王琦, 李伟鹏, 黄仲曦[1]2005年在《人类肿瘤特异性启动子计算机识别方法研究》文中指出本文介绍了一种利用转录因子结合位点应用计算机技术对人类肿瘤特异性启动子进行预测的方法。实验结果证明该方法具有较高的准确性。
王琦[2]2004年在《人类肿瘤特异性启动子计算机识别技术研究》文中认为2003年4月，随着破译生命密码的人类基因组计划完成，后基因组时代已经拉开序幕，如何利用人类基因组计划所测得的数据进行研究，发现基因的编码规律、基因表达网络的调控规律，这对当代科学家提出了严峻的挑战。 肿瘤基因治疗急待解决的关键问题之一就是如何调控目的基因对肿瘤进行专一性表达。要达到这一目的方法之一就是应用肿瘤特异性启动子，因此如何寻找肿瘤特异性启动子就具有非常重要的意义。 随着人类基因组计划的完成、功能基因组学的发展，大量的生物序列数据已经存储在公共数据库中，如何应用生物信息学技术、利用国际互联网络，以现有序列的已知功能和序列数据为基础，开展基于计算机技术的肿瘤特异性启动子识别方法研究，这对于肿瘤的基因治疗、已知和未知功能基因的表达调控序列的确定、相互作用规律的阐明，都具有很好的指导作用。 本文通过研究肿瘤特异性启动子的生物学特点以及相关数据，利用国际互联网络获取的生物序列数据为基础，提出了两种利用转录因子结合位点为特征的肿瘤特异性启动子计算机识别方法，并验证了两种方法的有效性。研究结果表明：两种方法都具有较好的识别效果，是可行的利用计算机技术进行肿瘤特异性启动子识别的方法。 本研究主要目的在于： 1、对后基因组时代国际互联网上生物学测序所获得大量序列数据进行研究，从相关生物数据库提取信息，开展序列内部隐含信息的挖掘。 2、研究肿瘤特异性启动子计算机识别的方法，为基于计算机技术的肿瘤特异性启动子识别研究探索方向。
王琦, 李伟鹏, 黄仲曦, 杨琳[3]2004年在《利用转录因子结合位点识别人类肿瘤特异性启动子研究》文中研究表明目的研究应用计算机技术对人类肿瘤特异性启动子进行识别、预测。方法通过收集肿瘤特异性启动子序列、转录因子结合位点序列、非肿瘤启动子序列3种数据集合,利用转录因子结合位点在不同序列集合中的密度求出各位点的对应密度比,确定识别特征,进行肿瘤特异性启动子的识别。结论该方法具有较高的准确性,在保证对训练集合90%以上的识别率的情况下,对测试集合的识别率达到80%以上。
唐爱发, 张振明, 桂耀庭, 蔡志明[4]2010年在《睾丸特异性启动子计算机识别方法研究》文中进行了进一步梳理目的研究应用生物信息学技术对小鼠睾丸特异启动子进行识别、预测。方法分析睾丸特异性启动子序列和非睾丸特异性启动子序列,通过反式作用因子在两种序列中的对应密度比,确定识别特征,进行睾丸特异性启动子识别。结果收集了24条睾丸特异性启动子序列,分析得到9个反式作用因子及其特征向量。结论本方法对小鼠睾丸特异启动识别、预测具有较高的准确性。
周杰[5]2008年在《金属基质蛋白酶及其组织抑制物与卵巢癌浸润转移关系的相关研究》文中研究指明卵巢癌是最常见的女性恶性肿瘤之一,它的5年存活率低。侵袭和转移是卵巢癌重要的生物学特征,是引起卵巢癌患者死亡的主要原因。基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)通过降解细胞外基质在肿瘤的侵袭和转移中起了关键性的作用。基质金属蛋白酶组织抑制物-1(Tissue inhibitors of metalloproteinase-1,TIMP-1)是MMP-9的天然抑制物,它可与MMP-9形成复合物从而限制MMP-9的功能。因此,本课题探讨MMP-9及TIMP-1在卵巢恶性肿瘤发生、发展、转移及其预后中的价值。卵巢肿瘤患者血清金属基质蛋白酶-9测定及临床价值目的:探讨血清基质金属蛋白酶-9(MMP-9)测定对卵巢恶性肿瘤诊断、病情监测和转移预后的价值。方法:采用酶联免疫吸附法(ELISA)对15例健康妇女(对照组)、15例卵巢良性肿瘤(良性组)及55例卵巢恶性肿瘤(恶性组)进行血清MMP-9含量分析。结果:恶性组治疗前血清MMP-9含量472.95±169.48ng/ml显着高于良性组的230.99±91.81ng/ml及对照组的72.99±2.57ng/ml(P＜0.05)。