草鱼IRF5与IRF3协同上调IFN转录的研究

论文摘要

相干扰素调节因子（IRFs）,是一类与先天免疫相关的转录因子家族,参与干扰素（IFN）及干扰素刺激基因（ISGs）的转录调节。IRF家族成员包括哺乳类的9个成员,鸟类的10个成员以及硬骨鱼类的11个成员。IRF家族成员在抗病毒感染、参与先天性免疫和适应性免疫应答、调节细胞凋亡与分化等方面发挥重要生物学作用。其中,对于干扰素调节因子3（IRF3）与干扰素调节因子7（IRF7）的研究较为深入。近几年关于IRFs的研究表明,干扰素调节因子5（IRF5）能在RIG-I信号通路及Toll-like信号通路中发挥作用。对于哺乳类IRF5的研究主要集中在其参与调节自身免疫性疾病,鱼类中IRF5基因逐渐被克隆鉴定,鱼类IRF5的作用也渐渐被报道。但是对于硬骨鱼中IRF5功能的研究及其与干扰素调节因子家族之间的关系,相关研究报道甚少。因此,本文主要研究Ci IRF5对IFN的转录调控,以及Ci IRF5与Ci IRF3对IFN协同上调的调控机制,从而进一步验证Ci IRF5与Ci IRF3在鱼类抗病毒免疫反应的重要地位。首先,我们通过检测脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）感染诱导后,草鱼IRF5基因m RNA的表达水平来分析其应激情况。实时荧光定量PCR实验分析Ci IRF5在CO细胞中经LPS处理不同时间后的表达情况。其中Ci IRF5经LPS刺激6 h后上调,LPS刺激12 h后达到最高峰,随后在48 h逐渐恢复0 h水平;而IFN的表达从6 h达到峰值,之后渐渐降低,48 h回升。表明Ci IRF5参与了细胞的抗病毒免疫应答反应。为了研究草鱼IRF5在先天免疫信号通路中的转录调控机制,我们将构建的草鱼IRF5真核表达载体Pc DNA3.1-IRF5、Pc DNA3.1-IRF5-n DBD,转入草鱼细胞,双荧光素酶活性分析IFN的表达情况,分析结果表明草鱼IRF5能够诱导上调IFN启动子活性,而IRF5-n DBD不能上调IFN启动子活性,揭示了草鱼IRF5对干扰素的正调控作用。为验证IRF5/IRF3二聚体能够协同激活IFN的表达,我们将草鱼IRF5和IRF3一起共转染进CO细胞中,双荧光素酶活性实验检测IFN启动子的转录活性。分析实验数据显示,共转染Ci IRF5与Ci IRF3的实验组IFN启动子的荧光素酶活性显著高于分别单转Ci IRF5和Ci IRF3。为了进一步探究是否存在Ci IRF5与Ci IRF3异源二聚体,我们进行了体内免疫共沉淀实验和体外GST-polldown实验。我们将Ci IRF5构建到带FLAG标签的质粒上,Ci IRF3构建到GFP-C1质粒上,利用瞬时共转染技术转染至HEK-293T细胞,Western Bolt检测表明:草鱼IRF5能与IRF3发生相互作用。为探究草鱼IRF5在细胞中的分布情况,我们进行了胞浆胞核蛋白抽提实验及亚细胞定位实验。结果显示Ci IRF5主要分布在细胞质中,LPS刺激可以促进Ci IRF5的核移位。细胞亚定位实验显示,Ci IRF5定位在细胞质中,但是Ci IRF5的核质分布是动态的。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 毛玥心

导师: 毛慧玲

关键词: 草鱼,互作用,转录调控,细胞亚定位

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 南昌大学

分类号: Q953

DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.000891

总页数: 49

文件大小: 1687K

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