王琼1,2李璇2严士海1王海丹1朱荃2（通讯作者）
(1江苏省中医院基础药理实验室江苏南京210029)
(2南京中医药大学国家规范化中药药理实验室江苏南京210029)
【摘要】目的观察灌胃给予中药复方的大鼠血清对高糖和糖基化终末产物（AGEs）诱导的肾小球系膜细胞内山梨醇含量的影响。方法体外培养的肾小球系膜细胞（glomerularmesangialcells，GMC），模型组采用25mmol/L葡萄糖和0.25mg/mlAGEs共培养三周，药物组给予高糖和AGEs的同时采用灌胃给予中药复方的大鼠血清（0.01%，0.1%，1%，5%）进行干预，酶促微量反应法测定肾小球系膜细胞内山梨醇含量。结果灌胃给予中药复方后的大鼠血清（0.1%、1%）能显著降低高糖和AGEs引起的肾小球系膜细胞内山梨醇含量的升高。结论灌胃给予中药复方后的大鼠血清能显著抑制高糖和AGEs引起的肾小球系膜细胞内山梨醇含量的升高。
【关键词】糖尿病肾病中药复方肾小球系膜细胞山梨醇
【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）30-0050-02
糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）是糖尿病中最严重的慢性并发症，目前，糖尿病肾病的防治除了严格控制血糖水平及肾素血管紧张素转换酶抑制剂外，尚无公认的治疗药物。前期研究表明，中药复方（大黄、黄芪、川芎、白术、茯苓等）能抑制AGEs引起的大鼠肾小球细胞膜细胞增殖及系膜基质增生[1]。本文采用血清药理学方法，进一步观察灌胃给予中药复方的大鼠血清对高糖和AGEs诱导的细胞内山梨醇含量的影响。
1材料
1.1试剂和药物
DMEM培养基，InvitrogenCorporation；新生牛血清，杭州四季清血清厂；NADH辅酶Ι，中国医药（集团）上海化学试剂公司；甘氨酸，上海康达氨基酸厂。
1.2动物
SD大鼠，上海斯莱克实验动物责任有限公司，合格证号：SCXK（沪）2003－0003。
1.3细胞株
大鼠肾小球系膜细胞株HBZY21，由武汉细胞生物研究所提供。
2方法
2.1中药复方给予大鼠后的血清制备方法：
药物血清组以10.8g生药/kg的中药复方灌胃给予大鼠，空白血清组以生理盐水灌胃。灌胃容积均为1ml/100g，每组4只动物。一日剂量分2次服，连续给药3天，第4天1次服用全天剂量，末次给药2小时后采血。分离血清，56℃30分钟灭活，过滤除菌，-20℃冰箱保存备用。
2.2细胞培养及样品处理
将鼠肾小球系膜细胞接种于细胞瓶中，采用25mmol/L葡萄糖和0.25mg/mlAGEs诱导细胞，给药组分别加入浓度为DQ-S-1(herbserum0.01%)、DQ-S-2(herbserum0.1%)、DQ-S-3(herbserum1%)、DQ-S-4(herbserum5%)的灌胃给予中药复方得到的大鼠血清，设立相同的空白血清对照分别为S-1(serum0.01%)、S-2(serum0.1%)、S-3(serum1%)、S-4(serum5%)，共培养三周。
大鼠肾小球系膜细胞传至第3周结束时用细胞刮将贴壁细胞刮下，调细胞数为5×104个，用D-Hanks洗涤2-3次，最后1次洗涤弃去D-Hanks液，加入1ml双蒸水，细胞超声波粉碎机超声及反复冻溶破膜，留做检测。
2.3酶促微量反应法测定山梨醇含量[2]
采用间接荧光法检测细胞内山梨醇的含量，反映AR的活性。①试剂配制山梨醇脱氢酶(SDH)母液：精密称取SDH2mg，以0.05mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液配至1mL，每份100μL。-20℃冻存，3个月内用完。酶反应液：精密称取NAD+2mg，取SDH母液1份，置10mL容量瓶中，以0.05mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液定容至10mL，4℃避光保存，5d内用完。②细胞内山梨醇含量测定细胞破膜后3000r/min，离心10min，取上清100μL，加入酶反应液100μL，37℃反应30min，取出在SPECTRAMAXGEMINIXS下366/455nm处测定荧光值。
2.4统计学处理
以t检验进行统计学处理，数据以x-±s表示。
3结果
3.1灌胃给予中药复方的大鼠血清对高糖诱导的鼠GMC内山梨醇含量的影响
表1灌胃给予中药复方的大鼠血清对高糖诱导的
***P<0.01vscontrol#P<0.05vsS-2^P<0.05vsS-3
由以上结果可见，灌胃给予中药复方后的大鼠血清（0.1%、1%）能显著降低高浓度的葡萄糖引起的肾小球系膜细胞内山梨醇含量的升高。
3.2灌胃给予复方DQ101的大鼠血清对AGEs培养下的鼠GMC内山梨醇含量的影响
表2灌胃给予中药复方的大鼠血清对AGEs诱导的
***P<0.01vscontrol#P<0.05vsS-2^P<0.05vsS-3
由以上结果可见，灌胃给予中药复方后的大鼠血清（0.1%、1%）能显著降低长期AGEs诱发引起的肾小球系膜细胞内山梨醇含量的升高。
4讨论
肾小球系膜细胞是肾小球中最活跃的反应性细胞，其病理变化在DN的发生和发展中居于中心地位。本文采用血清药理学的方法观察给予中药复方得到的大鼠血清对高糖和AGEs诱发的系膜细胞内山梨醇堆积的影响。山梨醇是多元醇通路的中间产物，它的浓度可反应多元醇通路激活程度，检测组织细胞中山梨醇的含量，可有效的反应该组织细胞中多元醇通路的激活状态[3]。
中药血清药理学由日本学者田代真一在1984年提出[4]，它将中药或复方经口灌服动物一定时间后分离血清，用此含有药物成分的血清进行体外实验；但中药血清药理学应用尚处于探讨阶段，在实验研究中含药血清制备技术的规范化研究是一切研究的基础，本文通过预试验，采用10.8g生药/kg的复方DQ101灌胃，一日剂量分2次服，连续给药3天，第4天1次服用全天剂量，末次给药2小时后采血，用于观察不同药物血清浓度对系膜细胞的影响。结果显示，给予复方DQ101的大鼠血清能够显著抑制高糖和AGEs引起的肾小球系膜细胞内山梨醇含量的堆积，进一步提示中药复方可能通过减少细胞内山梨醇的堆积而对糖尿病肾病起一定的治疗作用。
参考文献
[1]王琼,汪宁,余黎,等.中药复方对糖基化终末产物培养下的肾小球系膜细胞增殖以及系膜基质增生的影响[J].中国中医药信息杂志,2007,14(2):35-37.
[2]孙敏,孙晶,朱荃.抗氧化剂对系膜细胞醛糖还原酶活性的影响[J].中国病理生理杂志,2006,22(8):1644-1646.
[3]LiX,HuJ,ZhangR,etal.Urocortinamelioratesdiabeticnephropathyinobesedb/dbmice[J].BrJPharmacol,2008,154(5):1025-34.
[4]田代真一じ¨由来培养细胞ぎ用ぃた汉方药理学研究系の开发[J].汉医药学会志,1985(2):106