曹晓鹏[1]2007年在《骨形态发生蛋白4在椎间盘退变中作用的实验研究》文中研究说明本研究用AdEasy方法构建了BMP-4基因的重组腺病毒载体;成功的进行了人退变髓核细胞的原代培养;在人退变椎间盘细胞离体实验中证实了BMP-4基因可以在退变髓核细胞或组织中持续大量表达,并刺激椎间盘基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原的产生,为基因治疗椎间盘退变开辟了新的路径;在椎间盘退变动物模型中定量分析了BMP-4基因治疗对椎间盘基质合成的影响,为椎间盘退变的发病机制研究提出了新的思考。
刘妍[2]2011年在《双特异性抗肿瘤重组腺病毒对肝癌细胞及其模型动物的治疗作用研究》文中研究指明本研究利用分子病毒学和分子生物学方法,基于hTERTp肿瘤特异性启动子、肿瘤特异性凋亡诱导基因Apoptin和Kozak序列,构建了重组腺病毒Ad-KVT。旨在通过体内、外抑瘤实验研究,探讨Ad-KVT的抑瘤作用和方式,并将其抑瘤效果与本课题组以往构建的Ad-VT进行比较,从而明确其作用优势和作用基础。重组腺病毒的构建过程表明,Ad-KVT能够稳定、有效的表达所携带外源基因,且具有良好的遗传稳定性。另外,在Kozak序列的驱动下,Ad-KVT中Apoptin的表达量较Ad-VT高,初步实现了本研究的初衷。在体外抑瘤实验研究过程中,我研究利用MTT染色法对Ad-KVT对HepG-2肿瘤细胞的抑制作用进行分析,结果表明,Ad-KVT能够有效抑制HepG-2细胞的增殖,虽然其与Ad-VT抑瘤效果差别不显着,但其对HepG-2细胞的抑制速度高于Ad-VT。另外,本研究还通过AnnexinⅤ分析、DAPI染色、AO/EB染色、活性氧分析和线粒体膜电位分析等方法证实,Ad-KVT的抑瘤作用主要通过诱导细胞凋亡实现。本研究复制了C57BL/6小鼠荷H22腹水瘤模型,并通过该模型构建了C57BL/6小鼠荷H22实体瘤模型。对模型动物体内实体肿瘤的研究结果显示,Ad-KVT与Ad-VT作用结果一致,均可有效抑制H22实体肿瘤的生长,并在一定程度内提高模型动物平均生存期。本研究为进一步探讨Apoptin基因的抑瘤作用提供了佐证,并提示Ad-KVT具有应用于肿瘤基因治疗研究和应用的潜质。
喻杨[3]2009年在《血管损伤修复中CCNI对EPCs功能的影响及其机制研究》文中提出1.背景与目的:血管内皮损伤是经皮冠脉介入术(percutaneous coronary intervention, PCI)血管再狭窄及支架内血栓形成的核心[1],也是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等多种血管性疾病共同的病理生理基础[2-4]。内皮的有效再生是抑制血管平滑肌的异常增生和防止血栓形成的关键[5]。因此,尽早促进受损血管再内皮化、恢复内皮功能,俨然是抑制血管损伤不良修复,预防或防治血管再狭窄及血栓形成的有效策略。传统观念认为内皮损伤的修复仅仅依靠邻近内皮细胞的迁移和增殖。近年的大量研究发现内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是机体促进内皮有效再生以及血管良性修复的重要内在机制[6-9]。现已证明,EPCs在体内微环境的作用下能够分化成有功能的内皮细胞,参与缺血组织的血管新生并整合到损伤血管壁的新生内膜中参与损伤血管的再内皮化[10-13]。然而,目前对于调控EPCs增殖、迁移和分化的机制及某些关键因子在其中的作用尚不完全清楚。CCN1是近年发现的一种分泌型基质信号蛋白[14],广泛参与分化、发育、肿瘤生长等多种病理生理过程的调控[15-18]。已有研究表明:1)胚胎发育过程中CCN1基因缺陷将导致胎盘血管生成减少以及分支障碍,引起胚胎死亡[21]。2)成年后CCN1的表达与血管性疾病如动脉粥样硬化、原发性高血压、肿瘤血管新生等密切相关[22-25];CCN1还参与了皮肤、骨骼、肝脏等多种组织的再生修复过程[26-28]。3)在体外,CCN1能促进大鼠角膜及兔股动脉缺血后的血管新生,并对血管内皮细胞的增殖、迁移及管样形成能力均有促进作用[29-33]。4) CCN1在骨髓间充质干细胞(MSCs)的增殖、分化、迁移中发挥重要调控作用,并诱导CD34+细胞的迁移和归巢[33-35]。提示:CCN1可能在EPCs介导的血管新生及血管损伤修复中发挥重要作用。因此在本课题中,我们将从整体动物和和细胞水平探讨CCN1在EPCs增殖、迁移、分化以及血管损伤修复中的作用及其机制。期望为深入认识CCN1的生物学功能及EPCs的调控机制提供新的实验依据,为进一步促进血管损伤后内皮再生、血管良性修复提供新的思路和策略。2.方法:2.1重组腺病毒Ad-CCN1和Ad-Id1的构建从大鼠组织提取RNA,经RT-PCR扩增得到目的基因CCN1和Id1片段,通过pMD19T-Simple和AdEasy细菌内同源重组系统构建CCN1和Id1的病毒过表达载体,分别命名为Ad-CCN1和Ad-Id1,经过测序、PCR和酶切鉴定重组病毒Ad-CCN1和Ad-Id1的构建。2.2观察CCN1在血管损伤修复过程中的表达及作用用1-2月龄的雄性SD大鼠复制颈动脉球囊损伤模型,通过荧光定量RT-PCR以及Western blot分别观察CCN1在血管损伤修复过程中mRNA和蛋白表达水平的变化;然后向损伤血管组织转染Ad-CCN1,观察过表达CCN1对损伤后4、7、14、21天血管再内皮化以及新生内膜增厚的影响。2.3 CCN1对EPCs增殖、迁移和分化的作用通过密度梯度离心及选择性培养的方法在体外分离、培养大鼠骨髓源EPCs,经过细胞形态学、表面分子标志以及Dil-acLDL/FITC-UEA-I双阳性鉴定后,转染Ad-CCN1以及含CCN1 shRNA的重组质粒pGenesil-CCN1,以观察过表达或沉默CCN1基因对EPCs增殖、迁移、分化的作用。