PCR检测发现,这些畸胎瘤来源于biPS1和biPS2,并非裸鼠本身自发形成。同时,将biPSCs作为核供体细胞应用于水牛克隆胚胎生产,结果发现,biPSCs来源的重构胚能发育到囊胚阶段。5、水牛特异性转录因子将兔成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞。根据iPSCs相关转录因子在物种间高度保守的特性,利用水牛转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc (OSKM)及SV40large T antigen(LT)探索兔胎儿成纤维细胞(RFFs)重编程为兔诱导多能干细胞(RiPSCs)。结果表明,水牛源OSKM结合LT可以将RFFs直接重编程为RiPSCs。对RiPSCs的生物学特性鉴定发现,RiPSCs的克隆形态与人类iPSCs和ES细胞类似,具有典型的干细胞形态特征,在含有bFGF和LIF的干细胞培养基中可以传至15代,且核型正常；RiPSCs呈碱性磷酸酶阳性,表达UTF-1、Oct4、Nancg、SSEA-1、 SSEA-4、Tra-1-81、c-Myc和Klf4等标志基因。外源基因表达检测结果表明,外源基因GFP在传至7代左右的RiPSCs中沉默；进一步RT-PCR结果显示,所有外源基因在RiPS1、RiPS3和RiPS6中完全沉默,而在其它克隆中沉默不完全,如Klf4和LT在RiPS7中仍有表达。对Nanog启动子区CpG岛甲基化状态分析结果表明,Nanog启动子区在RFFs中处于高甲基化状态,在传至15代之后的RiPSCs中则处于低甲基化状态。Nanog在重编程中去甲基化趋势与Nanog在RiPSCs中表达是一致的。体外和体内分化实验表明,RiPSCs在体外悬浮培养可以形成含有叁个胚层在内的拟胚体(EBs),表达叁个胚层的标志基因AFP(内胚层,endoderm), Desmi、BMP4(中胚层,mesoderm)和ⅠPAX6、MAP2(外胚层,ectoderm); RiPSCs注入裸鼠体内,可以形成包括叁个胚层在内的畸胎瘤,如外胚层的表皮组织(epidermis),中胚层的软骨组织(cartilage)和内胚层的消化道上皮组织(gut-like epithelium)。这些结果表明,水牛特异性转录因子OSKM可以将RFFs完全重编程为具有干细胞特有生物学特性的RiPSCs,同时具有多能性和分化潜能。
李楠[10]2012年在《水牛早期胚胎发育蛋白质糖基化机理及转基因克隆的研究》文中研究指明本研究主要探讨O-GlcNAc糖基化在水牛胚胎早期发育过程中的作用机理和水牛转基因克隆的相关影响因素,以便建立一套较为完善的水牛转基因克隆技术体系。具体的研究结果如下。1、建立了水牛早期胚胎O-GlcNAc糖基化蛋白和(beta-O-linked N-glycosylation, O-GlcNAcylation)相关基因的表达检测方法。免疫荧光染色抗体浓度优化的研究结果发现,当一抗浓度为1：200,二抗浓度为1：1000时,可清晰地观察到经抗体免疫后O-GlcNAc蛋白的分布,可用于O-GlcNAc蛋白的表达情况检测分析。为建立O-GlcNAc糖基化相关基因(GFPT、OGT和OGA)的mRNA表达荧光定量PCR检测分析方法,根据NCBI中GenBank所提供的人或牛GFPT、OGT、OGA基因的CDS序列设计水牛相关基因的PCR引物,克隆得到水牛的GFPT、OGT和OGA基因CDS序列,然后根据该序列设计合成实时荧光定量PCR引物。结果显示,PCR的CDS产物无杂带,条带均一,为特异性的目的片段扩增产物；QRT-PCR的熔解温度均一,熔解曲线表现为尖锐的单一峰,证实引物的有效性,说明该QRT-PCR体系可用于检测水牛早期胚胎GFPT、OGT和OGA基因的表达。2、以水牛孤雌激活(PA)、体外受精(IVF)和体细胞核移植(SCNT)早期胚胎为研究对象,研究分析了水牛早期胚胎发育过程中O-GlcNAc蛋白及相关基因(GFPT、OGT和OGA)的表达模式。免疫荧光染色结果显示,水牛PA、IVF和SCNT胚胎O-GlcNAc糖基化蛋白水平呈现相似地变化趋势,即从2-细胞期开始慢慢增加,到囊胚期达到最高；其中,IVF胚胎各阶段O-GlcNAc蛋白水平均显着高于SCNT和PA组(P<0.05),而SCNT胚胎各发育阶段O-GlcNAc蛋白水平显着高于PA组(P<0.05)。