论文摘要
猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus2,PCV2）是最小的哺乳动物病毒,也是仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。已有研究认为PCV2的致病性与多方面因素相关,其中病毒诱导凋亡是致病机制之一。ORF4作为与凋亡相关的病毒蛋白,其蛋白相关特性及其如何影响凋亡尚不明确。本研究通过观察ORF4的亚细胞定位、检测过表达ORF4或ORF4缺失突变体病毒对凋亡的影响以及寻找可能与ORF4相结合的细胞蛋白,旨在阐明ORF4潜在功能及其影响凋亡的机制。1.PCV2 ORF4蛋白潜在生物学特性研究虽然本实验室已通过Northern blot及间接免疫荧光试验（Indirect Immunofluorescence Assay,IFA）证实了 ORF4编码区及蛋白的存在,但仍然无法用免疫印迹（western blot,WB）检测到ORF4蛋白。对ORF4的生物学特性研究发现,细胞中瞬时表达的ORF4蛋白可被降解,加入蛋白酶体抑制剂MG132后降解速度减慢;ORF4稳转细胞系中只有在MG132存在的前提下,才能检测到ORF4蛋白的存在。这提示过表达的ORF4蛋白稳定性差,可通过蛋白酶体途径降解。ORF4的易降解特性同样也存在于病毒感染情况下,加入MG132后IFA检测的ORF4蛋白荧光数目显著增多。后续对检测方法的改善虽然仍无法用WB检测到病毒感染下ORF4蛋白,但也为ORF4的后续检测提供了参考数据。2.PCV2 ORF4蛋白亚细胞定位研究本研究利用CELLO v.2.5:subCELlular predictor等在线预测软件分析ORF4蛋白的亚细胞定位。随后,在PCV2感染及Flag-ORF4转染的细胞中,共聚焦观察。结果显示,瞬时转染细胞中ORF4与线粒体共定位,感染晚期ORF4在线粒体和胞核中均有分布。进一步研究过表达细胞系中ORF4蛋白定位,发现此时ORF4绝大部分弥散分布于胞核内。这提示ORF4蛋白具有线粒体与胞核双重定位特性。经软件分析ORF4蛋白序列中存在两个α-螺旋结构域,但不存在跨膜结构。根据预测所得的α-螺旋结构分布结果,构建一系列ORF4截短体分析出ORF4氨基端1-30aa呈点状分布于胞浆,与线粒体有共定位,该结果提示ORF4蛋白的氨基端包含24-30aa处α-螺旋的1-30aa氨基酸序列是其定位线粒体的关键区域。3.PCV2 0RF4蛋白功能分析为了分析ORF4蛋白功能,本研究将ORF4瞬时转染于293T、PK15及3D4/31三种细胞,检测总体凋亡指标,结果显示:caspase-3剪切体含量显著高于阴性对照。然而,在ORF4过表达细胞系中,无论是否加入MG132药物,caspase3切割量都没有明显改变。对瞬时表达ORF4激活的凋亡通路研究结果显示,在过表达ORF4细胞中,caspase9剪切体含量显著增多,胞浆中细胞色素c含量显著升高,但凋亡诱导因子AIF释放现象不明显。上述实验结果提示瞬时表达ORF4可诱导caspase依赖的线粒体凋亡。后续针对瞬时和稳定转染ORF4对凋亡激活的不同,揭示ORF4对凋亡的激活与其线粒体定位特性相关。随后,我们探索感染情况下ORF4在凋亡中所发挥的功能。利用本实验室保存wPCV2及ORF4缺失突变体病毒（m4PCV2）分别感染PK15细胞,72h后检测各项凋亡指标。结果显示,ORF4缺失毒感染细胞中,caspase3及caspase9剪切体含量、DNA片段化数目以及细胞色素c（cytc）释放量均显著降低,提示PCV2感染后可通过ORF4蛋白表达激活细胞内线粒体凋亡通路。综上所述,线粒体定位的ORF4蛋白可激活caspase依赖的线粒体凋亡。