2.4探讨CCN1作用于EPCs增殖、迁移和分化的分子机制2.4.1利用GEArray公司的DNA芯片初步分析Ad-CCN1作用后48小时对EPCs基因表达的影响,筛选CCN1作用的可能下游靶点;2.4.2检测Ad-CCN1作用下负性转录调控因子Id1在转录、蛋白表达水平的变化,并通过Ad-Id1与Ad-CCN1的共转染实验观察Id1对Ad-CCN1诱导的EPCs分化的影响,以明确Id1是否参与介导Ad-CCN1对EPCs分化的调控作用。3.结果:3.1.重组腺病毒Ad-CCN1和Ad-Id1的构建从大鼠组织提取RNA进行RT-PCR获得含酶切位点的CCN1和Id1基因全CDS区,将目的基因连接到pMD19T-Simple载体中扩增,经过酶切、连接、转化等步骤后获得pAdTrack-CCN1和pAdTrack-Id1,然后与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,通过筛选、293T细胞包装后获得重组病毒Ad-CCN1和Ad-Id1,经鉴定、扩增获得高滴度的Ad-CCN1和Ad-Id1病毒颗粒用于下一步实验。Ad-CCN1和Ad-Id1的病毒滴度约为1.2×1010 -2.8×1011 pfu/ml。3.2 CCN1在血管损伤修复中的表达及作用3.2.1大鼠颈动脉损伤模型的建立和转染经损伤血管组织切片H&E染色证实,我们成功复制了大鼠颈动脉球囊损伤模型,损伤后7天开始出现镜下可见的内膜增生,21天时新生内膜增生明显。荧光倒置显微镜下可见转染后血管组织切片中有绿色荧光表达,证实在体腺病毒转染是成功有效的,且未发现对实验动物有明显毒副作用。3.2.2 CCN1在血管损伤修复中的表达免疫组化实验显示CCN1在损伤血管的新生内膜、中膜以及外膜组织均有表达。CCN1mRNA在正常血管组织低表达,血管损伤后表达迅速上升,12h即达到高峰,之后逐渐下降,损伤后第21天仍较对照组高。Western blot检测到CCN1蛋白表达在血管损伤后第12h开始上调,24h时达到高峰,然后逐渐回落,在损伤后第14天再次达到一个较低的表达峰值,损伤后第21天仍有表达。3.2.3过表达CCN1对球囊损伤后血管再内皮化的影响通过伊文氏蓝染色观察发现,假手术对照组内皮无损伤,内皮覆盖率为100%,损伤组残留内皮覆盖率为0%,说明内皮剥脱完全。CCN1过表达明显促进第4天、7天和14天时损伤血管的再内皮化,与相同时间点Ad-GFP转染对照组比较均有显着差异(P<0.05),说明CCN1对损伤血管的再内皮化有促进作用。3.2.4过表达CCN1对球囊损伤后血管内膜增生的影响在血管损伤后第14天,Ad-CCN1转染组血管组织内、中膜比值为0.26±0.12,明显低于Ad-GFP对照组的内、中膜比值0.58±0.18(P<0.01),而两组中膜面积无明显差异(P>0.05),提示过表达CCN1抑制了球囊损伤后第14天大鼠颈动脉新生内膜的增厚。在损伤后第21天,CCN1过表达组与GFP对照组比较无明显差异(1.13±0.21 vs 1.20±0.19,P>0.05),说明损伤后第21天CCN1抑制血管新生内膜增厚的作用不明显。3.3 CCN1对EPCs增殖、迁移和分化的作用3.3.1 EPCs鉴定分离培养的EPCs经过诱导分化后向内皮细胞表型转变,流式细胞检测CD34、CD133及VEGFR-2在培养细胞中的阳性率分别为90.28%、93.86%和74.03%,而造血细胞表面抗原CD45的阳性表达率则十分低(<10%),Dil-acLDL/FITC- UEA-I双阳性细胞约占90%,说明所培养细胞是EPCs。3.3.2基因转染EPCs转染后细胞状态良好,贴壁生长,无变圆、缩小或脱落等病理迹象,经过荧光倒置显微镜、RT-PCR以及Western blot观察发现Ad-CCN1的转染效率在第24小时约60%,48-72小时达高峰,约80%。pGenesil-CCN1转染后4天, CCN1在EPCs的表达被显着抑制,转染率约50%。3.3.3 Ad-CCN1对EPCs增殖的影响采用MTT法分析发现,Ad-CCN1对EPCs增殖没有显着作用。虽然与Ad-GFP对照组比较,Ad-CCN1对EPCs的增殖有明显促进作用(* P<0.05),但与未转染对照组比较发现,Ad-CCN1对EPCs增殖的作用没有统计学差异(P>0.05)。3.3.4 Ad-CCN1对EPCs迁移的影响外源性CCN1的过表达显着促进了EPCs的迁移。在Ad-CCN1作用诱导下,平均每个视野中迁移EPCs的数目从7.1±1.8增加到26.1±2.8,增加了近3倍(* P<0.01)。加入CCN1封闭性抗体CCN1-Ab后,Ad-CCN1的作用明显减弱(# P<0.05),提示EPCs迁移能力的增强是过表达CCN1引起的。3.3.5 Ad-CCN1对EPCs分化的影响Ad-CCN1诱导细胞获得内皮样细胞形态,表现为贴壁伸展、体积增大、呈长梭形或多角形;FACS结果显示,CD34在Ad-CCN1和Ad-GFP两组的阳性表达率分别是13.83±5.23%、59.79±9.61% , VE-cadherin的阳性表达率分别是85.74±7.11%、14.04±6.28%;Dil-acLDL阳性细胞数在Ad-CCN1组为93.5±6.3%,明显高于Ad-GFP组的61.3±9.2%。3.3.6利用RNA干扰沉默CCN1对EPCs增殖、迁移和分化的作用结果表明pGenesil-CCN1介导的CCN1基因的沉默明显抑制了EPCs的增殖、迁移和分化功能,与未干预组及pGenesil空质粒对照组比较均有显着差异(* p<0.05)。