（哈尔滨市南岗区疾病预防控制中心微生物检验科黑龙江哈尔滨150001）
【摘要】大多数细菌都可用人工方法培养，握细菌培养的基本技术，如无菌技术、各种细菌的营养要求和适宜的培养方法及保存、保管等。菌种的保存，特别是标准菌株的保存是细菌学检验，教学科研机构及有关生产单位的重要工作之一。在保存菌种的过程中，除了必须保证菌株的存活外，还应要求在保存过程中，保持其固有的各种生物学性状及抗原特性等。
【关键词】细菌检验；细菌培养；保存及保管
【中图分类号】R37【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2016）13-0219-02
细菌培养是感染性疾病病原学诊断的重要环节，并有利于细菌感染的治疗和预防。也是医院感染和流行病学调查的手段。菌种的保存，特别是标准菌株的保存是细菌学检验，教学科研机构及有关生产单位的重要工作之一。细菌实验室，一般应保存一套按规定允许保存的标准菌种和菌株，保存的种类视工作需要而定。
1.菌种的保存
为此必须注意以下问题：①控制传代次数：菌种传代次数越多，其突变的几率也就会越高。②用典型菌落传代：为防止盲目传代，每次传种，均应做划线分离，选出具有典型性状的菌落进行传代，用于保存。③通过易感动物恢复固有特性：对于已变异的病原菌，可采用接种易感动物的方式，将具有毒力的细菌重新选择出来，同时还可使一些表型变异的细菌恢复原有特性。菌种的保存方法有以下几种方法：
1.1固体培养基保存法
此为最简单的保存方法，但最大的不足是较易发生变异。为了延长菌种的保存时间，接种斜面时，仅由斜面底部划一直线即可。①普通琼脂斜面保存法：适合于对营养要求不高细菌的保存。接种后，35℃18～24h培养后，移于4℃的冰箱中，可保存一个月，每月传代一次。为防于涸，在斜面底部可放少许无糖肉汤(但变形杆菌“OX”及伤寒沙门菌除外)。②血琼脂斜面保存法：适合于保存对营养要求高的细菌，链球菌应半个月传代一次，肺炎链球菌等新分离的菌株应2～4d传代一次。③鸡蛋斜面保存法：适合保存Vi抗原的沙门菌属细菌及含表面抗原的细菌，一般可保存一个月[1]。
1.2半固体穿刺保存法
适合于肠道杆菌及葡萄球菌等一般细菌的保存。当细菌生长良好后，在其表面加一层1cm高无菌的液体石蜡，在4℃冰箱中，一般细菌可保存数月。
凡需特殊培养的细菌，则分别选用各自适宜的培养基进行保存。
1.3干燥保存法
干燥保存法是将细菌体内的水分蒸发掉，使细菌处于代谢停滞的状态，从而达到长期保存的目的。干燥保存法有多种，如砂土干燥保存法，明胶保存等，其中最好的方法是冷冻真空干燥保存法，此法是将生长旺盛的细菌在冻结状态下真空干燥，使细菌保持休眠状态[2]。该法可免去细菌的频繁传代，也可防止在传代过程中可能造成的污染、变异或死亡。保存期一般在3～5年，有的可达10年以上，是目前最有效的保存方法。
①准备安瓿管：选用中性硬质玻璃安瓿管，用10％HCl浸泡8～10h，再用自来水冲洗多次，最后用蒸馏水洗1～2次，烘干。管口塞上棉花，121℃灭菌30min。管壁贴印有菌种名称及接种日期的标签，并用固体石蜡熔化后薄薄地封一层，以防标签字模糊。
②制备脱脂牛奶：将新鲜牛奶煮沸，除去表面油脂，用脱脂棉过滤，离心3000r/min15min，再除去上层油脂，分装，115℃灭菌30min，并作无菌试验。
③制备菌液：吸取3ml无菌牛奶加入已培养16～18h的斜面菌种管，用接种环轻轻搅动菌苔，搓动试管，制成均匀的细胞悬液。
④分装菌液：用无菌的长颈滴管将菌液分装于安瓿管底部，每管装0.2ml。
