一、骨肉瘤细胞体外培养中仿血管发生现象(英文)（论文文献综述）
陈庆科[1]（2019）在《PSMC2对前列腺癌细胞生物学行为的影响及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:前列腺癌（Prostate Cancer）是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤。最新流行病学统计数据显示,近年来随着我国人口老龄化加剧、饮食习惯改变等不良因素影响,我国前列腺癌发病率及致死病例呈上升趋势,发病人群呈年轻化趋势,形势严峻。前列腺癌起病常隐匿、临床表现缺乏特异性、潜伏期较长,多半患者在出现较严重的血尿、尿路梗阻、骨痛及病理性骨折等被确诊时已是中晚期。局灶性病灶行根治性术后预后良好,但中晚期治疗手段有限、预后差。因此,早发现、早诊断、早治疗对于前列腺癌尤为重要,然而目前尚缺乏前列腺癌早期筛查的可靠生化指标及行之有效的靶向治疗位点;故深入探究前列腺癌发生、发展的分子机制,寻找新的筛查指标及靶向治疗位点一直是临床与相关研究领域的热点。ATP酶蛋白酶体26S亚基2（proteasome 26S subunit,ATPase 2,PSMC2）是蛋白编码基因,是26S蛋白酶体的19S调节颗粒的必要组分,它能与ATP及核苷酸结合,具有水解酶及核苷三磷酸酶的功能,在胞内选择性降解蛋白质中发挥了关键作用,参与调节细胞分化及增殖、细胞凋亡、能量代谢及信号转导等诸多生物学活动。有研究表明PSMC2及26S蛋白酶体与多种肿瘤的发生、发展密切相关,包括乳腺癌、肝细胞癌、食管癌及胰腺癌等,但目前尚未见PSMC2和前列腺癌的相关研究报道。本研究分为三部分。第一部分为检测PSMC2的表达及分析其临床意义。检测组织标本中PSMC2蛋白的表达,并分析PSMC2与前列腺癌临床病理特征的关系,分析其临床意义。同时检测各前列腺癌细胞系中PSMC2 mRNA的表达水平,在细胞层次分析PSMC2与前列腺癌的关系。第二部分为PSMC2的功能学研究。观察PSMC2表达改变对前列腺细胞PC-3与DU145增殖、生长、凋亡、二维迁移及侵袭能力与体内成瘤能力的影响。第三部分为PSMC2调控前列腺癌发生发展,发挥生物学功能的作用机制研究。为揭示PSMC2在前列腺癌中发挥作用的分子机制,本研究采用蛋白芯片技术筛选PSMC2的上游及下游相关蛋白分子,结合Akt抑制剂MK2206处理,采用Western blot检测蛋白分子表达,观察PSMC2表达改变及PI3K/Akt通路抑制对前列腺癌细胞凋亡关键蛋白表达的影响,分析PSMC2在前列腺癌细胞中主要的调控作用及依赖转导信号通路。揭示PSMC2调控前列腺癌发生与进展作用机制,可为前列腺癌提供潜在的生物标志物及分子治疗靶点,为其早期诊断及靶向分子治疗提供新的思路,为相关研究提供理论基础及实验依据。方法:1.标本收集、细胞培养及PSMC2 mRNA、蛋白表达检测:收集2016年1月至2018年12月期间我院泌尿外科收治的行前列腺癌根治性切除术患者的癌组织标本152例及癌旁前列腺组织80例,采用免疫组化法检测组织标本中PSMC2蛋白的表达,设置癌组织组及癌旁组织组别,其中癌组织组别再根据肿瘤临床分期及病理分级进行亚分组,并分析PSMC2与前列腺癌临床病理特征的关系,分析其临床意义。同时体外培养前列腺癌细胞株PC-3、DU145和C4-2,采用实时荧光定量PCR检测各前列腺癌细胞系中PSMC2 mRNA的表达水平,在细胞层次分析PSMC2与前列腺癌的关系。2.细胞模型及动物模型构建;采用质粒构建及慢病毒转染技术构建PSMC2基因敲减的前列腺癌细胞模型PC-3和DU145,设置阴性对照组与PSMC2敲减组,通过qRT-PCR及Western blot分别检测细胞中PSMC2 mRNA、PSMC2蛋白的表达,验证PSMC2的敲减效率。于SPF级别条件里饲养裸鼠,通过皮下注射PC-3细胞及PSMC2表达敲减的PC-3细胞建立小鼠异种移植瘤模型,设置阴性对照组与PSMC2敲减组,采用卡尺及小动物活体成像系统观察动物模型里成瘤及成瘤生长情况,其后处死裸鼠取瘤体称量其重量,并取瘤体行免疫组化检测Ki-67蛋白表达。3.在上述PSMC2基因敲除的前列腺癌细胞模型PC-3和DU145构建基础上,设置阴性对照组与PSMC2敲减组,分别采用Celigo细胞计数法细胞增殖实验、平板克隆实验、流式细胞术细胞凋亡实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验及裸鼠荷瘤实验观察PSMC2表达改变对前列腺细胞PC-3、DU145增殖、生长、凋亡、二维迁移、侵袭能力及体内成瘤能力的影响。4.在上述PSMC2基因表达下调的PC-3细胞模型基础上,采用人类凋亡抗体阵列芯片检测凋亡相关蛋白,如凋亡前蛋白BIM、P21,抗凋亡蛋白HSP27、IGF-II、Survivin、STNF-R1、STNF-R2、TNF-β、TRAILR-4及XIAP等,设置阴性对照组与PSMC2敲减组,分析PSMC2表达改变对凋亡相关蛋白表达的影响,筛选PSMC2抗前列腺癌细胞凋亡的关键分子及互作网络。同时,结合文献调研与生信分析,筛选PSMC2在前列腺癌发挥生物学功能的可能信号转导通路,并采用Western blot检测各关键蛋白的表达,予以验证。5.构建PSMC2过表达的前列腺癌细胞模型,结合Akt抑制剂MK2206处理细胞,设置分组:Control-组:转染阴性对照序列细胞;PSMC2-组:PSMC2基因过表达模型细胞;Control+组:转染阴性对照序列细胞+MK2206处理;PSMC2+组:PSMC2基因过表达模型细胞+MK2206处理。采用Western blot检测PI3K/Akt信号转导通路关键蛋白Akt、p-Akt及凋亡明星蛋白分子Cyclin D1、CDK6的表达,观察PI3K/Akt通路抑制与PSMC2表达上调对前列腺癌细胞凋亡的影响。结果:1.免疫组化结果显示:PSMC2蛋白定位于细胞胞浆及细胞膜上,呈棕黄色。PSMC2蛋白阳性表达率及表达强度在前列腺癌组织中明显高于癌旁组织,且Gleason评分越高的肿瘤组织中PSMC2的表达也相对较高,表明PSMC2与前列腺癌Gleason分级呈正相关。Spearman秩相关分析显示PSMC2的表达与Gleason评分和等级之间的显着相关性。qRT-PCR结果显示PSMC2在前列腺癌细胞株PC-3、DU145和C4-2呈较高水平基础表达,背景表达量分别为:8.29±0.34、8.96±0.37、7.71±0.28。2.细胞模型构建验证结果显示:PC-3中,PSMC2敲减组细胞中PSMC2 mRNA表达较阴性对照组细胞明显减少,敲减率为73.3%,差异显着,具有统计学意义（0.268±0.021 VS 1.003±0.096,P<0.001）;PSMC2敲减组细胞中PSMC2蛋白表达较阴性对照组细胞明显减少,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。DU145中,PSMC2敲减组细胞中PSMC2 mRNA表达较阴性对照组细胞明显减少,敲减率为65.9%,差异显着,具有统计学意义（0.342±0.054 VS 1.004±0.097,P<0.001）;PSMC2敲减组细胞中PSMC2蛋白表达较阴性对照组细胞明显减少,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。3.Celigo细胞计数法细胞增殖实验结果显示:PSMC2基因敲减组细胞增殖倍数较对照组细胞明显降低,差异显着,具有统计学意义（P<0.001）。平板克隆实验结果显示:PC-3细胞中,PSMC2基因敲减组细胞克隆数（164±11）较对照组细胞（360±28）明显减少,差异显着,具有统计学意义（P=0.0028）;DU145细胞中,PSMC2基因敲减组细胞克隆数（210±13）较对照组细胞克隆数（527±6）明显减少,差异显着,具有统计学意义（p<0.001）。细胞划痕实验结果显示:PSMC2基因敲减组细胞划痕初期至24及48小时期间二维迁移距离较对照组细胞明显短,差异显着,具有统计学意义（P<0.001）。Transwell侵袭实验结果显示:PC-3细胞中,PSMC2基因敲减组侵袭细胞数（225±1.34）较对照组细胞凋亡率（659±2.22）明显减少,差异显着,具有统计学意义（P<0.001）;DU145细胞中,PSMC2基因敲减组侵袭细胞数（45±4.89）较对照组细胞克隆数（382±3.46）明显减少,差异显着,具有统计学意义（p<0.001）。流式细胞术细胞凋亡检测实验结果显示:PC-3细胞中,PSMC2基因敲减组细胞凋亡率（15.56±0.52）较对照组细胞凋亡率（4.22±0.26）明显增加,差异显着,具有统计学意义（P<0.001）;DU145细胞中,PSMC2基因敲减组细胞凋亡率（8.52±0.27）较对照组细胞凋亡率（3.63±0.46）明显增加,差异显着,具有统计学意义（p<0.001）。说明PSMC2具有抗前列腺癌细胞凋亡的作用。4.裸鼠成瘤实验结果显示:生长曲线示PSMC2基因敲减组裸鼠体内未见明显前列腺癌细胞成瘤组织形成,对照组裸鼠体内瘤体形成明显,差异显着,具有统计学意义（P<0.001）。活体成像系统在PSMC2基因敲减组裸鼠体内检测到极少前列腺癌细胞成瘤组织,但在对照组裸鼠体内检测到明显瘤体,差异显着,具有统计学意义（P<0.001）。处死裸鼠后取出瘤体,于PSMC2基因敲减组裸鼠体内未寻及明显瘤体,在对照组裸鼠体内寻及较多较大瘤体,差异显着,具有统计学意义（P<0.001）。免疫组化结果显示:在对照组裸鼠瘤体中检测Ki-67蛋白表达阳性,提示对照组种植的肿瘤细胞增殖良好,体内荷瘤结果可靠。体内研究进一步证明PSMC2的敲低可以显着抑制前列腺癌细胞的致瘤性。5.人类凋亡抗体阵列芯片结果显示:PSMC2基因敲减组细胞中凋亡前蛋白BIM和P21蛋白水平较对照组细胞明显上调,差异显着,具有统计学意义（P=0.0415,P=0.0127图3a）;抗凋亡蛋白HSP27、IGF-II、Survivin、STNF-R1、STNF-R2、TNF-β、TRAILR-4和XIAP则较对照组细胞模型下调,差异显着,具有统计学意义（P=0.0358,P=0.0374,P=0.0122,P=0.0335,P=0.0294,P=0.0338,P=0.0457,P=0.0070）。Western blot结果显示:PSMC2基因敲减组细胞中Akt、p-Akt、Cyclin D1、CDK6及PIK3CA蛋白水平较对照组细胞明显下调,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。6.Western blot结果显示:PSMC2基因过表达组细胞中p-Akt、Cyclin D1、CDK6蛋白水平较对照组明显上调;给予Akt抑制剂MK2206处理后,细胞中p-Akt、Cyclin D1、CDK6蛋白水平明显下调;在给予抑制剂处理的同时,上调PSMC2基因表达,细胞中p-Akt、Cyclin D1、CDK6蛋白水平较单独给予抑制剂处理组明显上调,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）;说明PSMC2依赖PI3K/Akt信号转导通路,通过促进Cyclin D1/CDK6的表达调控前列腺癌细胞的增殖与凋亡,从而促进前列腺癌发生与进展。结论:1.PSMC2在前列腺癌组织及前列腺癌细胞系中呈较高表达,其表达水平与前列腺癌临床病理特征密切相关,与前列腺癌Gleason分级呈正相关,是前列腺癌潜在的促癌基因;2.PSMC2具有促进前列腺癌细胞增殖、克隆形成、二维迁移、侵袭及体内成瘤,并抑制细胞凋亡。3.PSMC2可能是通过下调凋亡前蛋白BIM和P21蛋白表达及上调抗凋亡蛋白HSP27、IGF-II、Survivin、STNF-R1、STNF-R2、TNF-β、TRAILR-4及XIAP蛋白的表达,从而发挥抗前列腺癌细胞凋亡作用。4.PSMC2基因敲减后细胞中Akt、p-Akt、Cyclin D1、CDK6及PIK3CA蛋白表达减少,给予Akt抑制剂MK2206处理,细胞中Cyclin D1、CDK6蛋白表达降低,PSMC2过表达则可促进Cyclin D1、CDK6的表达并逆转Akt抑制剂的抑制作用;提示PSMC2通过PI3K/Akt/Cyclin D1/CDK6转导通路调控前列腺癌发生与进展。