4.PCV2 ORF4蛋白诱导凋亡机制研究为了分析ORF4诱导线粒体凋亡机制,通过对ORF4与线粒体通透性转换孔径复合物蛋白腺嘌呤核苷酸转移酶III亚型（ANT3）及压力依赖性负离子通道I（VDAC1）,细胞色素c氧化酶VIIIA亚基进行免疫共沉淀试验,结果显示ORF4只与ANT3发生特异性结合;3D-SIM分析后进一步确定了 ORF4与ANT3的相互结合。Co-IP及GST-Pull down试验寻找与ANT3互作的ORF4具体区域,结果显示ORF4的1-30aa不仅是ORF4的线粒体定位序列,同样也是与ANT3结合的关键结构域。通过RNAi的方法对细胞内源性ANT3蛋白表达进行干扰,发现在ANT3敲降的细胞系中,不仅ORF4过表达导致的裂解的caspase3含量减弱;同样PCV2诱导的caspase3、9裂解程度以及释放到胞浆中的细胞色素c的含量也由于ANT3的敲降而显著降低。上述数据表明ANT3在ORF4过表达及PCV2感染诱导的线粒体凋亡中发挥着关键作用。
论文目录
摘要Abstract论文创新点研究意义技术路线第一部分 文献综述 第一章 猪圆环病毒2型研究进展 1 猪圆环病毒发现与分型 2 猪圆环病毒基因组及病毒复制 3 病毒蛋白基因组编码产物及其功能 3.1 ORF1蛋白 3.2 ORF2蛋白 3.3 ORF3蛋白 3.4 ORF4蛋白 3.5 ORF5蛋白 4 PCV2介导凋亡的研究进展 第二章 细胞凋亡及病毒调节细胞凋亡研究进展 1 凋亡特征及凋亡检测 2 凋亡通路 2.1 内源性凋亡通路 2.1.1 内源凋亡的起始—线粒体膜通透性增强 2.1.2 内源性凋亡通路 2.2 外源性凋亡通路 2.3 凋亡调节因子 2.3.1 Bcl-2家族蛋白 2.3.2 1APs与抗lAPs蛋白 2.3.3 存活因子（survival factors） 2.3.4 p53蛋白 2.3.5 Ser/Thr激酶 2.3.6 FLIPS 2.3.7 NF-κB 3 病毒与凋亡 3.1 病毒黏附、入胞及遗传物质释放对凋亡的调节作用 3.2 病毒蛋白对凋亡的调节 3.2.1 病毒蛋白抗凋亡机制 3.2.1.1 Bcl-2同源病毒蛋白（vBcl-2） 3.2.1.2 病毒蛋白作用于Bcl-2家族 3.2.1.3 病毒FILPs蛋白 3.2.1.4 caspase抑制蛋白 3.2.1.5 病毒蛋白作用于死亡受体 3.2.2 病毒蛋白促凋亡机制 3.2.2.1 直接促进MMP 3.2.2.2 间接促进MMP 3.2.2.3 作用于外源性凋亡通路中的关键元件第二部分 研究内容 第一章 ORF4蛋白的检测及生物学特性的研究 1. 材料 1.1 毒株、菌株及细胞 1.2 载体、试剂、抗体及仪器 2. 实验方法 2.1 ORF4相关质粒的构建 2.2 免疫印迹 2.3 间接免疫荧光试验 2.4 真核表达质粒的转染实验 2.5 药物处理试验 2.3.1 药物处理过表达ORF4细胞 2.3.2 药物处理病毒感染细胞 2.6 ORF4过表达细胞系构建及细胞系中ORF4蛋白检测 3. 结果 3.1 ORF4不稳定存在于细胞内,转染后易降解 3.2 瞬时表达ORF4蛋白由蛋白酶体途径降解 3.3 ORF4过表达细胞系中,ORF4蛋白也由蛋白酶体途径降解 3.4 PCV2感染细胞中,ORF4蛋白稳定性差由蛋白酶体途径降解 4. 讨论 第二章 ORF4蛋白亚细胞定位及其定位序列研究 1. 材料 1.1 病毒和细胞 1.2 载体,试剂,抗体及仪器 2. 实验方法 2.1 在线软件分析ORF4蛋白序列 2.2 带GFP标签的ORF4及ORF4缺失突变体的构建 2.3 SDS-PAGE及免疫印迹（WB）实验分析重组质粒蛋白表达 2.4 激光共聚焦显微镜对ORF4线粒体定位分析 2.5 胞浆胞核组分抽提 3. 结果 3.1 ORF4亚细胞定位预测 3.2 激光共聚焦分析瞬时表达ORF4蛋白定位 3.3 激光共聚焦分析稳定表达ORF4蛋白定位 3.4 激光共聚焦分析感染情况下ORF4蛋白定位 3.5 ORF4序列中α-螺旋及跨膜结构域的预测 3.6 ORF4线粒体定位序列（MTS）分析 4. 