QRT-PCR的检测结果发现,水牛PA.IVF和SCNT胚胎的GFPT基因mRNA表达水平呈现先升后降的变化趋势,即从2-细胞到4-Cell期表达量升至最高,然后逐渐下降,到囊胚期达到最低;其中,GFPT的表达量在IVF胚胎各时期中表达量最高,均显着高于PA禾SCNT胚胎组(P<0.05),而SCNT胚胎组在8-细胞期后GFPT的表达量显着高于PA组(P<0.05)。OGT基因的mRNA表达量随着胚胎的发育逐渐增加,至囊胚期达到最高；其中,IVF胚胎各阶段OGT的mRNA表达量均显着高于PA胚胎(P<0.05),而在8-细胞期和桑椹胚期显着高于SCNT胚胎(P<0.05)。OGA基因的mRNA表达量从2-细胞期到4-细胞期呈下降趋势,而后又逐渐升高,到8-细胞期表达量达到最高,而后开始下降,到囊胚期降到最低,且IVF各个发育时期的胚胎OGA的mRNA表达量显着高于PA胚胎(P<0.05),但SCNT的8-细胞期和囊胚期胚胎OGA的mRNA表达量显着低于IVF胚胎(P<0.05)。3、研究探讨了糖基化底物—氨基葡糖(glucosamine, GlcN)对水牛早期胚胎发育、O-GlcNAc蛋白及相关基因表达水平的影响。当在PA、IVF和SCNT胚胎培养的0-72h添加不同浓度的GlcN(0、1、2和4mmol/L)时,2mmol/L组的囊胚率均显着高于对照组(23.75%vs13.38%；26.16%vs14.29%；25.52%vs12.70%,P<0.05),而各组之间分裂率差异不显着(P>0.05)。IF染色观察的结果显示,在各类水牛早期胚胎培养的0～72h添加2mmol/L GlcN, PA胚胎发育各阶段O-GlcNAc蛋白水平显着高于对照组(P<0.05)；IVF胚胎除囊胚期外,其它各发育阶段O-GlcNAc蛋白水平均显着高于对照组(P<0.05); SCNT胚胎除8-细胞和桑椹胚期外,其它各发育阶段均显着高于对照组(P<0.05)。QRT-PCR检测结果显示,在水牛胚胎培养的0-72h添加2mmol/L GlcN, PA胚胎各发育时期的GFPT基因mRNA表达量均显着高于对照组(P<0.05)；而IVF胚胎在4-细胞期和SCNT胚胎在4-细胞和8-细胞期的GFPT表达量均显着高于对照组(P<0.05),其它各发育阶段与对照组差异均不显着(P>0.05)。在胚胎OGT的表达方面,PA胚胎2mmol/L GlcN添加组在4-细胞期、IVF胚胎在囊胚期和SCNT胚胎2-细胞期和囊胚期的OGT表达量与对照组差异不显着(P>0.05),其余各阶段的OGT表达量均显着高于对照组(P<0.05)。在胚胎OGA的表达方面,IVF胚胎2mmol/L GlcN添加组在4-细胞期、8-细胞期、桑椹胚和囊胚期,SCNT胚胎在4-细胞期OGA表达量与对照组差异不显着(P>0.05),其它各阶段均显着低于对照组(P<0.05)。研究发现,在水牛胚胎发育0-72h间添加适宜浓度的O-GlcNAc蛋白糖基化底物(2mmol/L GlcN)有利于提高早期胚胎的发育能力；而且也可以促进早期胚胎O-GlcNAc蛋白的表达,上调OGT和GFPT基因,下调OGA基因的表达水平,从而促进胚胎的发育。4、主要探讨了影响供体细胞转染效率及转基因克隆胚胎发育的相关因素。电穿孔法、脂质体法、磷酸钙法及慢病毒法转染水牛胎儿成纤维细胞(BFF)筛选获得的转基因细胞作为核移植供体韵研究结果显示,电穿孔法构建的重构胚表达标记基因EGFP的阳性分裂率(48.00%)和阳性囊胚率(18.58%)极显着高于磷酸钙法(0%和0%)、慢病毒介导法(0%和0%)和脂质体包埋法(5.60%和3.72%)。采用电穿孔法二次转染BFF,其重构胚分裂率和囊胚率均略高于一次转染,但是差异不显着(71.23%vs68.37%；24.66%vs18.37%,P>0.05)。将内部核糖体接入位点(IRES)插入到表达载体与未插入IRES基因的表达载体比较发现,表达载体pEGFP-IRES-NEO的转基因克隆重构胚分裂率、阳性分裂率、阳性囊胚率均显着高于pEGFP-N1表达载体(71.43%vs57.77%；39.14%vs8.35%;17.64%vs5.20%,P<0.01)。将pEGFP-IRES-NEO表达载体进行单切或双切后分别转染供体细胞,单切载体重构胚的阳性分裂率和阳性囊胚率高于双酶切载体,但两组间差异不显着(37.39%vs32.41%；9.66%vs8.30%,P>0.05)。同时,在比较不同代数(6-10代)的供体细胞构建转基因克隆重构胚时发现,重构胚早期胚胎分裂和囊胚期EGFP表达率差异不显着(P>0.05)。