3.4 CCN1作用于EPCs的分子机制探讨3.4.1 CCN1对EPCs基因表达的影响Ad-CCN1作用后48小时,EPCs中有8个基因明显上调2倍以上,包括4个生长因子(受体)Ereg、Vegf-c、Igf-1、和Kdr,2个基质相关分子Itgav和Timp2,1个细胞因子Tnf和1个信号蛋白Gna13;此外,12个基因的表达在CCN1作用下明显下调(2倍以上),也主要是生长因子和基质分子两大类相关基因,包括Vegf-b、Tgfa、Tgfb1、Mdk、Ptn、Thbs2、Timp3、plau(u-PA)、Ifn-a1、Cxcl5、Akt1以及Sh2d2a。3.4.2 Id1对CCN1促EPCs分化作用的影响通过荧光定量RT-PCR及Western blot检测发现Ad-CCN1显着降低了Id1在EPCs中的表达,p<0.05。单独转染Ad-Id1对EPCs分化无显着影响,与Ad-CCN1的共转染则显着抑制了Ad-CCN1对EPCs分化的促进作用,p<0.05,提示Id1抑制了CCN1对EPCs分化的促进作用。4.结论:4.1 CCN1在球囊损伤的大鼠颈动脉组织动态高表达;过表达CCN1显着促进大鼠球囊损伤早期血管再内皮化程度;过表达CCN1抑制大鼠球囊损伤第14天血管新生内膜的增厚;4.2过表达CCN1基因促进EPCs的迁移和分化;沉默CCN1基因抑制EPCs的增殖、迁移和分化;4.3过表达CCN1诱导EPCs中20个基因表达的显着变化;4.4过表达CCN1抑制Id1在EPCs的表达;Id1至少部分抑制CCN1对EPCs分化的促进作用。
刘杨青[4]2013年在《重组腺病毒介导的Sox9基因转染终板软骨细胞生物学效应的研究》文中研究表明背景椎间盘退行性变导致的椎间盘疾病是临床上引起患者颈腰部及四肢疼痛的常见原因,传统的保守及手术治疗效果往往不理想。如果能从椎间盘退变的初始环节进行人为的干预,阻断甚至逆转椎间盘退变,将会为椎间盘退变性疾病提供良好的治疗途径。目前多名学者已证实Sox9基因可调控Ⅱ型胶原及软骨的合成,是Ⅱ型胶原及软骨合成的一种关键因子。椎间盘组织是由中间的髓核、外围的纤维环和上下软骨终板组成,其中软骨终板是椎间盘的重要构成,在髓核的营养交换及椎间盘的应力缓冲保护等方面,它起重要作用,椎间盘的营养物质主要是由软骨终板弥散到髓核和内层纤维环组织的。有多名学者提出椎间盘退变的始动环节是由于软骨终板的退变,功能下降及钙化引起的。徐宏光等通过在体外建立大鼠终板软骨细胞自然退变模型,研究探讨了终板软骨细胞在自然退变的过程中Sox9基因的变化和作用,对终板软骨细胞的分化和发育起关键作用的Sox9mRNA的表达随着年龄的增长受到了明显的抑制,导致Ⅱ型胶原的mRNA表达下降,Ⅱ型胶原蛋白的合成和代谢发生紊乱。Ⅱ型胶原蛋白是维持软骨终板和椎间盘功能的重要成分,它的减少可以导致终板软骨细胞外基质成分和结构的变化,从而引起软骨终板发生退变。随着细胞生物学、分子生物学和组织工程学的飞速发展,对IVDD的治疗有了新的手段,包括基因疗法、生长因子疗法、细胞疗法以及干细胞移植等,这些治疗方法统称为生物学治疗方法,生物学治疗方法大部分是针对椎间盘的治疗,阻断或逆转髓核、纤维环的退变,来达到治疗的目的,已有多名学者将Sox9基因转染到椎间盘髓核和纤维环组织中,观察其生物学效应,但尚无学者将外源性Sox9基因转染到终板软骨细胞并观察其生物学效应。本实验是通过将外源性Sox9基因转染到终板软骨细胞,观察其对蛋白聚糖和Ⅱ型胶原合成的影响。以达到减缓或阻断、甚至逆转椎间盘退变的目的,从椎间盘退变的始动环节延缓或阻止椎间盘的退变,为Sox9基因治疗软骨终板的退变提供理论依据。目的分离兔终板软骨细胞并体外培养；腺病毒体外转染终板软骨细胞,观察Sox9基因对Ⅱ型胶原和蛋白聚糖合成的影响,进一步为椎间盘退变提供基因治疗方法,减缓椎间盘退变的时间和进程,从而为防治椎问盘退变提供一定的理论依据。方法采用第二代终板软骨细胞,随机分为叁组,1、对照组：不做任何处理,2、空腺病毒组：转染不含Sox9的腺病毒,3、AdSox9基因转染组：转染AdSox9基因。腺病毒载体AdSox9成功感染了体外培养的兔终板软骨细胞,用RT-PCR技术检测病毒感染前后Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因1mRNA的表达的变化。结果腺病毒AdSox9成功感染终板软骨细胞后48h,RT-PCR结果显示对照组、空腺病毒组及AdSox9转染组均检测到了Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA的表达,而AdSox9感染的终板软骨细胞组中,检测到了Ⅱ型胶原、蛋白聚糖基因]mRNA的显着表达。AdSox9转染组与对照组和空腺病毒组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),组间比较应用LSD-t检验,结果显示对照组和空腺病毒组比较无统计学意义,AdSox9转染组与空腺病毒组及对照组两两比较均有显着性差异(P<0.05),以上结果表明,重组腺病毒介导的Sox9基因显着增加了蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的mRNA的表达。结论Sox9基因有促进终板软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的能力；Sox9基因能够防治终板软骨细胞的退变,从而在始动环节为基因治疗椎间盘退变增加了新的理论依据。