张仲宁[2]（2018）在《MicroRNA-145在骨肉瘤侵袭转移及上皮间质转化中的作用和机制探讨》文中进行了进一步梳理背景骨肉瘤是人类最常见的原发性骨肿瘤。骨肉瘤恶性程度高,容易出现组织浸润和远处转移。近年来,随着手术技术、放化疗等医疗技术的发展,目前骨肉瘤的治疗多采用新辅助化疗联合保肢手术的综合性治疗。外科手术联合辅助化疗已使大多数无远处转移骨肉瘤患者的治愈率大大提高。但对于已经出现转移的骨肉瘤患者,虽然辅助化疗效果比较显着,但仍易出现肿瘤局部复发、恶化以及远处转移,导致患者预后差,5年生存率显着降低。因此,寻找靶向性更高、更加安全有效的治疗手段以控制骨肉瘤的转移,是骨肉瘤治疗的迫切要求。MiRNAs是一类具有高度遗传稳定性、高度保守的内源性非编码单链小RNA,长度约为18～25bp。通过互补配对结合至靶基因mRNA的3’端非翻译区（3’UTR）后,使靶基因mRNA发生降解,或者抑制靶基因mRNA的翻译过程,从而在转录后的表达水平对靶基因进行负向调控,进而参与调控各种复杂的细胞活动。研究表明,miRNAs的异常表达与骨肉瘤的增殖、转移和预后等生物学行为具有密切联系。例如,miR-199a-3p在骨肉瘤细胞中表达显着下调,如果上调其在骨肉瘤细胞中的表达,则可抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移;miR-21也参与骨肉瘤的发生和发展,其在人骨肉瘤组织显着高表达,通过调控RECK,可以促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭;miR-195可通过负向调控脂肪酸合成酶的表达,从而抑制骨肉瘤细胞系的迁移和侵袭。目前认为miRNA参与了肿瘤上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）。EMT被认为是肿瘤细胞发生侵袭转移的第一步,也是至关重要的一步。EMT主要表现为上皮细胞间失去紧密连接、细胞骨架重排、上皮细胞性标志物E-cadheirn减少、间质细胞性标志物N-cadherin和vimentin增多等,这些特点使肿瘤细胞的迁移能力得到了增强。MiR-145在多种组织中广泛表达,被认为是一种肿瘤的抑制基因。目前已在多种肿瘤组织中发现miR-145呈低水平表达,如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌等。miR-145可以通过与IRS-1基因的3’-UTR结合来下调IRS-1蛋白,从而抑制肿瘤细胞生长;通过直接作用于c-Myc,使肿瘤细胞阻滞于G1期,抑制细胞生长、促进细胞凋亡;通过下调RTKN,降低Rho的GTP结合活性,抑制细胞增殖。最新的研究发现miR-145不仅能够抑制肿瘤生长,而且能够抑制肿瘤细胞侵袭转移。研究目的1.揭示miR-145骨肉瘤组织和细胞系中的表达水平;2.研究miR-145对骨肉瘤细胞系侵袭转移和EMT发生的影响;3.阐明miR-145参与骨肉瘤EMT发生的分子机制。研究方法第一部分miR-145在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系中表达1.收集15例骨肉瘤组织和对应癌旁正常组织标本。2.荧光定量RT-PCR检测miR-145在15例骨肉瘤组织和对应癌旁正常组织标本中的表达水平。3.荧光定量RT-PCR检测miR-145在3种骨肉瘤细胞系U20S、MG63和SAOS2和正常人成骨细胞系hFOB中的表达水平。4.利用在先预测靶基因软件 Targetscan7.0（http://www.targetscan.org/）和PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/）预测 miR-145 可能的靶基因。5.荧光定量RT-PCR和免疫组化检测NEDD9在骨肉瘤组织和对应癌旁正常组织标本中的表达。6.利用Pearson法对骨肉瘤组织中miR-145和NEDD9的表达进行相关性分析。第二部分miR-145对骨肉瘤细胞侵袭转移和EMT发生的影响1.合成miR-145 mimics,利用Lipofectamine 2000转染至骨肉瘤细胞系MG63,以转染miRNAnegative control及未转染细胞分别作为阴性对照和空白对照。2.利用荧光定量RT-PCR检测转染后48h各组细胞miR-145 mRNA的水平。3.利用CCK8实验检测转染后细胞增殖能力的变化。4.利用Boyden Chamber侵袭小室实验检测转染后48h各组细胞的侵袭能力。5.利用划痕实验检测转染后48h各组细胞的迁移能力。6.利用荧光定量RT-PCR检测转染后48h各组细胞Snaill、E-cadherin、vimentin和 N-cadherin mRNA 的表达。7.利用 Western blot 检测转染后 48h 各组细胞 Snaill、E-cadherin、vimentin 和N-cadherin蛋白的表达。8.将转染miR-145 mimics的骨肉瘤细胞系MG63接种至裸鼠腋下部位,观察裸鼠移植瘤生长情况,以转染miRNA negative control及未转染细胞分别作为阴性对照和空白对照。9.利用荧光定量RT-PCR检测并比较各组瘤组织中Snail 1、E-cadherin、vimentin和 N-cadherin 的 mRNA 水平。10.免疫组化检测各组瘤组织中E-cadherin、vimentin和N-cadherin的蛋白表达。第三部分miR-145调控骨肉瘤细胞系MG63 EMT发生的机制研究1.利用双荧光素酶报告基因验证NEDD9是否为miR-145的靶基因。将NEDD93’-UTR 的野生型（NEDD9-3’UTR-Wt）和突变型（NEDD9-3’UTR-Mut）序列插入pmirGLO载体,构建荧光素酶报告基因重组质粒pmirGLO-NEDD9-3’-UTR-Wt/Mut,然后分别与 miR-145 mimics 或 miR-145 NC 共转染MG63细胞,检测各组细胞荧光素酶活性。2.转染 miR-145 mimics 或 miR-145 NC 至骨肉瘤细胞系 MG63,利用 Western blot检测NEDD9蛋白表达。3.转染NEDD9 siRNA至骨肉瘤细胞系MG63,以siRNAnegative和未转染细胞分别作为阴性对照和空白对照;利用荧光定量RT-PCR和Western blot检测各组细胞NEDD9、E-cadherin、Snaill、vimentin 和 N-cadherin mRNA 水平和蛋白表达;利用Boyden Chamber侵袭小室实验检测各组细胞的侵袭能力;利用划痕实验检测各组细胞的迁移能力。4.利用Rescue实验进一步明确miR-145是否通过NEDD9对骨肉瘤细胞MG63的发挥作用。转染miR-145 inhibitor的MG63细胞中转染NEDD9 siRNA或siRNA negative,利用荧光定量RT-PCR和Western blot检测各组细胞E-cadherin、Snaill、vimentin 和 N-cadherin mRNA 水平和蛋白表达。结果第一部分miR-145在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系中的表达1.荧光定量RT-PCR结果显示,相对于癌症正常组织,miR-145在骨肉瘤组织中的表达显着降低（p<0.05）。2.miR-145的表达与病人肿瘤远处转移具有相关性,差异有统计学意义（p<0.05）。miR-145 mRNA在有远处转移的瘤组织中表达明显高于无转移组。3.荧光定量RT-PCR结果显示miR-145在3种骨肉瘤细胞系U20S、MG63和SAOS2中的表达均明显低于其在正常人成骨细胞系hFOB中的表达（p<0.05）,且miR-145在侵袭转移能力高的骨肉瘤细胞系MG63中的表达又显着低于其在侵袭转移能力低的U20S和SAOS2中的表达。4.预测软件预测NEDD9为miR-145靶基因之一。5.骨肉瘤组织中NEDD9的表达明显高于其在癌旁正常组织中的表达,且在骨肉瘤组织中的表达与miR-145具有高度负相关性。第二部分miR-145对骨肉瘤细胞侵袭转移和EMT发生的影响1.荧光定量RT-PCR检测结果显示,骨肉瘤细胞系MG63转染miR-145 mimics后miR-145 mRNA水平与miR-145 NC组和脂质体处理组相比显着上调,差异具有统计学意义（p<0.05）。2.CCK8实验结果显示,与miR-145 NC组和脂质体处理组相比,转染miR-145 mimics组细胞增殖率在48h后出现明显的抑制（p<0.05）。3.转染miR-145 mimics组与miR-145 NC组和脂质体处理组相比,穿膜细胞数数显着降低,差异具有统计学意义（p<0.05）。4.划痕实验结果显示,miR-145 mimics转染组细胞划痕修复能力最弱,与miR-145 NC组和脂质体处理组相比,差异具有统计学意义（p<0.05）。5.miR-145 mimics转染组细胞中E-cadherin mRNA水平显着增高,而Snaill、vimentin和N-cadherin mRNA水平显着下降,与阴性对照组和空白对照相比差异有统计学意义（p<0.05）。