恶性术后组血清MMP-9含量424.11±175.66ng/ml和复发组血清MMP-9含量478.13±183.90ng/ml也明显高于良性组和对照组,差异有显着性(P＜0.05)。恶性配对组中治疗前血清含量513.82±133.18ng/ml高于术后组437.15±144.41ng/ml(P＜0.05)。结论:血清MMP-9含量在卵巢恶性肿瘤中异常升高,可作为卵巢恶性肿瘤有价值的诊断、评价手术效果以及判断复发的指标。卵巢恶性肿瘤组织中MMP-9抑制物TIMP-1基因突变与其临床病理的关系研究目的:探讨TIMP-1基因突变与卵巢恶性肿瘤临床病理的关系及在卵巢恶性肿瘤发生、发展过程中的作用。方法:应用单链构象多态性分析(SSCP)检测39例卵巢恶性肿瘤患者,10例卵巢良性肿瘤患者,18例正常卵巢组织中TIMP-1基因突变情况。结果:TIMP-1基因第一、第二和第叁编码外显子及其周边区域序列未检测到突变。TIMP-1基因第四编码外显子及其周边区域序列在我们检测的67例卵巢组织中,除了检测到的1例错义突变及1例内含子突变外,检测到具有NCBI中SNPsID为rs4898的SNP位点(TIMP-1基因第3296位)的共48例,其中突变纯合子为17例,突变杂合子为31例,在此SNP位点上,等位基因为T的占50%,为C占50%。Ⅰ～Ⅱ期患者该SNP位点突变为C的比例明显大于Ⅲ～Ⅳ期患者,差别有统计学意义(P＜0.05)。TIMP-1基因第五编码外显子除了检测到的2例错义突变及一例位于非编码外显子的外显子区域突变外,检测到具有NCBI中SNPsID为rs11551797的SNP位点(TIMP-1基因第4251位)的共29例,其中突变纯合子为6例,突变杂合子为23例。在此SNP位点上,等位基因为C的占72.7%,为T占27.3%。结论:恶性卵巢肿瘤组织能检测到错义突变,正常卵巢组织及良性卵巢肿瘤组织未能检测出错义突变,错义突变可能影响TIMP-1在恶性卵巢肿瘤组织中的功能;位于第四编码外显子的一SNP位点(TIMP-1基因第3296位)可能是卵巢恶性肿瘤发生、发展的早期事件。卵巢恶性肿瘤组织中MMP-9抑制物TIMP-1基因启动子区域CpG岛甲基化与其临床病理关系的初步研究目的:探讨TIMP-1基因启动子甲基化与卵巢恶性肿瘤发生发展的关系。方法:应用甲基化特异性聚合酶链式反应(Methylation-specific PCR,MS-PCR)检测39例卵巢恶性肿瘤患者,10例卵巢良性肿瘤患者,18例正常卵巢组织中TIMP-1基因启动子区域CpG岛甲基化情况。结果:正常卵巢组织中TIMP-1启动子区域CpG岛甲基化程度为83.33%(10/12),良性卵巢肿瘤组织为100%(5/5),恶性卵巢肿瘤组织为100%(10/10),TIMP-1启动子区域CpG岛总甲基化率高达92.6%。结论:MSP法不能区分正常女性Xi染色体上TIMP-1启动子区域CpG岛甲基化及能导致肿瘤细胞TIMP-1基因表达下降的另一条X染色体(Xa染色体)启动子区域CpG岛甲基化。
黄仲曦[6]2003年在《生物信息学初步探索鼻咽癌发病机理》文中指出近几十年的研究积累了大量的电子形式的生物医学数据和知识，而一个问题的答案往往隐藏在这大量的信息当中。随着信息的急剧增加，离开计算机的辅助分析而寻求答案已经是不可能的了。探索肿瘤发病机理同样要在实验研究和计算机分析相辅相成的作用下一步步向前发展。 肿瘤的发病是一个多阶段的过程。从正常细胞到恶性肿瘤细胞需要发生六次本质的遗传改变：生长信号的自足，对生长抑制信号的不敏感，逃避程序性死亡，无限制的复制潜力，维持血管生成，以及组织浸润和转移等。不仅如此，每个阶段还可以通过不同的途径以不同的机制实现，因此它是一个多阶段、多途径、多机制的过程。肿瘤的发病机制隐藏在大量的检测数据和积累的知识当中。 肿瘤病理形态学研究指出鼻咽癌经过单纯增生/化生、异型增生/化生、原位癌、微小浸润癌、转移癌等阶段发展而来。由于临床上无法取得足量的各阶段人鼻咽癌材料，也由于至今没有合适的动物模型，给探索鼻咽癌发病机制带来了困难。 