陈红霞[5]2013年在《携带CARex和PTDtat的重组5型腺病毒的获得及其对日本血吸虫童虫感染效率的研究》文中进行了进一步梳理目的RNAi已经成为生物体基因功能分析的非常重要的工具，虽然有文献报道成功地将dsRNA通过浸泡或电穿孔方法导入血吸虫各期达到基因沉默作用，然而这一技术在血吸虫研究应用中目前仍然存在一些问题，包括如何高效的将dsRNA、siRNA或shRNA表达载体高效地递送到虫体、降低递送方法导致的死亡和达到长期干扰效果，RNAi的长期应用就需要克服这些难关。本课题主要是研究Ad5能否感染日本血吸虫童虫，及其感染效率如何，并且对Ad5进行了改建，插入可以提高Ad5感染效率的基因来增加Ad对日本血吸虫的感染的可能性，作为Ad5应用于日本血吸虫童虫RNAi的前期研究，为探索腺病毒载体介导的日本血吸虫童虫RNAi奠定初步的实践基础。。方法通过体外连接方法成功构建携带CARex、PTDtat和CARex-PTDtat融合基因的重组5型腺病毒质粒pAd-CARex、pAd-PTDtat和pAd-CARex-PTDtat质粒；经Pac I酶切线性化在脂质体的介导下转染293A细胞，在包装细胞293A细胞中成功包装出具有感染力的重组病毒颗粒；扩增3代后，PCR鉴定目的基因的成功插入，然后用半数组织培养感染量（TCID50）法测定病毒颗粒的滴度，滴度在108-109之间，为了得到高滴度的重组腺病毒，用氯化铯密度梯度离心法对重组腺病毒进行纯化，纯化后的病毒滴度为1011。用3种重组腺病毒和野生型腺病毒分别感染CAR表达量不同的肿瘤细胞株，包括高表达的A549、中表达的HepG2和低表达的T24细胞，48h后倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达，然后流式细胞术检测GFP阳性细胞百分比及荧光强度。收集50只日本血吸虫阳性钉螺的尾蚴，通过机械法将尾蚴转化为童虫，然后进行童虫实验分别于48h后倒置荧光显微镜观察观察GFP在童虫体内的表达情况。结果成功构建和包装重组5型腺病毒pAd-CARex、pAd-PTDtat和pAd-CARex-PTDtat，细胞实验显示重组腺病毒pAd-CARex、pAd-PTDtat和pAd-CARex-PTDtat组细胞GFP的表达量均高于野生型pAd，但是pAd-CARex-PTDtat作用效果要低于pAd-CARex和pAd-PTDtat组。流式细胞术显示在A549、HepG2和T24细胞GFP阳性细胞的百分比是：野生型pAd组分别为54.8%、38.2%和8.52%；经改建的重组pAd-CARex组分别为90.4%、79.2%和32.1%；重组pAd-PTDtat组分别为95.8%、98.8%和93.9%；重组pAd-CARex-PTDtat组分别为70.5%、53.4%和13.3%，在3种细胞中重组pAd-CARex与野生型pAd组相比较GFP阳性细胞数平均提高33%，并且在3种细胞提高的百分比无明显差别；重组pAd-PTDtat组平均提高61.6%，在T24细胞中提高近85%，在A549细胞提高了41%，在HepG2细胞提高了60%，具有明显的作用效果，重组pAd-CARex-PTDtat平均提高仅仅约10%。4种重组病毒的平均荧光强度在A549细胞最强，HepG2次之，T24最弱。各组细胞平均荧光强度中pAd-PTDtat组最强，pAd-CARex次之，pAd-CARex-PTDtat组最弱，但是3组都高于野生型pAd。童虫实验结果显示：荧光显微镜检查野生型pAd组、pAd-CARex和pAd-CARex-PTDtat均未见到GFP的表达，只有PTDtat组能看到微弱的GFP的表达。结论实验结果表明CARex、PTDtat基因可以提高Ad5对CAR表达量的不同肿瘤细胞的感染效率，尤其是低表达CAR的肿瘤细胞，PTDtat基因的作用效果优于CARex，但是将两者联合在一起作用效果反而较差；童虫实验结果显示野生型pAd和pAd-CARex和pAd-CARex-PTDtat不能感染日本血吸虫童虫，只有经过改建后的重组腺病毒pAd-PTDtat对童虫有微弱的感染，说明PTDtat基因的作用效果较好，可以提高Ad5对肿瘤细胞和日本血吸虫童虫的感染效率。
张哲[6]2008年在《Decorin重组腺病毒对STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制的研究》文中进行了进一步梳理第一部分Decorin重组腺病毒改善STZ诱导糖尿病大鼠的肾脏结构与功能目的越来越多的证据表明,转化生长因子β1(Transforming Growth Factorβ1,TGFβ1)在糖尿病肾病的发生发展中起重要作用。以TGFβ1为靶点的治疗模式可能缓解糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)发生发展。核心蛋白聚糖(Decorin,DCN)是一种体内天然存在的TGFβ1拮抗剂,已经证实,DCN可以拮抗TGFβ1所致的纤维化。本研究通过基因转染技术在链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠肾脏内过度表达DCN,观察DCN过表达对糖尿病大鼠肾脏结构与功能的影响。方法1.载体构建:由本研究组成员前期构建大鼠DCN重组腺病毒载体(Adenovirus vector-DCN,AD-DCN)和LacZ重组腺病毒载体(Adenovirus vector-LacZ,AD-LacZ),经鉴定AD-DCN能够高效表达完整而有活性的DCN核心蛋白。2.动物模型的建立与分组:采用一次性腹腔注射STZ 60mg/kg的方法建立Sprague—Dawley(SD)大鼠糖尿病模型。造模成功后第8周将糖尿病大鼠随机分为3组,进行下述处理:1)DCN治疗组(n=12):分别在8周及12周腹腔内注射AD-DCN 0.6ml(1×10~9PFU/ml)。2)AD-LacZ转染组(n=12):分别在8周及12周腹腔内注射AD-LacZ 0.6ml(1×10~9PFU/ml),该组作为重组腺病毒载体转染对照组。3)糖尿病对照组(n=12):分别在8周及12周腹腔注射PBS0.6ml。另设正常对照组(n=12),分别在8周及12周腹腔注射PBS0.6ml。其中12周先处死大鼠,然后对剩余的大鼠作腹腔注射。3.标本留取:糖尿病模型确立后第10,12,16周(即AD-DCN初次转染后2周、4周、8周)每组各取4只大鼠,收集次尿,然后称体重,取股动脉血后处死。