6.Western blot结果显示,与对照组比较,miR-145 mimics转染组E-cadherin蛋白表达明显升高,而、vimentin和N-cadherin蛋白表达降低。7.裸鼠成瘤实验结果显示,miR-145 mimics转染组细胞接种的裸鼠肿瘤体积显着低于miR-145 NC组和脂质体处理组相比,差异有统计学意义（p<0.05）,并且肿瘤生长速度远远低于对照组。8.利用荧光定量RT-PCR检测显示,与对照组比较,miR-145 mimics转染组细胞接种的裸鼠肿瘤组织中E-cadherin mRNA水平增高（2.12±0.3）,而Snaill（0.63±0.02）、vimentin（0.57±0.02）和 N-cadherin mRNA（0.61 ±0.03）的mRNA水平均下降,差异具有统计学意义（p<0.05）。9.免疫组化结果显示,与对照组相比,miR-145 mimics转染组细胞接种的裸鼠肿瘤组织中E-cadherin蛋白表达升高,而vimentin和N-cadherin蛋白的表达均降低。第三部分miR-145调控骨肉瘤MG63细胞EMT发生的机制研究1.miR-145 mimics 和重组载体pmirGLO-NEDD9-3’-UTR-Wt 共转染的 HEK293T细胞荧光素酶基因活性与对照组相比（miR-145NC）显着降低（p<0.05）;而共转染 miR-145 mimics 和 pmirGLO-NEDD9-3’-UTR-Mut 的细胞萤光素酶基因活性与对照组相比（miR-145NC）无显着差异。2.转染NEDD9 siRNA后,骨肉瘤细胞系MG63中NEDD9的表达明显下降（p<0.05）,说明所设计的NEDD9 siRNA能有效抑制NEDD9的表达。同时E-cadherin mRNA及蛋白水平较对照组显着升高（p<0.05）,而Snaill、vimentin和N-cadherin mRNA及蛋白水平显着降低（p<0.05）。侵袭小室实验和划痕实验结果分别显示,NEDD9 siRNA转染组细胞侵袭能力和迁移能力也明显降低（p<0.05）。3.转染miR-145 mimics的骨肉瘤细胞系MG63中NEDD9的蛋白显着降低,与转染miR-145 NC的细胞相比,差异具有统计学意义（p<0.05）。4.Rescue实验结果显示在转染miR-145 inhibitor的MG63细胞再转染NEDD9.siRNA 可以部分挽救 miR-145 下降所导致的 EMT。miR-145 inhibitor+NEDD9 siRNA转染组E-cadherin mRNA及蛋白水平较miR-145 inhibitor转染组显着升高,而Snaill、vimentin和N-cadherin mRNA及蛋白水平显着降低（p<0.05）。结论1.miR-145在骨肉瘤组织中呈低表达。且miR-145在瘤组织中的表达水平与骨肉瘤的远处转移相关。2.miR-145在人骨肉瘤细胞系U20S、MG63和SAOS2中低表达显着,且miR-145在骨肉瘤细胞系中的表达高低与骨肉瘤细胞的侵袭能力强弱相关。3.骨肉瘤组织中NEDD9的表达显着上调,与miR-145水平具有高度负相关性。4.miR-145可抑制骨肉瘤细胞系发生EMT,从而抑制细胞的侵袭和转移能力。5.NEDD9是miR-145的靶基因,miR-145可通过与NEDD9 3’-UTR区结合调控其表达抑制骨肉瘤细胞EMT的发生,调控骨肉瘤细胞的侵袭转移。
张思胜[3]（2015）在《骨肉瘤类肿瘤干细胞诱导巨噬细胞M2表型分化的研究》文中研究说明目的：骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤,目前临床治疗以手术治疗为主,辅以放化疗,但治疗效果仍不理想。肿瘤干细胞学说认为肿瘤复发难治的根源在于肿瘤中存在着肿瘤干细胞,目前多数学者认为CD133和CD44为骨肉瘤类肿瘤干细胞表面标志。有研究表明肺腺癌类肿瘤干细胞表面β1,6分支N-糖链表达异常增加,而乳腺癌表面的β1,6分支N-糖链缺失可以诱导巨噬细胞发生M1型表型转换,使其发挥抗肿瘤作用。然而,p1,6分支N-糖在骨肉瘤中的作用却鲜有报道。基于此,本研究拟检测骨肉瘤类肿瘤干细胞表面N糖苷表达情况,并研究其对巨噬细胞表型转换的影响,以期进一步阐明骨肉瘤肿瘤免疫逃逸机制,为骨肉瘤的免疫治疗奠定基础。方法：1.通过无血清培养法培养小鼠骨肉瘤细胞株LM8,初步获得骨肉瘤悬浮细胞球,通过磁珠细胞分选的办法,通过二次阳性分选得到CD133及CD44双阳性的LM8细胞。通过流式细胞术检测分选后细胞表面CD133分子及CD44分子的表达情况。2.使用不同剂量的N糖基化抑制剂苦马豆素处理分选得到的骨肉瘤类肿瘤干细胞,通过凝集素结合实验检测细胞表面β1,6分支N-糖链的表达水平。3.获取小鼠骨髓细胞,加入GM-CSF诱导其中单核细胞向巨噬细胞分化,8日后流式细胞术检测细胞表面巨噬细胞表面特异性分子F4/80的表达水平。4.将不同浓度苦马豆素处理之后的骨肉瘤类肿瘤干细胞与小鼠骨髓来源的巨噬细胞共同培养,荧光实时定量PCR法检测巨噬细胞中iNOS和Arg-1的RNA表达水平,精氨酸酶活性检测试剂盒检测巨噬细胞培养上清中精氨酸酶活性,ELISA法检测巨噬细胞培养上清中TNF-a和IL-10含量。结果：1.流式细胞术检测结果表明,通过无血清培养初步分离后再进行磁珠分选得到的的细胞中CD133和CD44双阳性细胞比例为96.5±1.2%。该结果表明我们成功分离得到骨肉瘤类肿瘤干细胞。2.凝集素结合实验显示,骨肉瘤类肿瘤干细胞与L-PHA具有更高的结合率,达90.3±2.1%,高于LM8细胞的结合率54.3±3.1%,差异具有统计学意义（P<0.05）。用lmg/mL的苦马豆素处理骨肉瘤类肿瘤干细胞后,细胞表面β1,6分支N-糖链的表达阳性率为90%,用5mg/mL的苦马豆素处理骨肉瘤类肿瘤干细胞后,细胞表面β1,6分支N-糖链的表达阳性率为21%,以上结果表明随着苦马豆素剂量的增加,骨肉瘤类肿瘤干细胞表面β1,6分支N-糖链的表达阳性率降低。3.流式细胞术检查结果显示,骨髓来源巨噬细胞经过诱导培养8天后,F4/80阳性细胞率为95.4%,表明骨髓来源巨噬细胞培养成功。4.骨肉瘤类肿瘤干细胞与骨髓巨噬细胞共培养48小时后,与单独巨噬细胞相比,共培养后的巨噬细胞内Arg-1的mRNA表达量上升（40±2.6% v.s.4±2.6%,P<0.05）, iNOS mRNA表达量无显着差异（12±1.3% v.s.8±4.6%,P>0.05）,共培养上清中IL-10含量上升（150±6.8pg/mL v.s.50±3.8pg/mL, P<0.05）, TNF-a含量无显着差异（50±3.3pg/mL v.s.55±4.8pg/mL, P>0.05）,该结果表明与骨肉瘤类肿瘤干细胞培养后,巨噬细胞中M2型标记分子Arg-1和IL-10表达上升,M1型标记分子iNOS与TNF-a表达无显着变化,表明骨肉瘤类肿瘤干细胞诱导巨噬细胞向M2型分化。当我们用苦马豆素（1mg/mL）处理后的骨肉瘤类肿瘤干细胞与骨髓巨噬细胞共孵育后,与未处理的骨肉瘤类肿瘤干细胞相比,巨噬细胞中M2型标记分子Arg-1（12±3.1%v.s.40±2.6%, P<0.05）和IL-10（90±4.4 pg/mL v.s.150±6.8 pg/mL,P<0.05）表达下降,M1型标记分子iNOS（50±2.1%v.s.12±1.3%, P<0.05）TNF-a与（240±8.1pg/mL v.s.50±3.3pg/mL, P<0.05）表达上升,且该变化随着苦马豆素浓度的提高而进一步增强。结论：骨肉瘤类肿瘤干细胞表面高表达β1,6分支N-糖链,苦马豆素可以降低其细胞表面β1,6分支N-糖链的表达。骨肉瘤类肿瘤干细胞可以诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞向M2型分化,当用苦马豆素降低骨肉瘤类肿瘤干细胞表面N糖苷的表达后其诱导巨噬细胞向M2型分化的能力减弱。针对β1,6分支N-糖链合成的各类抑制剂,如苦马豆素,有望成为一种新的治疗骨肉瘤的辅助药物。
王少林,谭祖键,周明全[4]（2013）在《恶性骨肿瘤血管生成拟态研究进展》文中认为骨肉瘤、Ewing’s肉瘤和软骨肉瘤等恶性骨肿瘤多为高度血管化肿瘤,严重危害青少年患者,病死率高。虽然包括手术和化疗在内的综合治疗改善了这些患者的预后,但相当一部分患者还是很快发生转移,而这正是主要的死因。恶性骨肿瘤具有多种维持和增加血供的机制,因而使得肿瘤生长及转移。研究表明,人类的恶性骨肿瘤可以在无血管状态下发生,其最初的原位癌阶段存在一个很长的无症状休眠期,此期的一个重要特征是血管新生受阻且肿瘤体积仅有几个
张汉阳[5]（2012）在《LIMK1在骨肉瘤多药耐药中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理骨肉瘤是临床上一种儿童以及青少年常多发的最常见的恶性骨肿瘤，其数量可占原发的恶性骨肿瘤的30%左右，骨肉瘤因其进展迅速，预后较差而成为恶性程度很高的一种恶性肿瘤。随着医疗水平的提高，骨肉瘤的治疗策略主要是手术治疗辅之以放、化疗，多种药物联合化疗的治疗方案的实施会很大的提高骨肉瘤患者的治疗效果，然而骨肉瘤细胞多药耐药（Multidrug resistance, MDR）的出现成为了化疗成功的主要障碍。所以，现在医务工作者对骨肉瘤的耐药性研究成为了一个热点。本研究以体外培养的人成骨肉瘤细胞系—MG63细胞为对象，应用临床治疗骨肉瘤的常用药物长春新碱，采用小剂量浓度递增的方法，经过长期诱导成功建立了人骨肉瘤多药耐药细胞系MG63/VCR，并对其生物学特性进行了分析和鉴定。在此基础之上，我们发现LIMK1及其下游通路分子P-Cofilin在骨肉瘤多药耐药细胞中呈高表达，并且通过基因转染技术验证了LIMK1在骨肉瘤多药耐药细胞迁移和多药耐药中的作用。最后通过RT-PCR、RealTime-PCR及Westernblot等方法检测LIMK1与P-gp表达及功能的关系，以及LIMK1调节药物引发的细胞凋亡的作用，进一步阐明LIMK1编码基因在骨肉瘤多药耐药形成中的作用及其机制，使我们更全面、深入地理解和认识骨肉瘤产生多药耐药的过程及发生及调节机制，为骨肉瘤多药耐药的逆转研究提供依据。
