免疫共沉淀法测定14-3-3ε蛋白与Cdc25B的相互作用

论文摘要

目的研究14-3-3ε蛋白与Cdc25B的相互作用及其作用位点,为小鼠卵母细胞减数分裂G2期阻滞的机制研究提供实验依据。方法本实验依次构建pc DNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε、p EGFP-Cdc25B-WT、p EGFP-Cdc25B-Ser321A、p EGFPCdc25B-Ser321D表达载体,分别转染HEK293细胞,分为四组,分别为Cdc25B-vector+14-3-3ε组（空载体组）,Cdc25B-WT+14-3-3ε组,Cdc25B-Ser321A+14-3-3ε组,Cdc25B-Ser321D+14-3-3ε组。通过免疫共沉淀法获得各组细胞裂解液及免疫沉淀物,用Western blotting检测Cdc25B-vector、Cdc25B-WT、Cdc25B-Ser321A、Cdc25B-Ser321D与14-3-3ε蛋白是否有共沉淀,如有共沉淀,说明两蛋白存在相互作用。结果本实验构建的4种表达载体经验证均构建成功。免疫共沉淀实验得出14-3-3ε能与野生型Cdc25B结合,当Cdc25B的S321突变成S321A时,这种结合不发生;而具有模拟磷酸化作用的Cdc25B-S321D也能与14-3-3ε结合。结论 Cdc25B S321是14-3-3ε蛋白与Cdc25B相互作用的特异性结合位点,此结合位点可能成为14-3-3ε蛋白与Cdc25B共同调控小鼠卵母细胞减数分裂进程及G2期阻滞的重要靶点,为后期哺乳动物生殖细胞的相关研究奠定实验基础。

论文目录

1 材料与方法

1.1 细胞株及组织

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4 pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε表达载体的构建

1.5 pEGFP-Cdc25B表达载体的构建

1.6 HEK293细胞培养和转染

1.7 免疫共沉淀法测定14-3-3ε蛋白与Cdc25B S321位点的结合

2 结果

2.1 重组质粒pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε

2.2 三种重组质粒的测序及鉴定

2.3 14-3-3ε和Cdc25B的免疫共沉淀结果

3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 李瑞林,孟峻,刘儒

关键词: 蛋白,作用位点,免疫共沉淀

来源: 山西医科大学学报 2019年07期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 内蒙古医科大学第一临床医学院内蒙古医科大学附属医院检验科

基金: 国家自然科学基金资助项目(81360109,81660267),内蒙古自然科学基金资助项目(2013MS1163)

分类号: Q492

DOI: 10.13753/j.issn.1007-6611.2019.07.004

页码: 889-893

总页数: 5

文件大小: 394K

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免疫共沉淀法测定14-3-3ε蛋白与Cdc25B的相互作用

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