取出双侧肾脏,左肾皮质-80℃冷冻保存,右肾称重后福尔马林浸泡固定,制成蜡块。4.观测指标:尿白蛋白排泄率(The Rate of Urinary Albumin Excretion,UAER)以尿白蛋白比尿肌酐(ug/mg)表示,尿白蛋白采用酶免法测定,尿肌酐采用碱性苦味酸法测定。肾脏肥大指数(Kidney Hypertrophy Index,KHI)以肾重/体重(g/kg)表示。血浆血糖,血肌酐和谷丙转氨酶(Glutamate Pyruvate Transaminase,GPT)采用全自动生化仪测定。上述的石蜡切片进行常规高碘酸-希夫(PeriodicAcid-Schiff Staining,PAS)染色以及Masson染色,并进行TGFβ1和肾脏细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的重要成分Ⅳ型胶原的免疫组化染色。所有染色在HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文报告分析系统中进行半定量分析。结果1.实验大鼠的一般情况:糖尿病大鼠较正常对照组血糖增高,体重增长缓慢(P＜0.01)。AD-LacZ转染组和DCN治疗组没有改善糖尿病大鼠的血糖,也没有缓解糖尿病大鼠体重增长缓慢的状况。整个实验过程中,各组大鼠的死亡未见统计学差异。所有糖尿病大鼠(含AD-LacZ转染组和DCN治疗组)均未出现GPT,血肌酐异常。2.实验大鼠UAER和KHI的改变:10周至16周,糖尿病组大鼠UAER始终较正常对照组增高(P＜0.05),AD-LacZ转染组的情况与糖尿病组相似(P＞0.05)。DCN治疗后糖尿病大鼠UAER在各观察时点都有下降,在16周时与糖尿病组间有统计学意义(P＜0.05),JIDCN治疗组与正常对照组没有统计学差异。糖尿病组,AD-LacZ转染组和DCN治疗组大鼠的KHI明显高于正常组(P＜0.01),DCN治疗组使糖尿病大鼠KHI略有下降,但并未见统计学差异。3.PAS染色和Masson染色PAS染色发现糖尿病组和AD-lacZ转染组大鼠肾小球系膜区,基底膜有PAS阳性物质沉积,并且随病程延长逐渐增多(P＞0.05)。10-16周,AD-DCN治疗可以明显减少PAS阳性物质沉积(P＜0.01)。Masson染色中糖尿病组和AD-lacZ转染组大鼠肾小球系膜区可见Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维异常沉积,AD-DCN治疗同样使Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维异常沉积减少。4.免疫组化研究:免疫组化研究结果提示,糖尿病组与AD-LacZ转染组大鼠肾皮质Ⅳ型胶原的表达较正常对照组增高(P＜0.01)。外源DCN抑制Ⅳ型胶原在糖尿病大鼠肾皮质中的表达(P＜0.05),10周时DCN的抑制效应最强(P＜0.05)。与正常对照组相比,糖尿病组与AD-LacZ转染组大鼠肾皮质TGF-β1表达增高。外源DCN能够抑制糖尿病大鼠肾皮质TGF-β1表达(P＜0.05),在第10周时,该抑制效应最强(P＜0.05)。结论1.STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏ECM过度沉积,UAER增高。腺病毒载体本身不能改善上述变化。2.腺病毒载体介导的DCN基因转染能抑制糖尿病大鼠肾皮质TGF-β1的表达,缓解糖尿病大鼠UAER增加,减轻肾脏局部ECM堆积。第二部分Decorin重组腺病毒对糖尿病大鼠肾脏TGFβ1/Smads信号传导系统的影响目的经典的信号传导通路中TGFβ1通过Smad2,3蛋白磷酸化以及核转位将信号传递至靶基因。AD-DCN转染糖尿病大鼠后肾脏TGFβ1的表达有所减少,究竟外源性DCN转入对TGFβ1/Smads信号传导系统影响如何?本研究检测了糖尿病大鼠肾皮质DCN,TGFβ1以及磷酸化Smad2,3(Phosphorylation Smad2,3,pSmad2,3)与Smad2,3的比值,阐明上述问题。方法1.肾皮质DCN,TGFβ1 mRNA的检测:采用逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase ChainReaction,RT-PCR)方法检测四组大鼠肾脏DCN,TGFβ1 mRNA的表达。用Trizol试剂提取肾皮质mRNA。逆转录后合成的第一条cDNA链为模板进行目的基因PCR扩增,以βactin为内参。扩增产物经电泳后,在紫外光下进行凝胶成像。测定各产物与βactin的密度值(Image Density View,IDV)。目的基因的mRNA水平=目的基因mRNA的IDV/βactin基因mRNA的IDV。2.肾皮质DCN,TGFβ1,pSmad2,3与Smad2,3蛋白的测定:采用免疫印迹法(Western blot)检测肾组织DCN,TGFβ1,pSmad2,3与Smad2,3的表达。首先从100mg肾组织中提取组织蛋白,然后进行SDS-PAGE电泳,转膜。转膜成功后先封闭非特异性免疫反应,然后浸于封闭液稀释的一抗中,4℃反应过夜。将PVDF膜,浸泡在用TBST稀释二抗反应液中,室温反应2小时。经TBST浸洗,进行显色反应。最后通过凝胶成象分析,测定目的蛋白和actin蛋白的IDV。目的蛋白的表达量=目的蛋白IDV/actin IDV。结果1.AD-DCN促进糖尿病大鼠肾皮质DCN转录,进一步增强DCN蛋白的表达。与正常对照组相比较,糖尿病组,AD-LacZ转染组大鼠肾皮质DCN mRNA和蛋白水平的表达均增高(分别P＜0.01或P＜0.05),后两组之间未见明显统计学差异。