王京亮[6]（2012）在《去甲二氢愈创木酸体外抗骨肉瘤作用的实验研究》文中研究指明骨肉瘤是恶性骨肿瘤中最常见的一种,发病年龄多在10-25岁,严重威胁儿童和青少年的健康。骨肉瘤对放射治疗不敏感,主要采取手术联合化疗的手段进行治疗,骨肉瘤的化疗疗效得到肯定始于20世纪70年代,1982年提出新辅助化疗的概念,使骨肉瘤的保肢手术取代了常规截肢术。目前临床治疗骨肉瘤的化疗药物仍以阿霉素、顺铂和大剂量的甲氨蝶羚为主,其他还有近年来应用的异环磷酰胺等。虽然化疗在骨肉瘤的治疗中具有举足轻重的作用,但骨肉瘤化疗的总体有效率仍徘徊在70%左右。制约其疗效的主要因素有两方面,一是高剂量强度所导致的严重的毒副作用,由于化疗药物个体差异较大,有效剂量与中毒剂量十分接近,因此相同剂量对于不同个体可能发生严重的粒细胞和（或）血小板下降。二是肿瘤细胞原发或继发耐药问题,也是化疗失败的主要原因。因此有人因骨肉瘤的原发耐药问题质疑新辅助化疗。有研究指出,多药耐药是骨肉瘤化疗失败的主要原因。多药耐药基因产物P糖蛋白的表达与化疗失败有显着的相关性,P糖蛋白高表达是多药耐药的主要机制,P糖蛋白可通过它的疏水位点与疏水性抗肿瘤药物结合,由ATP供能,逆浓度梯度将药物泵出细胞外,导致细胞内药物浓度降低而产生耐药。研究表明, P糖蛋白的高表达合并肿瘤体积较大和发病年龄偏低,提示肿瘤复发率高。目前使用的肿瘤化疗药物存在副作用大和肿瘤细胞易产生耐药性等缺陷,因而从天然化合物中寻找低毒、高效的抗癌药物对于成骨肉瘤的治疗有重要意义。因而开发新的高效低毒的抗骨肉瘤药物或新的化疗增效药,是目前骨肉瘤治疗中的重要课题。去甲二氢愈创木二酸（Nordihydroguaiaretic acid, NDGA）是木质素类雌激素活性物质,其生物学雌激素效应相当于17β-雌二醇效力的1/104了,约占茶叶干重的7%-8%,以常青灌木Larrea divaricata中含量最为丰富。去甲二氢愈创木酸具有抗炎,增强机体免疫力等多种生物学效应,被广泛的用作医药和化妆品原料。NDGA来源于天然物质,近年被证实具有抗肿瘤作用,裸鼠实验证明其在有效剂量范围内毒性反应小,开发NDGA作为抗肿瘤药品具有重要的现实意义和广阔的应用前景。通过裸鼠药物毒性评价实验检测各组指标发现用药后体重均有增加,其增长幅度与对照组相似,无明显差异,裸鼠的外观、色泽、大便、活动等均正常,未见明显的毒副作用,无毒性效应。NDGA能阻止乳腺癌、肝癌、肺癌、大肠癌及胶质瘤等多种肿瘤的发生和抑制其细胞的增殖,但是对骨肉瘤作用的研究还未见报道。肿瘤发生是遗传因素、环境因素共同作用导致细胞内信号通路失调的过程。在肿瘤发生早期,环境中致癌物或非致癌物等引起细胞代谢反应失调,随后信号通路失调,最终引起遗传变异和自由生长,导致肿瘤发生。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（The mammalian target of rapamycin,mTOR）是一种高度保守的的丝/苏氨酸蛋白激酶,属于磷酸肌醇3激酶相关激酶家族。mTOR信号通路整合来自细胞内外的各种信号,调节细胞的代谢、生长增殖及存活等生理活动。mTOR在细胞内通过与其它分子形成复合物而保持生物学活性,目前认为主要有两种复合物：（1） mTORC1,由mTOR、Raptor、mLST8/G L和PRAS40组成。mTORC1能够被雷帕霉素（rapamycin, Rap）抑制,接受生长因子、营养及能量、氧应激等刺激,通过磷酸化下游底物4E-BP1和p70-S6K来调节蛋白质翻译与合成。（2）mTORC2,由mTOR、mLST8/G L、rictor、mSin1、 PRR5/Protor组成。mTORC2对雷帕霉素不敏感,通过磷酸化下游底物Akt来调节生长因子信号通路。由于遗传变异或者环境因素等原因,导致PI3-k/Akt通路失调,mTOR信号通路在肿瘤发生过程中过度活化,促进了细胞增殖、生长、分化和存活。目前mTOR信号通路在骨肉瘤发病过程中的作用尚缺乏足够的研究,能否针对mTOR信号通路开发新的抗骨肉瘤新药还待于研究。研究目的：1.探讨NDGA是否具有抗骨肉瘤作用;2.探讨NDGA抗骨肉瘤作用的mTOR机制。研究方法：采用U20s、MG63、Saos三种骨肉瘤细胞系,用MMT、克隆形成实验检测药物对肿瘤生长抑制的作用；CCK-8法、细胞划痕试验和transwell小室模型分别测定药物对肿瘤黏附力、迁移力和侵袭力影响,用流式细胞技术进行细胞周期分析、凋亡率的测定,用荧光染色评估肿瘤凋亡的形态学改变；用Western blot法检测药物对肿瘤细胞mTOR通路蛋白、凋亡标志蛋白caspase3、细胞周期素蛋白cyclin Dl等的影响。结果：1. NDGA对骨肉瘤细胞具有抑制增殖的作用MTT检测结果显示,10μmol/L NDGA对骨肉瘤的增殖没有抑制作用,但从20gmol/L开始NDGA对骨肉瘤细胞具有明显的生长抑制作用,且呈时间和剂量依赖性。相同作用时间条件下,20、50、100μmol/L NDGA作用组间的比较表明,NDGA对骨肉瘤细胞的生长抑制作用随浓度的增加而增强；相同作用浓度条件下,24、48和72h各组间相比表明,NDGA对骨肉瘤细胞的生长抑制作用随处理时间的延长而增强。2. NDGA抑制骨肉瘤细胞克隆形成与对照组比较,不同浓度（10μmol/L,20μmol/L、50μmol/L）的NDGA对骨肉瘤细胞克隆形成均有抑制作用,细胞克隆形成率随NDGA浓度升高而下降,NDGA浓度高于L时细胞生长缓慢,每个克隆包含的细胞数目少,且随生长时间增加未再出现新增殖细胞,实验结束时存活细胞数量少、活力低下,几乎处于静止期；对照组及不同浓度处理组克隆形成率分别为25.5%、17.5%、7.5%、0.75%；各组克隆形成率均有显着差异,P<0.05。3. NDGA抑制骨肉瘤细胞黏附NDGA可以显着抑制骨肉瘤细胞在纤连蛋白（Fn）的黏附。（10、20、50、100、150μmol/1）的NDGA作用24h后,黏附率分别为98.8±1.9%,86.9±2.0%,65.7±0.7%,32.8±0.8%和5.6±0.5%,20μmol/1以上的NDGA处理组与对照组比较有显着性差异（P<0.05）。4. NDGA抑制骨肉瘤细胞迁移划痕实验显示：10、20、50、100pmol/l的NDGA作用48h后,可见NDGA能明显抑制骨肉瘤细胞的迁移,呈剂量依赖性；随着NDGA的浓度增大,骨肉瘤细胞向划痕区移动的距离越来越小,随着药物浓度增加迁移至划痕区的细胞逐渐减少,划痕增宽,高剂量组仅有少许细胞迁移至划痕区；20μmol/l的NDGA可以使骨肉瘤细胞迁移能力基本丧失,但NDGA浓度高于50μmol/l时细胞大量死亡。5. NDGA抑制骨肉瘤细胞侵袭不同浓度NDGA处理的处理48h后,骨肉瘤骨肉瘤细胞侵袭穿透Matrigel胶和Transwell小室微孔膜的能力明显下降,实验组穿膜细胞数目随着药物浓度增加明显减少,对照组、30、50、100μmol/1组的穿膜细胞数目分别是（234.3±9.2）,（82.0±3.0）,（39.0±3.0）,（12.3±1.5）,各处理组与对照组比较有显着性差异（P<0.05）。说明NDGA以剂量依赖的方式抑制骨肉瘤细胞的浸润侵袭能力。6. NDGA诱导骨肉瘤细胞周期阻滞不同浓度NDGA（20、50和100μmol/L）作用骨肉瘤细胞24h后,细胞周期发生明显改变。流式细胞仪检测结果表明,NDGA作用后,Mg63, U2os骨肉瘤细胞周期被阻滞于G0/G1期,且该效应在50μmol/L后趋于明显,在100μmo1/L浓度时效应最大,处于S期细胞所占比例的明显下降,但在Saos-2细胞,NDGA使骨肉瘤细胞周期被阻滞于S期。7. NDGA诱导骨肉瘤细胞凋亡不同浓度NDGA （100、150和200μmol/L）作用骨肉瘤细胞24h后,骨肉瘤细胞发生凋亡改变。流式细胞仪检测结果表明,100μmol/L NDGA作用后,骨肉瘤细胞主要出现早期凋亡,但150μmol/L以上的NDGA引起骨肉瘤细胞晚期凋亡。8. NDGA下调mTOR信号通路蛋白的活性NDGA作用骨肉瘤细胞24h后,Western blotting检测可见,NDGA浓度高于50μmol/L时mTOR信号通路下游底物磷酸化4E-BP1和S6水平与对照组相比明显下调,但在低浓度（20μmol/L以下）时mTOR信号通路蛋白没有明显降低,甚至轻微上调。而NDGA高于100μmol/L时可以抑制Akt的磷酸化,NDGA不但抑制mTORC1信号通路蛋白的表达,而且抑制mTORC2信号通路蛋白活化。结论：本研究发现了NDGA抑制骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、黏附、迁移、侵袭,并诱导肿瘤细胞周期阻滞和凋亡,其抗骨肉瘤机制之一可能是通过抑制骨肉瘤mTORC1和mTORC2信号通路的活性,提示NDGA是一种很有发展前景的抗癌新药,同时进一步证明了mtor通路影响骨肉瘤的发生发展的理论,为NDGA的临床应用提供了实验依据。
黄建军[7]（2010）在《ROR2在骨肉瘤组织及细胞中的表达及其对骨肉瘤细胞生物学行为影响的初步研究》文中认为骨肉瘤（Oseteosarcoma）是除浆细胞瘤外最常见的恶性骨原发性肿瘤,其组织学特点是在多数情况下肿瘤细胞产生骨样或不成熟骨。骨肉瘤发病率各国统计数字差异较大,约1/10万—0.1/10万。骨肉瘤易于侵及生长迅速的干骺端,其典型的位置是在长管状骨,股骨远端及胫骨、肱骨的近端是最常见的发病部位,全部病人的50%—70%病变发生在膝关节周围。虽然骨肉瘤在各年龄组均有报道而且其发病率低于其他常见恶性肿瘤,但由于该病好发于青少年长骨时期,有研究证实75%的骨肉瘤于10岁—30岁人群发病。起病时无明显的临床症状,极易与外伤混淆,且恶性程度高早期即可能发生肺转移,故其危害性大死亡率很高。临床骨科工作者一直致力于对其防治的研究,希望寻找到骨肉瘤精确有效治疗的靶点。ROR2 （Receptor Tyrosine Kinase-like Orphan Receptor）全称为受体酪氨酸激酶样孤核受体2,其属于受体酪氨酸激酶家族（RTKs）,此激酶家族成员在动物发育的形态发生及组织分化过程中具有重要意义。它们参与调节细胞增殖、分化、粘附、迁移以及凋亡等多种细胞功能。ROR受体属于受体酪氨酸激酶家族中的孤核受体一类,在进化上非常保守。在哺乳动物其包含两种结构上相关的蛋白ROR1和ROR2。已有的研究证实ROR2在面部、四肢、心脏、大脑及肺等重要器官和组织中均有表达,对于神经系统和骨骼的发育具有重要作用。其在中枢神经系统可调节轴突的生长。在人类, ROR2基因的纯合子型突变可导致Robinow综合症,此种病症表现出多种骨骼发育不良：身材矮小、全身肢体短小、脊柱部分节段缺失及面部骨骼畸形。ROR2基因的杂合子型突变与以手指及足趾远节缺失为特征的brachydactyly type B综合症有关。在小鼠,ROR2基因的缺乏可导致侏儒症、肢体及尾巴短小、面部畸形、心室间隔缺损以及引起新生儿死亡的呼吸功能障碍。已有的研究显示ROR2可促进成骨细胞的增殖和分化,Real-time RT-PCR检测显示ROR2在人类骨髓间质干细胞中无表达,随其的成骨分化逐渐增高,而当其分化为定型的前成骨细胞时ROR2的表达达到峰值,而后又迅速下降并在正常骨细胞中表达消失。