姚开泰提出了鼻咽癌发病机理的假说。随着分子生物学技术的飞速发展，研究积累了大量的鼻咽癌相关知识和数掘。这些信息当中隐藏着鼻咽癌发病机制的更深层答案。本研究仅试图就其中的比较基因组杂交、鼻咽癌细胞中EBV与机体相互作用以及肿瘤特异性转录调控叁个方面的信息进行初步数据挖掘；而更多信息(如微阵列表达谱、蛋白质芯片数据、核酸多态性、鼻咽癌细胞中的异常信号通路和质谱数据等)的挖掘还有待下一步进行研究。 比较基因组杂交(CGH)能够在全基因组范围内观察肿瘤细胞与正常(对照)细胞有明显DNA数量不同的染色体区域。这些拷贝数异常的染色体区域可能是肿瘤相关基因的所在区域；过表达的致瘤基因可能存在于扩增区域;而低表达的抑瘤基因可能存在于丢失区域。 在肿瘤的发病过程中，染色体变异有关联发生的倾向;而且就象vogelstein的路径假说一样，可能存在先后关系。而当肿瘤发展到晚期时，由于基因组的稳定性严重破坏，会继发大面积的染色体变异，这些变异呈随机事件发生，可能与肿瘤的发病无关。因此，Desper等人采用Brodeur的方法选择与肿瘤发病相关的染色体变异，并发明了两种方法(构建距离树和分枝树模型)来寻找它们的关联倾向和先后关系。但是由于边界问题难于解决，他们只能在染色体臂水平构建树模型。这给后期的实验带来巨大的工作量。 为此，本研究采用Brodeur和Desper的方法，并利用重迭区域构建树模型(从而将研究从染色体臂水平提高到染色体区带水平)，分析164例鼻咽癌的比较基因组杂交数据，寻找鼻咽癌细胞中与发病相关的染色体变异以及它们的关联倾向和先后顺序。结果发现与鼻咽癌发病相关的染色体变异为:染色体区带3p26一13、1 1 q22一25、1 6q 12一24、14q24一32、13qZI一32和9p23一21的丢失以及染色体区带12plZ、12q13一15、lq22一32、3ql3.1一26.2和8q22.1一24.2的扩增。它们的关联倾向将鼻咽癌分作叁类。第一类包括:+3 ql3.1一26.2(“+”代表扩增，“一”代表丢失)。第二类包括:+12plZ，+12ql3一15，和+8q22.l一24.2。第叁类包括:一3P26一23，一16qlZ一24，一14q24一32，一13qZI一32，一llq22一25，一9p23一21，和+l q22一32。结果还暗示了每类成员发生的先后顺序。第二类首先发生+12plZ，然后+12ql3一xs，最后+8q22.l一22.4;第叁类首先发生一3p26一13，随后发生一14q24一犯、一z3qZI一32、一11q22一25、一9p23一21或+lq22一 32。一14q24一32之后还可以继发一16q21一24。树模型的结果与分子生物学实验发现的3P26一13的丢失是早期事件，8q22.1一242的扩增和9p23一21的丢失是晚期事件的现象相符;树模型还预测了12pl2和12q13一巧的扩增是重要的早期事件，13q21一32的丢失是重要的晚期事件。本研究还讨论了树模型上的己知鼻咽癌相关基因，染色体分类与分子分类相比的优缺点以及树模型的应用前景。 EB病毒可能在鼻咽癌发病的过程中也起着重要的作用。由于至今没有包含EBV基因的微阵列，使得无法在基因组范围内探索EBV与机体的基因共表达模式，而难于全面阐述EBV对鼻咽癌发病的影响。 3 实际上，针对EBV与鼻咽癌细胞中的基因或蛋白的相互作用的研究已开展得相当多，并且大多数的研究都以文献的形式报道。目前有关EBV和鼻咽癌的文献有1368篇。这些大量的文献当中实际上己经蕴藏了一张EBV与机体的基因及其编码蛋白的相互作用网络轮廓图。提取这张轮廓图将是对目前无法全面考察EBV与机体的核酸及蛋白相互作用对鼻咽癌发病的影响的一种弥补。 因此，本研究通过文献分析的方法，构建鼻咽癌细胞中EBV与机体的基因和蛋白相互作用的网络图，从机体细胞对ESV基因表达调控、EBV蛋白调控细胞的信号通路、EBV参与肿瘤发病所需的六个能力、EBV逃避免疫反应的可能机制等几个方面阐述EBv参与鼻咽癌发病的部分机制。结果还发现了