AD-DCN治疗后肾皮质DCN表达较糖尿病组更高,10周最为明显,其中DCNmRNA增幅达20%(P＜0.01);而DCN蛋白的表达增加110%(P＜0.01)。12,16周,DCNmRNA的表达已经与糖尿病组无差别,而DCN蛋白水平虽然随着时间的推移逐渐下降,但始终高于糖尿病组(P＜0.05)。2.AD-DCN治疗可以抑制大鼠肾皮质TGF-β1的表达糖尿病组及AD-LacZ转染组大鼠肾皮质TGF-β1 mRNA和蛋白表达增高(P＜0.01)。AD-DCN治疗抑制糖尿病大鼠肾皮质TGF-β1 mRNA和蛋白表达(10周时,P＜0.05:12,16周,P＞0.05)。3.AD—DCN明显抑制Smad2,3磷酸化糖尿病时大鼠肾皮质pSmad2,3与Smad2,3比值增高,提示TGFβ1/Smad2,3信号系统激活。AD-DCN阻止了Smad2,3的激活,这一作用一直延续至16周(P＜0.05),这与DCN蛋白水平的变化一致。结论1.糖尿病大鼠肾脏局部的DCN表达增高,TGFβ1/Smad2,3信号系统活跃。2.AD-DCN转染可以进一步糖尿病大鼠促进肾脏局部DCN转录,提高DCN蛋白水平。同时抑制TGFβ1的高表达,减少Smad2,3分子的磷酸化。第叁部分Decorin重组腺病毒对糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡与Bax/Bcl-2表达的影响目的DN早期肾脏体积增大主要因为肾脏细胞周期紊乱导致的异常增生、肥大:DN晚期肾小球硬化主要由于肾小球细胞数减少和细胞外基质的增多。从细胞增生变为细胞减少的过程伴有细胞凋亡的增加。细胞凋亡即程序性细胞死亡,线粒体凋亡是其中重要的途径之一。Bax与Bcl-2作为一对促凋亡因子和细胞生存基因,两者的比例调控细胞凋亡过程,是线粒体凋亡过程的重要调控基因。本研究检测AD-DCN转染糖尿病大鼠肾脏凋亡细胞数目,同时采用免疫组化的方法测定Bax与Bcl-2的表达,研究外源性DCN对糖尿病大鼠肾脏组织细胞凋亡的影响。方法采用免疫组化的方法测定大鼠肾组织中Bax与Bcl-2的表达,在HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文报告分析系统中进行半定量分析。采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测肾脏凋亡细胞,并在高倍镜下(×400)统计阳性细胞核的数目,凋亡指数以每个视野下阳性细胞核数/总细胞核数表示。分别采用Spearman法和Pearson法将凋亡指数,Bax/Bcl-2以及UAER作两两相关分析。结果1.AD-DCN减少糖尿病大鼠肾组织的细胞凋亡正常对照组大鼠肾组织内凋亡细胞很少,主要分布于远端肾小管细胞,糖尿病组与AD-lacZ转染组肾组织内凋亡细胞增多,可见于肾远曲小管,近曲小管,肾间质以及肾小球,并且随糖尿病病程延长而增加(P＜0.05)。而AD-DCN转染使糖尿病大鼠肾组织中凋亡的细胞数显着减少(P＜0.01),但未能恢复到正常对照组水平(P＜0.01)。2.AD-DCN可以调节Bax和Bcl-2在肾脏的表达糖尿病组和AD-lacZ组大鼠肾脏Bax的表达较正常对照组增强,Bcl-2的表达亦增强,且Bax/Bcl-2比值增高,诱导肾组织中的细胞凋亡。随着病程延长,Bax进一步增高,而Bcl-2的增高趋势有所缓解,故Bax/Bcl-2的比值进一步增高(P＜0.01)。糖尿病大鼠接受AD-DCN治疗后,Bax的表达减弱(P＜0.05),而Bcl-2的表达有所增强,因此Bax/Bcl-2比值下降甚至低于正常对照组,阻断细胞的凋亡。3.Bax/Bcl-2比值与肾脏细胞凋亡指数以及UAER的相关性分析。10周、12周、16周肾组织凋亡指数与Bax/Bcl-2比值显着正相关(P＜0.01)。UAER增高与肾凋亡指数正相关(P＜0.05),与Bax/Bcl-2比值仅在10周时正相关(P＜0.05)。结论1.糖尿病大鼠肾组织中凋亡细胞增多,AD-DCN降低糖尿病大鼠肾组织Bax/Bcl-2比值的同时减少了细胞的凋亡。Bax/Bcl-2的比值与肾组织细胞凋亡指数正相关。2.AD-DCN减少糖尿病大鼠UAER的效应部分与DCN减少肾组织细胞的凋亡有关。总结STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏ECM过度沉积,UAER增高,这可能是因为肾脏局部TGFβ1/Smad2,3信号系统活跃;肾组织中Bax/Bcl-2比值增高诱导细胞凋亡。腺病毒载体本身不能改善上述变化。而腺病毒载体介导的DCN基因转染能缓解糖尿病大鼠UAER增加,减轻肾脏局部ECM堆积。AD-DCN的这种肾脏保护作用可能源于:AD-DCN能促进糖尿病大鼠肾脏局部DCN转录,提高肾脏局部DCN蛋白水平,从而抑制肾皮质TGFβ1的高表达,减少Smad2,3分子的磷酸化,抑制TGFβ1/Smad2,3信号系统在肾组织中的传导:同时AD-DCN可以降低糖尿病大鼠肾组织Bax/Bcl-2比值,减少了细胞的凋亡。
肖剑[7]2002年在《重组腺病毒介导的人转化生长因子β_1基因调节椎间盘生物功能的实验研究》文中研究指明椎间盘退变、突出的发病率相当高，这一点已是不争的事实。最新的椎间盘生理、生化及病理研究证明：椎间盘的含水量的保持主要依赖其基质中蛋白多糖的含量，Ⅱ型胶原则在椎间盘承受压力方面发挥关键作用。内因、外因及遗传方面的诸多因素导致椎间盘逐步退变后，其实质就是基质中蛋白多糖的减少，含水量降低，Ⅰ型胶原出现在基质中，Ⅰ、Ⅱ型胶原的比例明显上升，髓核呈纤维样改变，导致椎间盘的膨胀压降低，承重能力下降，椎间高度降低，椎间盘承受的重力不能平均地向各方向传递，致使纤维环疲劳、破裂、髓核突出，造成脊髓或马尾神经受压，引起严重后果。 针对椎间盘退变、突出，传统的治疗方法有两大类：一是非手术疗法；二是手术切除病灶。