ROR2受体通过二聚化而激活可促进人类间质干细胞的成骨转化并在组织培养期间增加新的骨形成。ROR2在小鼠体内试验时也表现出很强的促进骨形成的能力。以上结果均提示ROR2在骨骼的发育过程中具有重要作用。而且研究证实ROR2对于骨骼发育的影响主要是通过与WNT家族蛋白结合,调节经典或非经典WNT信号通路来实现。有研究显示ROR2与某些肿瘤的发生存在一定的关系。例如其在黑色素瘤组织中有较强的表达,还有研究证实ROR2是Hela宫颈癌细胞的促存活激酶。最新的研究显示在口腔鳞状细胞癌中发现ROR2的增强表达而且ROR2的高表达与其恶性程度相关以及ROR2可促进肾细胞恶性肿瘤的生长。ROR2与肿瘤之间的关系均与其可与Wnt蛋白结合,激活或调整某一WNT信号通路有关。而最近的研究显示WNT通路在放射诱导的的骨肉瘤中具有转录活性。同时WNT/β连环蛋白通路的拮抗剂姜黄素和PKF118-310在人类骨肉瘤细胞实验中显示了抗肿瘤活性。而且2008年有学者研究证实特异性酪氨酸激酶抑制剂（包括表皮生长因子受体抑制剂、胰岛素样生长因子-1受体抑制剂及met抑制剂等）可在体外抑制骨肉瘤细胞的活动能力、集落形成和侵袭能力。此结果显示酪氨酸激酶可能调节骨肉瘤的形成及转移,其可能成为骨肉瘤治疗的新靶点。ROR2作为酪氨酸激酶家族成员的身份、其在部分肿瘤中的表达及其生物学行为、骨肉瘤的成骨特性和ROR2对于骨骼发育的影响及其通过WNT信号通路调节成骨细胞增殖及分化的生物学特点使得我们怀疑ROR2可能在骨肉瘤的发生发展过程中具有一定的作用,其可能促进了骨肉瘤的发生发展及恶性生物学行为。因此,ROR2可能成为骨肉瘤新的治疗靶点。针对ROR2和骨肉瘤关系的研究将为骨肉瘤的发病机制研究和治疗靶点选择提供一条全新的思路。第一部分：ROR2在骨肉瘤组织及细胞中的表达及意义目的：研究ROR2在骨肉瘤组织及细胞中的表达情况,探讨其表达的临床意义。方法：使用Western-bloting实验方法检测4例骨肉瘤和3例骨软骨瘤患者新鲜原发灶标本中ROR2表达情况；使用免疫组化方法检测55例骨肉瘤患者和15例骨软骨瘤患者原发灶标本中ROR2表达情况并结合患者临床资料了解其临床意义；使用RT-PCR实验方法检验SaoS-2骨肉瘤细胞中ROR2mRNA表达情况。结果：①通过免疫组织化学的方法检测55例骨肉瘤患者标本中有39例患者标本有ROR2阳性表达,其阳性表达率为70.91%,检测的15例骨软骨瘤患者标本有3例ROR2阳性表达,阳性表达率为20.00%,两者阳性表达率有显着性差异（x2=12.73 P<0.05）。②通过Western-bloting实验检测新鲜骨软骨瘤和新鲜骨肉瘤组织中ROR2蛋白表达的结果显示两者标本中ROR2蛋白表达有显着性差异（P<0.05）。③通过RT-PCR实验检测了SaoS-2骨肉瘤细胞株中ROR2基因表达情况,结果显示其内有ROR2基因表达。④检测了有或无转移的骨肉瘤患者肿瘤标本中ROR2表达的结果显示在有转移的患者标本中ROR2的阳性表达率为100.00%,而在无肿瘤转移患者标本中ROR2阳性表达率为61.91%,两者表达阳性率有显着性差异（X2=5.26P<0.05）。⑤检测Ennecking分期分别为I期、Ⅱ期、Ⅲ期的骨肉瘤患者肿瘤标本中ROR2表达的结果显示ROR2在骨肉瘤Enneking分期Ⅰ期表达阳性率为22.22%（2/9）,Ⅱ期表达阳性率为72.73%（24/33）,Ⅲ期表达阳性率为100.00%（13/13）。Ⅰ期与Ⅱ期间有显着性差异（X2=5.66 P<0.05）,Ⅰ期与Ⅲ期间有显着性差异（x2=11.46P<0.05）,而Ⅱ期与Ⅲ期间无显着性差异（X2=2.85 P>0.05）。结论：①ROR2基因和蛋白在骨肉瘤细胞及组织中有较强表达,而且其可能影响骨肉瘤的生物学行为。第二部分：小干扰RNA对骨肉瘤细胞株ROR2基因及蛋白表达水平的影响目的：研究小干扰RNA对骨肉瘤细胞株ROR2基因及蛋白表达水平的影响方法：使用化学合成法构建针对ROR2的小干扰RNA,通过脂质体法将其转染入骨肉瘤细胞株。使用RT-PCR和Western-bloting实验方法检验其对ROR2基因及蛋白表达水平的影响。结果：①通过测序和酶切证实成功构建了针对ROR2的小干扰RNA；②通过RT-PCR实验检测了干扰前后SaoS-2骨肉瘤细胞株中ROR2基因表达情况,转染后干扰组ROR2 mRNA的表达水平（0.19±0.02）明显低于阴性对照组（0.55±0.04）和空白组（0.58±0.04）,干扰组和阴性对照组比较有显着性差异（t=13.71,P<0.05）,干扰组和空白组比较有显着性差异（t=14.86,P<0.05）,而空白组和阴性对照组之间无显着性差异（t=1.24,P>0.05）。③通过Western-bloting实验检测了干扰前后SaoS-2骨肉瘤细胞株中ROR2蛋白表达情况,转染后干扰组ROR2蛋白的表达水平（0.18±0.03）明显低于阴性对照组（0.66±0.04）和空白组（0.84±0.03）,干扰组和阴性对照组比较有显着性差异（t=7.61,<0.05）,干扰组和空白组比较有显着性差异（t=6.37,P<0.05P）,而空白组和阴性对照组之间无显着性差异（t=0.31,P>0.05）。。结论：①成功地合成了ROR2 siRNA并将其转染入SaoS-2骨肉瘤细胞；②在国内首次发现ROR2 siRNA能下调SaoS-2骨肉瘤细胞ROR2基因和蛋白的表达水平。第三部分：ROR2对骨肉瘤细胞增殖及侵袭力的作用目的：研究ROR2对骨肉瘤细胞增殖及侵袭力的影响,证实其在骨肉瘤中的生物学作用方法：通过细胞流式检验、Brdu标记实验和transwell侵袭实验了解ROR2 RNA干扰后骨肉瘤细胞增殖和侵袭力的变化。结果：①细胞流式检测示RNAi后干扰组细胞中S期细胞所占百分比（12.40±4.85）明显低于阴性对照组（31.23±2.21）和空白组（26.50±2.07）,干扰组和阴性对照组比较有显着性差异（t=6.12,P<0.05）,干扰组和空白组比较有显着性差异（t=4.63,P<0.05）,而空白组和阴性对照组之间无显着性差异（t=2.71,P>0.05）。RNAi后干扰组细胞中G1期细胞所占百分比（81.47±6.56）明显高于阴性对照组（57.87±4.65）和空白组（63.07±4.92）,干扰组和阴性对照组比较有显着性差异（t=5.09,P<0.05）,干扰组和空白组比较有显着性差异（t=3.86,P<0.05）,而空白组和阴性对照组之间无显着性差异（t=1.32,P>0.05）。②Transwell侵袭实验示RNAi后干扰组侵袭细胞数（20.40±11.93）明显低于阴性对照组（37.80±6.83）和空白组（44.00±7.81）,干扰组和阴性对照组比较有显着性差异（t=3.70,P<0.05）,干扰组和空白组比较有显着性差异（t=2.83,P<0.05）,而空白组和阴性对照组之间无显着性差异（t=1.34,P>0.05）。③Brdu标记实验结果示RNAi后干扰组标记指数（0.14±0.03）明显低于阴性对照组（0.32±0.02）和空白组（0.28±0.03）,干扰组和阴性对照组比较有显着性差异（t=5.18,P<0.05）,干扰组和空白组比较有显着性差异（t=6.70,P<0.05）,而空白组和阴性对照组之间无显着性差异（t=2.34,P>0.05）。结论：在国内首次证实ROR2 RNAi下调ROR2表达可明显抑制SaoS-2骨肉瘤细胞的增值和侵袭能力,揭示ROR2对骨肉瘤的增值和侵袭等生物学行为有重要影响,其可能为骨肉瘤发病机制研究和特异性治疗提供新的思路和靶点。
娄楠[8]（2010）在《人成骨肉瘤细胞系中高侵袭及类肿瘤干细胞亚系的建立》文中提出本研究以体外培养的人成骨肉瘤细胞系—MG63细胞为对象,应用有限稀释法进行单细胞分离和单克隆细胞株的培养,成功建立MG63骨肉瘤单克隆细胞株20余个。根据细胞形成的克隆形态,选取其中的完全克隆进行ALP、OCN、OPN等一系列成骨分化标志物基因表达的检测,同时检测各组细胞生物学行为指标,包括肿瘤细胞成瘤、侵袭、迁移、铺展粘附等,发现具有高低不同转移能力和成瘤能力的单克隆细胞株之间在部分成骨细胞标志物、肿瘤转移及促血管形成因子等基因表达具有显着差异。说明检测骨肉瘤细胞成骨分化标志物的基因表达差异可以判断肿瘤的分化程度。进一步通过RT-PCR、RealTime-PCR及Western blot等方法对它们的侵袭能力进行检测,发现高低不同转移能力的细胞株的Cofilin、Limk1基因及蛋白表达存在显着差异,说明Cofilin介导的信号通路在人成骨肉瘤细胞的侵袭、转移等行为中发挥极为重要的作用。最后本实验选取集落形成能力最强的Holoclone细胞株,利用无血清悬浮成球的方式分离出类肿瘤干细胞亚系---MG63-M,并在无血清培养环境中加入低浓度长春新碱,进一步富集、纯化。经RT-PCR、免疫荧光及流式细胞术等检测发现其表达CD133、Oct4、nestin等干细胞表面标志物,同时高表达Mdr1、ABCG2等多药耐药基因。另外,体外实验和动物实验都表明MG63-M不但具有与正常干细胞相似的自我更新和多项分化能力,同时具有极强的致瘤能力和极为显着的多药耐药性。本实验进一步验证了骨肉瘤异质性学说和肿瘤干细胞学说,为早期判断骨肉瘤侵袭及转移能力,克服骨肉瘤的多药耐药提供了新的理论基础和实验依据。