不同性别的供体细胞转染EGFP基因用于构建核移植重构胚的结果显示,雌性细胞组阳性分裂率和阳性囊胚率显着高于雄性供体细胞组(67.63%vs42.76%；22.54%vs10.52%,P<0.05),分裂率和囊胚率也高于雄性供体细胞组,但差异不显着(71.10%vs68.42%；26.59%vs21.71%,P>0.05)。将得到的含有EGFP基因的6-8天囊胚进行胚胎移植,得到了表达EGFP的转基因克隆水牛5头,双胞胎中的一头不幸死亡。经过鉴定确认转基因克隆水牛表达EGFP基因。此外,用转干扰素(IFN)、生长素(GH)、促乳素(PRL)基因的供体细胞进行核移植,叁种基因的转基因克隆胚胎分裂率、阳性分裂率、囊胚率和阳性囊胚率差异均不显着(66.44%vs62.50%、59.23%；54.11%vs57.35%、51.63%；17.81%vs19.12%、20.65%；16.44%vs13.60%、14.67%,P>0.05),且经胚胎移植给受体水牛后获得妊娠。上述结果表明：(1)电穿孔法较磷酸钙法、脂质体法和慢病毒转染法更适合制备转基因克隆水牛,使用该法能获得转基因克隆水牛；(2)水牛转基因克隆效率受供体细胞性别的影响,雌性胎儿成纤维细胞优于雄性,但不受供体细胞转染次数、代数以及载体的酶切方法的影响；(3)携带GH、IFN和PRL的转基因载体能够用于水牛转基因克隆胚胎生产,且胚胎移植后均可以在体内妊娠并进一步发育。5、探讨了Trichostatin A (TSA)处理供体细胞和转基因克隆重构胚对水牛转基因细胞表达EGFP及克隆重构胚发育的影响。流式细胞仪检测分离、纯化后的供体细胞结果显示,随着转EGFP供体细胞代数的增加(7-11代),表达EGFP细胞的数目有所降低,差异不显着(P>0.05)。将转EGFP基因的细胞分别用浓度为5nmol/L、10nmol/L、25nmol/L、50nmol/L TSA处理24h后显着提高细胞G0/G1期的比例,且从10nmol/L起表达EGFP细胞的数目开始显着地增加(P<0.05)。 TSA浓度为5nmol/L、10nmol/L时,乙酰化水平显着高于对照组(P<0.05),且供体细胞DNA甲基化水平显着低于对照组(P<0.05)。TSA处理24h供体细胞后进行核移植的结果发现,TSA浓度为10nmol/L时,重构胚的分裂率(85.71%vs60.40%)、阳性分裂率(84.82%vs55.45%)、囊胚率(49.11%vs26.73%)和阳性囊胚率(49.11%vs21.78%)显着高于对照组(P<0.05)。将转基因克隆重构胚后用5nmol/L、10nmol/Lv50nmol/L或100nmol/L的TSA处理6h后发现,50nmol/L TSA组的重构胚的分裂率(83.33%vs69.70%)、阳性分裂率(82.41%vs60.61%)、囊胚率(45.37%vs29.29%)和阳性囊胚率(43.52%vs21.21%)均显着高于对照组(P<0.05)。用50nmol/L TSA对重构胚分别处理3h、6h、9h或12h后发现,处理时间为9h的重构胚分裂率(86.17%vs74.31%)、阳性分裂率(82.20%vs70.64%)、囊胚率(49.15%vs33.94%)和阳性囊胚率(47.46%vs32.11%)均显着高于对照组(P<0.05),其余各组与对照组相比差异不显着。此外,水牛转基因克隆胚胎的乙酰化水平及相关基因的表达水平检测结果显示,50nmol/L TSA处理重构胚9h,能显着提高胚胎的乙酰化水平(P<0.05),显着提高HAT1基因的表达(P<0.05),显着降低HDAC1基因的表达(P<0.05)。以上结果表明：(1)转EGFP的水牛胎儿成纤维细胞随着细胞代数的增加(7-11代),表达EGFP细胞的数目呈逐渐降低的趋势；(2)采用10nmol/L的TSA处理供体细胞24h不但可以显着提高转EGFP基因水牛胎儿成纤维细胞处于G0/G1期的比例和表达EGFP细胞的数量,而且能提高细胞组蛋白H3K14组蛋白乙酰化水平,且降低细胞DNA甲基化水平,提高其核移植后的转基因克隆胚胎的体外发育率；(3)适当浓度(50nmol/L)的TSA处理水牛转基因克隆重构胚一定时间(9h),能提高水牛转基因克隆胚胎的乙酰化水平,且胚胎的HAT1表达水平显着上升,HDAC1的表达水平显着下降,从而促进水牛转基因克隆胚胎的发育能力。
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