非手术疗法是以缓解症状为主，依靠的是患者的自我调节和修复能力，而椎间盘是一个血供十分差的组织，尤其是在髓核内，根本就没有血液供应，其营养及氧的获得主要靠被动扩散，细胞活力相当差，所以，椎间盘的自我修复能力十分有限，这就是经非手术疗法缓解的病人，常常复发的原因，其中部分病人不得不转而行手术治疗。手术疗法虽然能解除脊髓的致压物，但是，它一方面增加了病人的痛苦，另一方面又以牺牲病人脊柱的生理完整性为代价。 是否有一种方法既能从根本上阻止甚至逆转椎间盘的退变进程又能保持脊柱的生理完整性，同时将病人所承受的痛苦减到最低呢? 在体外实验中，转化生长因子β_1(TGF-β_1)能促进髓核细胞产生蛋白多糖，同时能对Ⅱ型胶原起调节作用。在此基础上我们进行了一些探索性的研究。我们通过PCR从pcDNA3.1(+)-TGFβ_1质粒中大量扩增了TGF-β_1基因片段。运用同源重组的方法构建了携带人TGF-β_1基因的重组腺病毒载体(Ad／CMV-h TGFβ_1)尝试性地培养了兔腰椎间盘髓核细胞，同时观察细胞的演变，探讨髓核细胞的生物学行为及影响因素，并用脂质体将绿色荧光蛋白(EGFP)基因导入兔髓核细胞内，观察基因的表达情况。结果为：原代细胞生物学性状最接近体内细胞，传代后细胞呈现衰老现象。活力测定提示，随着培养时间的延长及传代，细胞活力逐渐降低。髓核细胞内细胞器的变化与其生物学活性变化相一致。在用脂质体将绿色荧光蛋白基因导入髓核细胞后，细胞在24小时后即可发出绿色荧光，并能持续发光3个月，直至细胞死亡。兔髓核细胞培养的成功，建立了体外髓核细胞培养的模型，绿色荧光蛋白在髓核细胞内的成功表达，说明髓核细胞适合表达外源性的基因，为将治疗性基因导入髓核细胞从而产生治疗效果的后续实验奠定了基础。 在兔髓核细胞培养成功的基础上，我们又进行了人退变椎间盘髓核细胞的原代 第二军医大学博士学位论文 培养，并获得了成功，希望以体外原代培养的细胞模拟在体内的退变情形。另外， 我们将Ad／Cy十TGF p；转染至人退变的髓核细胞中，用免疫组化染色观察TGF－p ；的表达及其对髓核细胞＊型胶原合成的调控作用。结果表明：TGF－P；在髓核细 胞内得到了大量的表达，实验组TGF－i；免疫组化结果呈强阳性，而对照组只显示 弱阳性。11型胶原免疫组化染色结果显示：实验组染色为强阳性，而对照组只显示 了很弱的阳性，说明人退变髓核细胞不仅能大量表达外源性的TGF－p；编码基因， 还能在基因产物的作用下增加11型胶原合成的能力。 在体研究中，我们将＊／CMV－hTGF i；，生理盐水及＊／CM’M－LaCZ分别注入兔椎 间盘髓核组织中，于注射后 10天、20天用免疫组化定性检测 TGF－p；的表达，于 注射后10天、20天、45天分别用ELISA定量检测TGF寸；在髓核组织中的含量， 称取髓核组织的重量及用放免法检测透明质酸的变化情况。结果显示：注射了 Ad／CM’e－hTGF i；的髓核组织，不管是 10天组还是 20天组，都显示了广泛而强烈的 免疫组化阳性染色结果，而注射生理盐水或Ad／CMV－LacZ的髓核组织仅显示了很弱 的阳性染色。TGF－pl的ELISA定量检测结果显示：Ad／CWi－hTGFpl组中10天。 20天、45天组的TGF一p；产量分别是对照组的3倍、2．6倍及2倍（P＜0．01）。注 射了Ad／CM’M－hTGF pl的髓核组织的重量分别为对照组的1．8倍、2．3倍及2倍0 wto．01）。实验组各天数之间及对照组之间均无统计学差异。放免法定量结果显示： 实验组髓核组织中透明质酸的含量大大增加。实验组10天、20天、45天的透明质 酸含量，分别为对照组的互．5倍、1．7倍及1．6倍（P＜0．01）。实验组各天数之间 也有统计学差异，而对照组之间无显着差异。 卜 在 TGF－6；基因调节＊型胶原含量的在体研究中，我们将 Ad／CMV－hTGF p；和 生理盐水分别注入兔椎间盘髓核组织中，于注射后 10?
万莹铧[8]2009年在《外源性CCN1在核辐射所致细胞损伤中的作用和机理研究》文中提出目的:辐射损伤在平时和战时均可发生,但对于合并辐射损伤的伤口愈合延缓甚至长期不愈合的机理尚未完全阐明。成纤维细胞是固有结缔组织中数量最多的细胞,也是参与创伤修复的主要细胞,其受损必然影响创伤后肉芽组织形成及其他组织修复过程,这可能是合并辐射损伤时创伤难愈的重要原因之一。Cyr61/CCN1(cysteine-rich 61)是CCN蛋白家族成员之一,能促进细胞增殖、黏附、分化,在血管发生、细胞外基质形成中起重要作用,但是CCN1与辐射损伤有何关系?其具体机制如何?目前尚不清楚。本课题在检测CCN1在辐射损伤小鼠成纤维细胞系L929细胞中表达情况的基础上,以CCN1条件培养液处理辐射损伤细胞,观察其对细胞生长、迁移以及对创伤愈合相关因子表达的调控。通过研究,初步探讨CCN1在辐射损伤后细胞创伤愈合中的作用及机制,为深入认识伤口愈合过程的机制提供新的视角,并为探索促愈治疗新药提供新的途径。方法:1.对小鼠成纤维细胞给予不同剂量(2、4、6、8 Gy)60Coγ射线辐照,计算细胞存活分数并绘制细胞存活曲线,确定辐射致L929细胞损伤的最适剂量。2.采用最适剂量4 Gy 60Coγ射线辐照L929细胞,利用MTT法、克隆形成试验检测辐射对细胞生长的影响,以DNA Ladder电泳法、TUNEL方法检测辐射后细胞凋亡情况,以流式细胞仪检测辐射对细胞周期的影响。3.应用ICC、RT-PCR检测4 Gy 60Coγ射线辐照L929细胞后不同时间(0、6、12、24、48、72 h) CCN1表达水平的变化,并以RT-PCR检测不同60Coγ射线辐射剂量(1、5、10 Gy)照射的L929细胞24 h CCN1的表达。4.应用HEK293细胞扩增带有标记基因RFP的重组腺病毒AdCCN1和对照AdRFP,并制备条件培养液:以AdCCN1和AdRFP分别感染CHO细胞,16 h后荧光显微镜下检测RFP表达,更换为低血清培养液继续培养,于48 h后收集培养上清液,冷冻、干燥浓缩后,Western Blot鉴定CCN1蛋白的表达。