许自力[9]（2009）在《RNAi技术干扰骨肉瘤细胞Dll4表达抑制侵袭转移和血管生成的体内外实验研究》文中提出目的:探讨Dll4在骨肉瘤组织的表达及意义;靶向沉默Dll4的表达对骨肉瘤侵袭转移和血管生成的作用机制。方法:（1）采用免疫组化的方法检测62例骨肉瘤组织中Dll4蛋白的表达,结合临床病理资料分析,研究Dll4的表达与临床病理特征的关系。（2）构建全长的逆转录病毒pSUPER-Dll4-siRNA质粒,通过鉴定后,将其稳定转染到PT67细胞培养,获得分泌Dll4蛋白病毒血清,干预沉默人骨肉瘤细胞株SOSP-9607E10中Dll4的表达;干预沉默人微血管内皮细胞系（HMEC-1）,体外采用划痕实验、Transwell侵袭实验、血管成管实验、MTT和流式细胞仪检测等方法,研究Dll4调控骨肉瘤细胞分化增殖、骨肉瘤侵袭运动和骨肉瘤血管成管的分子机制验证Dll4调控骨肉瘤血管成管的分子机制导致肿瘤生物学行为的改变。结果:（1）Notch1、Dll4在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达Notch1蛋白的阳性表达主要在肿瘤细胞的细胞质或细胞膜,呈棕黄色,散在分布。62例骨肉瘤中有53例呈阳性表达,阳性率为85.5%（53/62）,对照组为21.2%（9/43）,两组差异具有显着性（P＜0.05）。Dll4蛋白的阳性表达主要在肿瘤细胞的细胞质或细胞膜,部分表达在血管内皮细胞。62例骨肉瘤中有55例呈阳性表达,阳性率为88.7%（54/62）,对照组为23.6%（10/43）,两者之间差别具有显着性（P＜0.05）,Notch1和Dll4在骨肉瘤中的表达高于在骨软骨瘤中的表达,提示Notch1和Dll4可能参与了骨肉瘤的发生、发展。（2）.Notch1、Dll4表达及其与骨肉瘤病理临床指标的关系Notch1与Dll4在骨肉瘤中表达存在正相关关系,相关系数rs为0.842,P=0.027。Notch1及Dll4蛋白表达与骨肉瘤组织分化程度、Ennecking分期和有无转移密切相关（P＜0.05）,但与肿瘤直径、性别、年龄、ALP（碱性磷酸酶）无关（P＞0.05）。（3）骨肉瘤中Notch1和Dll4表达与MVD表达的关系Notch1高表达组MVD为35.2±9.3,显着高于低表达组28.3±3.4,此外,Dll4高表达组MVD为36.2±7.2,显着高于低表达组29.5±2.2,差别具有显着性（P＜0.05）。骨肉瘤中Notch1和Dll4表达与MVD表达的具有相关性（P＜0.05）,Notch1及Dll4蛋白高表达可能在骨肉瘤血管生成进程中起重要作用。（4）Dll4的表达与骨肉瘤的侵袭转移潜能密切相关Dll4 mRNA和蛋白在SOSP-9607H9及SOSP-9607E10两株细胞中的表达。结果显示:在SOSP-9607H9及SOSP-9607E10两个骨肉瘤细胞株细胞中,Dll4 mRNA和蛋白表达水平分别0.43±0.11 vs0.86±0.09、0.47±0.05vs 0.82±0.08,具有显着性差异（P＜0.05）。（5）逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性沉默SOSP-9607E10癌细胞系中Dll4的表达SOSP-9607E10Dll4RNAi+中Dll4的表达被明显抑制,较对照组而言,其抑制效率超过70%（P＜0.05）,而作为对照的SOSP-9607E10Dll4RNAi-中Dll4的表达较SOSP-9607E10细胞系无明显变化。以上结果提示本研究中采用逆转录病毒介导的小RNA干扰能够有效特异的沉默SOSP-9607E10骨肉瘤细胞中Dll4的表达。（6）体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制骨肉瘤细胞的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡SOSP-9607E10Dll4RNAi+较SOSP-9607E10Dll4RNAi-细胞迁移能力明显下降,24小时划痕愈合率分别为62%vs 77%,差异具有显着性意义（P＜0.05）。采用Transwell侵袭小室测定法比较SOSP-9607E10Dll4RNAi+和SOSP-9607E10Dll4RNAi-的侵袭能力,结果显示SOSP-9607E10Dll4RNAi+和SOSP-9607E10Dll4RNAi-细胞侵袭能力明显下降,24小时培养后穿过Transwell的每低倍视野细胞数分别为63±11 vs129±13,差异具有显着性意义（P＜0.05）。用MTT法比较SOSP-9607E10Dll4RNAi+和SOSP-9607E10Dll4RNAi-的增殖能力,差异不具有显着性意义（P＞0.05）。检测SOSP-9607E10Dll4RNAi+和SOSP-9607E10Dll4RNAi-的凋亡情况,两组细胞差异不具有显着性意义（P＞0.05）。（7）体内抑制Dll4的表达可以抑制骨肉瘤细胞的成瘤能力比较MiceDll4RNAi+和MiceDll4RNAi-两组裸鼠模型中SOSP-9607E10原发瘤的大小,结果显示皮下种植45天后SOSP-9607E10原发瘤的大小（cm3）分别为3.01±0.22和3.45±0.23,差异具有显着性意义（P＜0.05）,比较MiceDll4RNAi+和MiceDll4RNAi-两组裸鼠模型SOSP-9607E10原发瘤中的MVD,结果显示MiceDll4RNAi+和MiceDll4RNAi-两组裸鼠模型SOSP-9607E10原发瘤中每高倍镜视野平均MVD值分别为29±2和37±3,差异具有显着性意义（P＜0.05）。（8）体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡实验组HMEC-1Dll4RNAi+较对照组HMEC-1Dll4RNAi-细胞迁移能力明显下降,24小时划痕愈合率分别为69%vs 92%,差异具有显着性意义（P＜0.05）。细胞侵袭能力也明显下降,24小时培养后穿过Transwell的每低倍视野细胞数分别为49±6 vs 70±3,差异具有显着性意义（P＜0.05）。MTT法比较HMEC-1Dll4RNAi+较对照组HMEC-1Dll4RNAi-的增殖能力,差异不具有显着性意义（P＞0.05）。两组细胞的凋亡差异不具有显着性意义（P＞0.05）。（9）体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的血管生成HMEC-1Dll4RNAi+组不能成管;对照组成管指数为2397±726,实验组成管指数为489±215,两组差异具有显着性意义（P＜0.05）。三维血管新生模型对照组和实验组中每10个微载体成管数分别为45±9和9±7,差异具有显着性意义（P＜0.05）,这些结果说明体外抑制Dll4的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的血管生成。（10）体内实验中抑制Dll4的表达可以抑制VEGF诱导的血管生成实验组Matrigel中的新生血管少于对照组,实验组和对照组Matrigel中新生血管总长度分别为23634±6421μm和32145±4314μm,差异具有显着性意义（P＜0.05）这说明体内实验中抑制的Dll4表达可以抑制VEGF诱导的新生血管生成。结论:Dll4在骨肉瘤中的高表达可能参与了骨肉瘤的发生发展,Dll4可能作为预测骨肉瘤不良预后的肿瘤标志物;Dll4可能通过调控血管成管分子机制参与了骨肉瘤的侵袭转移;Dll4可能成为抗骨肉瘤侵袭转移和血管生成的基因治疗新靶点。
王银河[10]（2009）在《胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）下调对人骨肉瘤Saos-2细胞生物学特性的影响》文中研究表明胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）对恶性肿瘤细胞的发生、增殖,以及抑制细胞凋亡有着非常重要的意义,已经发现IGF-1R在包括骨肉瘤在内的许多人类恶性肿瘤中过表达,而且IGF-1R的高表达可能与肿瘤发生、增殖以及放射耐受性密切相关。利用小干扰RNA （ small interfering RNA, siRNA）抑制基因表达已成为研究基因功能以及疾病基因治疗的一种有效方法,慢病毒载体也已经发展成为一种成熟的研究手段。为研究IGF-1R作为基因治疗骨肉瘤的靶标的可能性,我们使用慢病毒介导的siRNA技术来研究短发夹RNA（shRNA）靶向封闭IGF-1R而下调内生性IGF-1R表达,从而进一步研究IGF-1R对人骨肉瘤Saos-2细胞肿瘤发生、侵袭力和放射敏感性的影响。使用RT-PCR以及Western blotting方法,发现其中一种shRNA经过慢病毒介导的siRNA技术可以显着地、持久地减少人骨肉瘤Saos-2细胞IGF-1R的表达,通过骨肉瘤Saos-2细胞体外增殖及BALB/c裸鼠移植瘤体内实验,发现该shRNA引起的IGF-1R的下调,在体外可以明显地抑制骨肉瘤细胞的生长率,同时在活体内可以明显抑制骨肉瘤细胞导致的肿瘤发生,而且经过流式细胞仪可以检测到,这种该shRNA引起的IGF-1R下调阻止骨肉瘤细胞停留在细胞周期的G0/G1阶段,并且诱导凋亡,其作用和细胞凋亡蛋白酶（Caspase-3）有关。通过2室- Transwell方法进行细胞的侵袭力测定,我们更进一步观察到抑制IGF-1R能够减低人骨肉瘤Saos-2细胞的侵袭力,以及进行放射照射后克隆源细胞的生存测定显示,IGF-1R的靶向抑制能提高骨肉瘤Saos-2细胞对放射照射的敏感性。我们的研究结果显示,使用慢病毒介导的siRNA技术,靶向抑制IGF-1R,能有效抑制人骨肉瘤Saos-2细胞的生长活性、侵袭力活性,以及能有效增强其对放射的敏感性。
二、骨肉瘤细胞体外培养中仿血管发生现象(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、骨肉瘤细胞体外培养中仿血管发生现象(英文)（论文提纲范文）
（1）PSMC2对前列腺癌细胞生物学行为的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验仪器设备 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 Celigo细胞计数检测细胞生长 |
| 2.2.3 细胞克隆形成检测 |
| 2.2.4 细胞划痕试验 |
| 2.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 细胞Transwell实验 |
| 2.2.7 HE、免疫组织化学染色(HE staining,IHC) |
| 2.2.7.1 HE染色: |
| 2.2.7.2 IHC染色: |
| 2.2.7.3 结果观察: |
| 2.2.8 Western Blot检测 |
| 2.2.8.1 细胞总蛋白抽提 |
| 2.2.8.2 SDS-PAGE |
| 2.2.8.3 免疫印迹(湿转) |
| 2.2.8.4 免疫显色: |
| 2.2.8.5 加ECL、曝光、显影、定影 |
| 2.2.9 Real-time qPCR检测 |
| 2.2.9.1 引物设计 |
| 2.2.9.2 总RNA抽提 |
| 2.2.9.3 反转录获得cDNA |
| 2.2.9.4 Real-time PCR检测 |
| 2.2.9.5 数据分析 |
| 2.2.10 目的基因RNA干扰慢病毒载体制备 |
| 2.2.10.1 实验质粒 |
| 2.2.10.2 实验菌株 |
| 2.2.10.3 RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备 |
| 2.2.10.4 线性化载体制备 |
| 2.2.11 慢病毒包装与质量检测 |
| 2.2.11.1 实验材料 |
| 2.2.11.2 质粒的制备: |
| 2.2.11.3 质粒转染与慢病毒收获 |
| 2.2.11.4 慢病毒浓缩与纯化 |
| 2.2.11.5 慢病毒质量检测 |
| 2.2.11.6 滴度分析 |
| 2.2.12 慢病毒感染细胞 |