⑤预冻：将装有菌液的安瓿置－40℃低温冰箱酒精槽内快速冷冻。安瓿快速冷冻只需4～5min，然后将安瓿放于干燥器内，置-20℃低温冰箱或装有维持冷冻剂(1：3的盐冰混合剂)的槽内，可保持6～18h。
⑥真空干燥：预冻完成后，开动真空泵抽气。使气压降至133.3kPa以下，维持冻结剂可于4h后移去。继续于室温中抽气，直至变色硅胶由粉红色变为全蓝色，再继续抽气，达到完全干燥。一般菌种干燥需6～8h。
⑦封管：待菌种完全干燥后，立即从干燥缸内取出安瓿，置于抽气管上抽成真空，约需3～10min。用高频真空检测仪检查，若安瓿颈部呈现淡紫色荧光，即可边抽气边封口。置4℃冰箱保存。无干燥机的实验室，可自行安装简易冷冻干燥系统。安装时，所有的连接处必须严缝，所用管道以粗为好，并尽量缩短真空系统线路，以便通畅，安装完毕，应检查有无漏气，以其压力能低到0.2mmHg为准。
⑧复苏培养：安瓿先用碘酒、酒精消毒，置火焰上烤热，滴加无菌蒸馏水，使安瓿尖端炸裂。然后用数层纱布包住折断。用无菌吸管取0.2ml肉汤注入安瓿，使其全部溶解，移种适宜培养基。
1.4液氮超低温保存
将菌种保存在-150～-196％超低温的液氮中，在该温度下，细菌等微生物的代谢处于停滞状态，因此可降低变异率和长期保持原种的性状，还可保存用其他方法难以保存的微生物。该法是保存菌种的理想方法。方法和步骤如下：①准备安瓿管：同干燥保存法；②制备保护剂：配制20％甘油或10％DMSO水溶液，于121℃灭菌30min；③制备细菌悬液：将微生物接种于适合的培养基，适宜温度培养至稳定期。对产生孢子的微生物应培养到形成成熟孢子的时期，再吸适量无菌生理盐水于斜面菌种管内，用接种环将菌苔从斜面上刮下，制成均匀的菌悬液；④加保护剂：吸上述菌液2ml于无菌试管内，加入2ml保护剂，充分混匀。保护剂的最终浓度分别为10％或5％；⑤分装菌液：将加有保护剂的菌液分装到安瓿管中，每管0.5ml。密封；⑥冻结：适于慢冻结的菌种，先放入-45℃低温冰箱1h，再放入液氮罐中保存。适于快速冻结的菌种，可将菌种直接放液氮罐进行超低温冻结保存；⑦保存：可放在气相或液相中保存。气相保存，即将菌种管放在液氮灌内液氮面上的气相部分(-150℃)中保存；液相保存，即将安瓿管放入桶内，再放入液氮(-196℃)中保存；⑧复苏培养：将安瓿管从液氮中取出，立即放入38℃水浴解冻。由于安瓿管内样品少，约3min即可融化。如要测定保存后的存活率，可吸0.1ml融化的悬液，作定量稀释后进行平板计数，再与冻结前计数相比较，即可求出存活率[3]。
2.菌种的保管
保存菌种，必须制定相应的规章制度，以保证菌种的安全。一般细菌大多保存在4℃冰箱中，但霍乱弧菌、绿脓假单胞菌及粪产碱杆菌需在室温保存，而脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌及初次分离的流感嗜血杆菌需保存于37℃孵箱中。保管的菌种应做好鉴定记录，设专人负责，建立菌种登记本。非干燥菌种注意定期传代或必要的重复鉴定，以防菌种变异。
3.讨论
尽管质控标准菌株比其他一些菌株药敏结果是相对稳定的，但反复多次的传代不可避免地造成菌株的变异。为防止变异，必须将标准菌株冻干保存。每月从冻干株中复苏1次，种入大豆酪蛋白消化肉汤中作为工作株。工作株可保存于4～8E，并于每周转种1次。通常工作株转种4～5次后即须弃去。在质控中，如发现工作株结果有疑问，应予以更换。
【参考文献】
[1]胡海林，郭维植．细菌实验菌种的保存及管理[J].福建医药杂志，2000，22(1)：113．
[2]陈秀英．菌种保存方法的比较[J].中国卫生检验杂志，2002，12(2)：231.
[3]叶迎春，赵世鸿，凌体淑.3种菌种保存法比较[J].中国误诊学杂志，2004,4(3):386.