5.分别以CCN1和RFP条件培养液连续培养辐射损伤L929细胞,利用MTT法、克隆形成试验检测外源性CCN1处理辐射损伤L929细胞生长曲线及克隆形成率,划痕愈合试验、流式细胞仪分别检测干预后L929细胞迁移和L929细胞周期改变。6.应用RT-PCR方法检测条件培养液培养不同时间(1、3、5 d)辐射损伤L929细胞创伤愈合相关因子I型胶原(ColⅠ)、基质金属蛋白酶-1(MMP1)及金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP1)mRNA水平的表达。ICC方法检测干预5 d后辐射损伤L929细胞ColⅠ、MMP1及TIMP1蛋白水平的表达。结果:1.不同60Coγ射线辐射剂量皆会影响L929细胞的存活,根据绘制的细胞存活曲线图确定L929细胞的D37 (63%细胞死亡)为4 Gy。选择4 Gy 60Coγ射线作为本课题研究中L929细胞的辐射剂量。2.60Coγ射线对L929细胞生长的影响:①4 Gy 60Coγ射线辐照后2 d,L929细胞增殖受到明显抑制。辐射组的克隆形成数及克隆形成率显着低于对照组。②DNA Ladder电泳法未见DNA梯状谱形成,TUNEL染色未见阳性细胞。③各组L929细胞周期分布结果:4 Gy 60Coγ射线辐照后24 h,L929细胞周期的G2/M期增高了6.01倍,S期降低了7.06倍,G0/G1期降低了1.26倍,表明辐射可致L929细胞周期停滞在G2期。3.60Coγ射线对L929细胞CCN1表达的影响:ICC法、半定量RT-PCR法检测结果显示:60Coγ射线辐射后24、48h,L929细胞CCN1蛋白表达较对照组明显减弱。辐射组L929细胞CCN1 mRNA表达水平显着低于对照组(P<0.01),辐照后6 h CCN1 mRNA表达明显降低,至24小时后开始回调;不同60Coγ射线辐射剂量(1 Gy、5 Gy、10 Gy)照射的细胞CCN1 mRNA表达水平均显着低于对照组(P<0.05),且60Coγ射线辐射剂量越大,CCN1 mRNA表达水平越低。4.制备CCN1和RFP条件培养液,荧光显微镜下观察到二者有较强的荧光信号,且CCN1条件培养液经Western Blot检测出了CCN1蛋白的表达,RFP条件培养液则无。5.外源性CCN1对辐射损伤L929细胞的调节作用:①CCN1明显促进L929细胞的增殖。CCN1组的克隆形成数及克隆形成率均显着高于RFP组。②划痕损伤后细胞的愈合速率为:CCN1处理1~5 d,试验组组较对照组细胞趋于愈合(P<0.01)。如在1 d,CCN1组(18.73±5.33)%,RFP组(12.11±4.03)%,3 d时,CCN1组(74.48±9.19)%,RFP组(54.38±6.57)%。③各组L929细胞周期分布结果显示:CCN1条件培养液处理5 d的辐射损伤L929细胞与RFP组比较,细胞周期的S期增高了1.48倍,G2/M期降低了1.73倍,表明CCN1可促进细胞有丝分裂,从而促进细胞增殖。6.外源性CCN1对辐射损伤L929细胞中创伤愈合相关因子的调控:CCN1条件培养液处理辐射损伤L929细胞后1 d,细胞MMP1和TIMP1 mRNA均低于RFP组,ColⅠmRNA明显高于RFP组(P<0.01);第3 d,MMP1表达明显高于RFP组(P<0.01),TIMP1表达也高于RFP组,但无统计学意义,ColⅠ表达明显低于RFP组(P<0.01);第5 d,MMP1的阳性细胞平均光密度(MD)明显高于RFP对照组(P<0.05),TIMP1的表达也增强,ColⅠ的阳性细胞MD明显低于RFP对照组(P<0.05)。结论:1.4 Gy 60Coγ射线辐照的L929细胞,细胞增殖明显受到抑制,克隆形成能力明显下降,无凋亡现象,细胞周期阻滞在G2期,使细胞不能进行正常的有丝分裂,从而抑制了细胞的增殖。辐射后的L929细胞CCN1蛋白水平和mRNA水平的表达明显下调,且CCN1 mRNA表达下降水平与60Coγ射线辐射剂量大小呈正比。提示CCN1基因的表达水平低下可能与辐射导致细胞生长抑制有关。2.外源性CCN1可促进辐射后细胞增殖和迁移,使细胞周期S期明显增高,提示CCN1可能具有促进创伤愈合的作用,辐射后创伤难愈可能与CCN1表达下调有关。3.外源性CCN1在一定时限内可显着上调创伤愈合相关因子MMP1的表达,下调ColⅠ的表达。提示CCN1基因可能通过调控创伤愈合相关因子的表达,在促进辐射损伤愈合中发挥重要作用。
参考文献：
[1]. 骨形态发生蛋白4在椎间盘退变中作用的实验研究[D]. 曹晓鹏. 第二军医大学. 2007
[2]. 双特异性抗肿瘤重组腺病毒对肝癌细胞及其模型动物的治疗作用研究[D]. 刘妍. 吉林大学. 2011
[3]. 血管损伤修复中CCNI对EPCs功能的影响及其机制研究[D]. 喻杨. 第叁军医大学. 2009
[4]. 重组腺病毒介导的Sox9基因转染终板软骨细胞生物学效应的研究[D]. 刘杨青. 郑州大学. 2013
[5]. 携带CARex和PTDtat的重组5型腺病毒的获得及其对日本血吸虫童虫感染效率的研究[D]. 陈红霞. 安徽医科大学. 2013
[6]. Decorin重组腺病毒对STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制的研究[D]. 张哲. 浙江大学. 2008
[7]. 重组腺病毒介导的人转化生长因子β_1基因调节椎间盘生物功能的实验研究[D]. 肖剑. 第二军医大学. 2002
[8]. 外源性CCN1在核辐射所致细胞损伤中的作用和机理研究[D]. 万莹铧. 第叁军医大学. 2009
标签：基础医学论文; 腰椎间盘论文; 腺病毒论文; 细胞分化论文; 糖尿病论文; 基因合成论文; 重组蛋白论文; 细胞转染论文;