| 2.2.12.1 目的细胞复苏 |
| 2.2.12.2 目的细胞慢病毒感染 |
| 2.2.13 动物成瘤实验 |
| 2.2.14 蛋白抗体芯片 |
| 2.2.15 PSMC2 过表达与Akt信号通路验证实验 |
| 2.2.16 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 PSMC2 在前列腺癌组织及细胞系中高表达 |
| 3.2 成功构建PSMC2 表达敲减的细胞模型 |
| 3.3 下调PSMC2 基因表达可抑制前列腺癌细胞增殖、克隆形成、二维迁移及侵袭并促进其凋亡 |
| 3.4 下调PSMC2 基因表达可抑制前列腺细胞体内成瘤能力 |
| 3.5 PSMC2 抗前列腺癌细胞凋亡的关键分子筛查 |
| 3.6 PSMC2 抗前列腺癌细胞凋亡的信号转导通路验证 |
| 3.7 PSMC2/PI3K/Akt/Cyclin D1/CDK6 作用通路验证 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 主要创新点 |
| 不足之处 |
| 第7章 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（2）MicroRNA-145在骨肉瘤侵袭转移及上皮间质转化中的作用和机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 miR-145在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系中的表达 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 组织标本和细胞系 |
| 2.1.1 组织标本 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.2 引物 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 实验材料和仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 组织、细胞总RNA提取 |
| 3.2.1 组织总RNA的提取 |
| 3.2.3 细胞总RNA的提取 |
| 3.3 反转录反应 |
| 3.4 实时荧光定量PCR反应 |
| 3.5 免疫组化检测 |
| 3.6 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 miR-145在骨肉瘤组织及癌旁组织中的表达情况 |
| 4.2 miR-145在骨肉瘤组织中的表达与临床病理学特征之间的相关性分析 |
| 4.3 miR-145在骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞系中的表达差异 |
| 4.4 NEDD9在骨肉瘤组织中的表达 |
| 4.5 骨肉瘤组织中miR-145和NEDD9的相关性分析 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 体外调控miR-145对骨肉瘤细胞侵袭转移和EMT的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 引物 |
| 2.4 主要试剂和材料 |
| 2.5 主要实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 试剂配制 |
| 3.2 细胞转染 |
| 3.3 CCK8法检测骨肉瘤细胞MG63细胞增殖能力 |
| 3.4 Boyden Chamber检测转染miR-145mimics对骨肉瘤细胞MG63的侵袭能力的影响 |
| 3.5 划痕实验 |
| 3.6 实时荧光定量PCR检测miR-145及EMT相关分子:Snaill、E-cadherin、N-cadherin和vimentin的mRNA水平 |
| 3.6.1 细胞总RNA提取 |
| 3.6.2 测定提取的细胞总RNA浓度和纯度 |
| 3.7 Western blot检测骨肉瘤细胞系MG63中Snaill、E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白的表达 |
| 3.7.1 细胞蛋白的提取 |
| 3.7.2 BCA法测定细胞蛋白浓度 |
| 3.7.3 SDS-PAGE电泳 |
| 3.7.4 转膜 |
| 3.7.5 封闭 |
| 3.7.6 与一抗反应 |
| 3.7.7 与二抗反应 |
| 3.7.8 ECL显色 |
| 3.8 体内水平检测miR-145表达对裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 3.8.1 细胞准备 |
| 3.8.2 建立裸鼠移植瘤模型 |
| 3.8.3 检测移植瘤中相关分子的表达 |
| 3.8.4 免疫组化染色 |
| 3.9 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 转染miR-145 mimics显着提高骨肉瘤细胞MG63 miR-145 mRNA的表达 |
| 4.2 转染miR-145 mimics对骨肉瘤细胞MG63增殖能力的影响 |
| 4.3 转染miR-145 mimics对骨肉瘤细胞MG63侵袭能力的影响 |
| 4.4 转染miR-145 mimics对骨肉瘤细胞MG63迁移能力的影响 |
| 4.5 转染miR-145 mimics对骨肉瘤MG63细胞EMT相关表型标志表达的影响 |
| 4.6 体内调控miR-145表达对裸鼠移植瘤的影响 |
| 4.6.1 转染miR-145 mimics对骨肉瘤MG63细胞裸鼠体内成瘤的影响 |
| 4.6.2 裸鼠移植瘤中EMT相关基因mRNA水平的检测 |
| 4.6.3 裸鼠移植瘤中EMT相关基因免疫组化检测 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-145调控骨肉瘤MG63细胞EMT发生的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 细胞系 |
| 2.4 细菌 |
| 2.5 质粒 |
| 2.6 引物 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 双荧光素酶报告实验 |
| 3.2 NEDD9 siRNA转染MG63细胞 |
| 3.3 miR-145 mimics转染 |
| 3.4 NEDD9 siRNA的rescue实验 |
| 3.5 实时荧光定量PCR检测MG63细胞转染NEDD9 siRNA后EMT相关分子的表达 |
| 3.6 Western blot检测MG63细胞转染NEDD9 siRNA后蛋白的表达 |
| 3.7 细胞迁移能力测定 |
| 3.8 细胞侵袭能力测定 |
| 4 结果 |
| 4.1 双荧光素酶报告实验 |
| 4.1.1 pmirGLO-NEDD9-3'UTR野生型/突变型重组载体的鉴定 |
| 4.1.2 双荧光素酶报告实验 |
| 4.2 miR-145通过NEDD9参与骨肉瘤细胞MG63细胞EMT发生 |
| 4.2.1 miR-145对NEDD9表达的调控作用 |
| 4.2.2 NEDD9 siRNA对骨肉瘤细胞MG63 NEDD9表达的影响 |
| 4.2.3 NEDD9 siRNA对骨肉瘤细胞MG63侵袭能力的影响 |
| 4.2.4 NEDD9 siRNA对骨肉瘤细胞MG63转移能力的影响 |
| 4.2.5 NEDD9 siRNA对骨肉瘤细胞MG63 EMT相关分子表达的影响 |
| 4.2.6 miR-145通过NEDD9促进骨肉瘤细胞MG63细胞EMT的发生 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 个人简介 |
| 博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）骨肉瘤类肿瘤干细胞诱导巨噬细胞M2表型分化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 骨肉瘤类肿瘤干细胞的培养、分离及鉴定 |
| 1.实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 骨肉瘤类肿瘤干细胞表面糖链表达检测 |
| 1.实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 小鼠骨髓来源巨噬细胞培养及鉴定 |
| 1 小鼠骨髓来源巨睡细胞培养 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 骨肉瘤类肿瘤干细胞对巨噬细胞表型影响的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表和待发表的论文 |
| 致谢 |
（5）LIMK1在骨肉瘤多药耐药中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1篇 文献综述 |
| 第1章 骨肉瘤多药耐药的研究进展 |
| 1.1 肿瘤多药耐药的研究进展 |
| 1.2 骨肉瘤多药耐药的研究进展 |
| 第2章 恶性肿瘤多药耐药的逆转 |
| 2.1 化学药物逆转肿瘤多药耐药 |
| 2.2 天然药物（中药）逆转肿瘤 MDR |
| 2.3 MDR 的免疫学治疗 |
| 2.4 MDR 的基因治疗 |
| 参考文献 |
| 第2篇 实验研究 |
| 第1章 人骨肉瘤多药耐药细胞系的建立及生物学特性分析 |
| 1.1 实验材料与方法 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第2章 LIMK1 在骨肉瘤多药耐药细胞中的表达及在转移与多药耐药中的作用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 LIMK1 对骨肉瘤多药耐药机制的探讨 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）去甲二氢愈创木酸体外抗骨肉瘤作用的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 去甲二氢愈创木酸抑制骨肉瘤细胞增殖和克隆形成及其机制 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 去甲二氢愈创木酸抑制骨肉瘤细胞黏附、迁移和侵袭及其机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 去甲二氢愈创木酸引起骨肉瘤细胞周期阻滞和诱导凋亡及其机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学审稿证明 |