讨论 第三章 PCV2 ORF4诱导线粒体凋亡功能分析 1. 材料 1.1 毒株,菌株与细胞 1.2 载体,试剂,抗体及仪器 2. 实验方法 2.1 ORF4过表达和病毒接种 2.2 药物处理 2.3 凋亡指标caspase3,8,9的检测 2.4 TUNEL试验 2.5 线粒体及胞浆组分的抽提以及细胞色素c释放的检测 3. 结果 3.1 瞬时表达ORF4对不同细胞凋亡影响 3.2 ORF4稳定转染细胞系中,ORF4对凋亡影响 3.3 ORF4瞬时表达对caspase8和caspae9活性影响 3.4 不同细胞中,ORF4瞬时表达对细胞色素c及凋亡诱导因子释放影响 3.5 PCV2感染情况下,对caspase9切割影响 3.6 TUNEL试剂盒检测缺失毒及野毒对细胞凋亡影响 3.7 病毒感染对caspase3、8、9活性影响 3.8 病毒感染对细胞色素c释放的影响 3.9 ORF4对凋亡的诱导与其线粒体定位相关 4. 讨论 第四章 ORF4蛋白诱导线粒体凋亡的机制研究 1. 材料 1.1 毒株,菌株与细胞 1.2 载体,试剂,抗体及仪器 2. 实验方法 2.1 ORF4与ANT3互作研究 2.1.1 免疫共沉淀试验 2.1.1.1 真核表达质粒构建 2.1.1.2 免疫共沉淀（Co-IP） 2.1.1.3 小分子蛋白电泳（Tricine SDS-PAGE） 2.1.2 GST-pull down试验 2.1.2.1 原核蛋白表达 2.1.2.2 GST-pull down 2.1.3 激光共聚焦试验与SIM 2.2 ANT3沉默细胞系构建 2.2.1 猪源ANT3有效沉默片段的设计与筛选 2.2.2 慢病毒包装 2.2.3 慢病毒介导的ANT3干扰细胞系构建 2.3 ANT3干扰后,ORF4过表达对凋亡诱导及ORF4定位影响 2.3.1 ANT3干扰后,ORF4过表达对凋亡指标caspase3、8、9及PARP的影响 2.3.2 ANT3干扰后,对ORF4定位影响 2.4 ANT3干扰后对PCV2病毒诱导凋亡的影响 2.4.1 ANT3干扰后对PCV2病毒诱导的caspase3、9的裂解检测 2.4.2 ANT3干扰后对PCV2病毒诱导的细胞色素c释放检测 2.4.3 ANT3干扰后对PCV2病毒复制的影响 3 结果 3.1 ORF4蛋白与线粒体蛋白体外互作关系分析 3.2 ORF4与ANT3互作区域分析 3.3 成功构建沉默ANT3的PK15细胞系 3.4 干扰ANT3对ORF4瞬时表达诱导凋亡的影响 3.5 干扰ANT3对ORF4瞬时表达定位的影响 3.6 干扰ANT3对PCV2感染诱导的caspase3,9活性的影响 3.7 干扰ANT3对PCV2感染诱导的细胞色素c释放的影响 3.8 感染ANT3对PCV2病毒复制的影响 4. 讨论全文总结展望参考文献第三部分 附录 附录A 本文所涉及的引物及重组质粒 附录B 全文缩略语 附录C 常用缓冲液及配方致谢作者简历
文章来源
类型: 博士论文
作者: 林翠
导师: 周继勇
关键词: 猪圆环病毒型,蛋白,线粒体凋亡,腺嘌呤核苷酸转移酶亚型
来源: 浙江大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,畜牧与动物医学
单位: 浙江大学
基金: 国家自然科学基金(31230072,31402198),国家科技支撑计划项目课题(2015BAD12B01)
分类号: S852.651
总页数: 168
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标签：猪圆环病毒型论文; 蛋白论文; 线粒体凋亡论文; 腺嘌呤核苷酸转移酶亚型论文;
