猪肉脂肪酶基因的克隆表达及其在食品中的应用研究

论文摘要

脂肪酶能够水解脂肪,形成脂肪酸等风味前体物质,是一种广泛应用的催化剂。实验室前期研究结果表明,猪肉内源性脂肪酶对肉品及奶制品的风味均有所改善,为进一步验证脂肪酶功能,本文从猪肉中克隆了脂肪酶基因LPL,并在大肠杆菌中进行原核表达,考察重组脂肪酶对猪肉、奶制品、淀粉作用效果,从分子水平和酶水平解析猪肉脂肪酶对食品风味的作用机制,为脂肪酶工业化生产提供新思路。研究结果如下:1.根据GenBank数据库中收录的LPL基因序列,经RT-PCR扩增得到LPL基因,测序结果经BLAST比对,同源性为99%,构建的LPL基因大小为1756 bp,编码478个氨基酸。构建的重组质粒pET30a-LPL在大肠杆菌中成功表达。重组菌在IPTG浓度为0.4 mM,诱导时间5 h时达到最大表达量,温度对表达量的影响较小。经镍柱亲和层析纯化得到一条单一的目的条带,与预测重组蛋白理论分子量大小一致为53.58 kDa。经测定重组酶蛋白浓度为189μg/mL,酶活力为0.932 U/mL。重组酶pH稳定性良好,最适pH和最适温度分别为pH 8.0和40℃,且对于低浓度的甲醇、丙三醇,重组酶有很好的耐受性。2.将重组脂肪酶和内源性猪肉脂肪酶分别作用于猪肉中,测定脂肪水解氧化指标,结果显示:经脂肪酶处理后的过氧化值、硫代巴比妥酸值（TBA）、羰基价、双烯值均高于空白对照组,表明重组酶具备同内源性脂肪酶相似的作用,对脂肪水解氧化有正向的影响。电子鼻结合GC-MS检测猪肉风味,共检测出36种挥发性风味物质,主要为烃类、杂环和芳香族化合物、有机酸和酯类、醛类、酮类、醇类等,其中经重组酶与内源酶处理后的猪肉醛类风味成分相对含量增加,且重组酶的效果优于内源酶,进一步表明重组酶能促进猪肉风味物质增加,增强猪肉风味。3.电子鼻检测添加内源酶与重组酶后奶制品风味有明显改变。GC-MS检测奶制品样品中挥发性成分主要为有机酸和酯类、烃类、醛酮类及杂环和芳香族类物质等,奶制品样品中呈现奶香味的挥发性物质2-十一酮、2-庚酮、2-壬酮等相对含量均明显提高,表明重组酶能够酶解乳脂肪产生风味物质,有效改善奶制品的风味。4.以淀粉为例,考察重组脂肪酶与内源性的脂肪酶对多糖水解的作用效果。当内源酶的加酶量为2.0 mL,淀粉浓度为6%,反应温度为50℃,体系pH值为6时,淀粉的水解程度达到最高,水解出葡萄糖含量为1.01 mg;当重组酶的酶添加量为2.0 mL,淀粉浓度为6%,反应温度为55℃,体系pH值为8时,淀粉的水解程度达到最高,水解出葡萄糖含量为1.32 mg。

论文目录

摘要

Abstract

缩略词表

第一章前言

1.1 脂肪酶简介

1.2 脂肪酶基因的研究进展

1.3 脂肪酶对食品风味的影响

1.3.1 脂肪酶对肉品风味的影响

1.3.2 脂肪酶对乳品风味的影响

1.3.3 脂肪酶对面粉类食品风味的影响

1.3.4 脂肪酶对白酒风味的影响

1.4 肉类风味形成途径

1.4.1 美拉德反应

1.4.2 脂质水解氧化反应

1.5 本研究的目的和意义

1.6 主要研究内容

第二章脂肪酶基因的克隆

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 质粒与菌种

2.1.3 主要试剂与仪器

2.1.4 试剂和药品的制备

2.1.5 实验方法

2.2 实验结果

2.2.1 猪肉脂肪总RNA的提取

2.2.2 RT-PCR扩增结果

2.2.3 重组质粒pET30a-LPL鉴定结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三章重组脂肪酶的原核表达及酶学性质的研究

3.1 材料与方法

3.1.1 质粒来源

3.1.2 主要试剂与仪器

3.1.3 试剂和药品的制备

3.1.4 实验方法

3.2 实验结果

3.2.1 pET30a-LPL重组蛋白表达结果

3.2.2 重组蛋白的纯化结果

3.2.3 重组蛋白表达条件优化

3.2.4 脂肪酸标准曲线

3.2.5 重组酶活性测定结果

3.2.6 重组酶酶学性质

3.3 讨论

3.4 小结

第四章重组脂肪酶对猪肉风味的影响

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验试剂与仪器

4.1.3 实验方法

4.2 实验结果

4.2.1 脂肪酶对猪肉脂肪水解氧化进程的影响

4.2.2 猪肉感官评定分析

4.2.3 电子鼻检测脂肪酶对猪肉风味的影响结果

4.2.4 HS-SPME-GC-MS检测猪肉挥发性物质

4.3 讨论

4.4 小结

第五章重组脂肪酶对奶制品风味的影响

5.1 材料与方法

5.1.1 脂肪酶的制备

5.1.2 实验材料

5.1.3 实验方法

5.2 实验结果

5.2.1 电子鼻传感器响应图结果分析

5.2.2 PCA结果分析

5.2.3 GC-MS检测奶制品挥发性风味物质成分

5.3 讨论

5.4 小结

第六章重组脂肪酶对淀粉水解能力的影响

6.1 材料与方法

6.1.1 脂肪酶的制备

6.1.2 实验试剂与仪器

6.1.3 实验方法

6.2 实验结果

6.2.1 乙酰氨基葡萄糖标准曲线

6.2.2 酶加量对酶促反应的影响

6.2.3 底物浓度对酶促反应的影响

6.2.4 温度对酶促反应的影响

6.2.5 pH对酶活力的影响

6.3 讨论

6.4 小结

第七章结论与创新点

7.1 结论

7.2 创新点

参考文献

附录1

附录2

致谢

在学期间科研成绩

个人简介

基本情况

教育背景

论文图表统计

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨爽

导师: 孟鑫

关键词: 脂肪酶,克隆,表达,食品,风味

来源: 锦州医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 锦州医科大学

分类号: TS202.3;Q78

DOI: 10.27812/d.cnki.glnyx.2019.000104

总页数: 80

文件大小: 3449K

下载量: 84

猪肉脂肪酶基因的克隆表达及其在食品中的应用研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