（7）ROR2在骨肉瘤组织及细胞中的表达及其对骨肉瘤细胞生物学行为影响的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 第一章 ROR2在骨肉瘤组织及细胞中的表达及意义 |
| 1.1前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验标本 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 实验方法 |
| 1.2.4 统计分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 免疫组织化学实验结果 |
| 1.3.2 Western-bloting实验结果 |
| 1.3.3 RT-PCR的实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二部分:小干扰RNA对骨肉瘤细胞株ROR2基因及蛋白表达的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料及主要试剂 |
| 2.2.2 人ROR2 RNAi质粒构建 |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.4 RT-PCR实验 |
| 2.2.5 细胞Western-bloting实验 |
| 2.2.6 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 人ROR2 siRNA质粒构建结果 |
| 2.3.4 Western-bloting实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三部分 ROR2对骨肉瘤细胞增殖及侵袭力的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料和试剂 |
| 3.2.2 流式细胞检测 |
| 3.2.3 体外Transwell侵袭实验 |
| 3.2.4 Brdu标记实验 |
| 3.2.5 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 流式细胞检测结果 |
| 3.3.2 体外Transwell侵袭实验结果 |
| 3.3.3 Brdu标记实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的科研成果目录 |
（8）人成骨肉瘤细胞系中高侵袭及类肿瘤干细胞亚系的建立（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 肿瘤转移 |
| 1.1.1 肿瘤细胞的运动形式 |
| 1.1.2 癌细胞运动的分子调控机制 |
| 1.1.3 Cofilin 蛋白与肿瘤转移 |
| 1.1.4 骨肉瘤转移 |
| 1.1.5 肿瘤转移体外研究存在的问题与展望 |
| 1.1.6 骨肉瘤与成骨分化标志物 |
| 1.1.7 VEGF 与肿瘤转移 |
| 1.2 肿瘤异质性理论 |
| 1.2.1 肿瘤细胞克隆形态与肿瘤异质性学说 |
| 1.3 肿瘤干细胞理论 |
| 1.3.1 肿瘤干细胞细胞表型 |
| 1.3.2 肿瘤干细胞与肿瘤侵袭转移 |
| 1.3.3 骨肉瘤肿瘤干细胞研究进展 |
| 第2章 人成骨肉瘤细胞系MG63“HOLOCLONE”样单克隆的分离及其成骨分化程度的鉴定 |
| 前言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 生物学特性鉴定 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 高低不同转移特性骨肉瘤单克隆细胞亚系的分离与鉴定 |
| 前言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 应用低浓度长春新碱分离并鉴定MG63 单克隆细胞株中的类骨肉瘤干细胞 |
| 前言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 主要仪器与设备 |
| 4.3 实验动物 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
（9）RNAi技术干扰骨肉瘤细胞Dll4表达抑制侵袭转移和血管生成的体内外实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略语对照 |
| 前言 |
| 第一部分 DLL4在骨肉瘤组织中的表达及临床意义 |
| 引言 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 组织标本和临床病理资料收集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 Notch1、Dll4在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达 |
| 2.2 Notch1、Dll4表达及其与骨肉瘤病理临床指标的关系 |
| 2.3 骨肉瘤中NOTCH1和DLL4表达与MVD表达的关系 |
| 3 讨论 |
| 3.1 Dll4、Notch1表达与骨肉瘤 |
| 3.2 Dll4-Notch1信号通路和骨肉瘤血管生成的机制 |
| 3.3 Dll4-Notch1信号通路在骨肉瘤血管生成中的意义 |
| 小结 |
| 第二部分 RNAI干扰DLL4对骨肉瘤细胞肿瘤生物学行为影响的体内外研究 |
| 引言 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性质粒的鉴定 |
| 2.2 Dll4在不同转移侵袭潜能的骨肉瘤中的差异表达 |
| 2.3 逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性沉默SOSP-9607E10癌细胞系中Dll4的表达 |
| 2.4 体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制骨肉瘤细胞的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡 |
| 2.5 体内抑制Dll4的表达可以抑制骨肉瘤细胞的成瘤能力 |
| 3.讨论 |
| 3.1 逆转录病毒介导的SiRNA干扰SOSP-9607E10细胞中Dll4表达抑制骨肉瘤细胞侵袭能力 |
| 3.2 逆转录病毒介导的SiRNA干扰以及SOSP-9607E10细胞裸鼠成瘤模型的改进 |
| 小结 |
| 第三部分 DLL4调控骨肉瘤新生血管生成的体内外研究 |
| 引言 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性沉默HMEC-1人微血管内皮细胞系中Dll4的表达 |
| 2.2 体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡 |
| 2.3 体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的血管生成 |
| 2.4 体内实验中抑制Dll4的表达可以抑制VEGF诱导的血管生成 |
| 3.讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述(一) |
| 综述(二) |
| 致谢 |
| 攻读博士期间主要研究成果 |
（10）胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）下调对人骨肉瘤Saos-2细胞生物学特性的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 第三章 结果 |
| 一、Saos-2细胞系经慢病毒转导后,IGF-1R mRNA和蛋白表达下调 |
| 二、IGF-1R下调在体外对细胞生长和集落形成的影响 |
| 三、慢病毒介导的RNAi降低了Saos-2细胞的局部侵袭活性 |
| 四、慢病毒介导的RNAi诱发的细胞周期的变化 |
| 五、慢病毒介导的RNAi促进细胞的凋亡 |
| 六、细胞凋亡蛋白酶活性检测 |
| 七、慢病毒介导的RNAi抑制活体肿瘤生长 |
| 八、慢病毒介导的RNAi增强了Saos-2细胞的放射敏感性 |
| 第四章 分析与讨论 |
| 第五章 小结 |
| 参考文献 |
| 附录(一) 综述 |
| 参考文献 |
| 附录(二) 博士在读期间发表的论文 |
| 附录(三) 英文缩略词表 |
| 附录（四）发表的与答辩论文相关的SCI 文章 |
| 致谢 |
四、骨肉瘤细胞体外培养中仿血管发生现象(英文)（论文参考文献）
- [1]PSMC2对前列腺癌细胞生物学行为的影响及机制研究[D]. 陈庆科. 南昌大学, 2019(08)
- [2]MicroRNA-145在骨肉瘤侵袭转移及上皮间质转化中的作用和机制探讨[D]. 张仲宁. 郑州大学, 2018(12)
- [3]骨肉瘤类肿瘤干细胞诱导巨噬细胞M2表型分化的研究[D]. 张思胜. 武汉大学, 2015(10)
- [4]恶性骨肿瘤血管生成拟态研究进展[J]. 王少林,谭祖键,周明全. 中国医师杂志, 2013(06)
- [5]LIMK1在骨肉瘤多药耐药中的作用及机制研究[D]. 张汉阳. 吉林大学, 2012(08)
- [6]去甲二氢愈创木酸体外抗骨肉瘤作用的实验研究[D]. 王京亮. 南方医科大学, 2012(04)
- [7]ROR2在骨肉瘤组织及细胞中的表达及其对骨肉瘤细胞生物学行为影响的初步研究[D]. 黄建军. 中南大学, 2010(02)
- [8]人成骨肉瘤细胞系中高侵袭及类肿瘤干细胞亚系的建立[D]. 娄楠. 吉林大学, 2010(08)
- [9]RNAi技术干扰骨肉瘤细胞Dll4表达抑制侵袭转移和血管生成的体内外实验研究[D]. 许自力. 中南大学, 2009(02)
- [10]胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）下调对人骨肉瘤Saos-2细胞生物学特性的影响[D]. 王银河. 南京医科大学, 2009(12)