苏加强[7]2012年在《双特异性溶瘤腺病毒对人食管癌细胞EC-109的体内外抑制作用研究》文中认为在所有恶性肿瘤中食管癌是导致病人死亡的第六位病因，该病是目前应用传统治疗方法最难治愈的恶性肿瘤之一。令人担忧的是，尽管在过去的几十年里食管癌的治疗已经采用了以侵入性外科手术为中心的多模式治疗策略，但病人的总体生存率没有得到实质性的改善。目前，食管癌的发病率与死亡率几乎相等，这说明现在该病的治疗方法是不成功的，现在急需一种新的治疗策略来改变这种局面。以腺病毒为基础发展起来的载体被广泛应用于肿瘤的基因治疗策略之中，然而，肿瘤基因治疗的成败取决于它的特异性及有效性。为了达到以上目的，近年研发的条件复制型腺病毒给肿瘤基因治疗提供了新的平台。依据条件复制型腺病毒的设计理念，我们在既往的工作中应用RAPAd.I载体系统，整合了肿瘤特异性启动子PEG-3p和肿瘤特异性抗癌基因Apoptin成功构建了具有肿瘤特异性启动复制及肿瘤特异性杀伤功能的双特异性溶瘤腺病毒Ad-VP（Ad-PEG-3p-E1a-Apoptin），而且在实验中观察到了Ad-VP这种条件复制型腺病毒比复制缺陷型重组腺病毒Ad-Apoptin及Ad-EGFP更有效力。细胞凋亡是一种生理性的、程序化的细胞主动消亡过程，这种自主的细胞死亡过程除去了正常组织中多余或者衰老无效的细胞，从而保证了机体的正常代谢和功能。在人类许多恶性肿瘤组织中细胞凋亡时常发生，因此，诱导肿瘤细胞凋亡可能是一种强有力的肿瘤治疗方法。Apoptin来自于鸡的贫血因子，它具有不依赖于p53基因，不能被Bcl-2基因抑制的方式诱导多种人类癌症细胞发生凋亡，其中包括肝细胞癌、恶性淋巴瘤、胆管上皮细胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌以及大肠癌等。值得欣喜的是，Apoptin对正常的非转化细胞却没有凋亡诱导作用，比如：成纤维细胞、角质形成细胞以及平滑肌细胞等。Apoptin特异性肿瘤凋亡诱导功能的机制虽然没有完全阐明，但与caspase-3活化有关。Apoptin特异性肿瘤凋亡诱导功能与其亚细胞定位有关，正常细胞中Apoptin主要位于细胞质当中，而在转化细胞之中主要在细胞核中定位。有意思的是，caspase上游的抑制因素或者p53的缺失没有阻止Apoptin的凋亡诱导功能，而且抗凋亡基因Bcl-2、BAG-1以及Bcr-Abl也不能抑制Apoptin的凋亡诱导功能。并且因为VP3基因体积很小可以很容易插入到乳多泡病毒、腺病毒等多种病毒的基因组内，以上这些优点提示Apoptin在未来的肿瘤基因治疗中会很有潜力。PEG-3p是PEG-3启动子的最小功能单位。有研究表明，PEG-3p能够在人类肝癌细胞HepG-2、肺癌细胞A549以及宫颈癌细胞HeLa中驱动基因表达，而这种驱动作用在正常的人胚肺细胞WI-38及非洲绿猴肾细胞Vero中却不起作用。近年来，以溶瘤腺病毒为基础的癌症基因治疗在临床前及临床试验中有了广泛的研究。我们先前构建了双特异性溶瘤腺病毒Ad-VP（Ad-PEG-3p-E1a-Apoptin），本实验即应用Ad-VP作用于人食管癌EC-109细胞，在体外通过MTT分析发现在感染剂量为100MOI的条件下，72小时Ad-VP达到了杀伤作用的顶峰，而在1MOI或10MOI时，肿瘤抑制作用明显降低。这说明Ad-VP对EC-109细胞杀伤作用具有剂效及时效关系。相反，这种关系在Ad-Apoptin和Ad-EGFP感染的实验中却没有体现。进一步的AO/EB,DAPI和Annexin V染色分析证明了Ad-VP对EC-109细胞具有明显的杀伤作用。而Ad-VP感染的正常人胚肝细胞L02却没有受到抑制。线粒体途径是细胞凋亡的重要信号通路，细胞凋亡时通常会发生线粒体跨膜电位的丧失，并导致细胞色素C的释放。而且，caspases的活化在细胞凋亡过程中起到核心的作用，无论外源性凋亡途径还是内源性凋亡途径，均通过caspase酶达成凋亡效果。本研究还进一步探讨了Ad-VP诱导凋亡的途径。结果表明，Ad-VP感染EC-109细胞后，造成EC-109细胞线粒体膜电位下降和细胞色素c释放。同时，Ad-VP感染还导致caspase酶活化及caspase酶底物裂解。然而，Ad-VP感染L02细胞后，对线粒体膜电位、细胞色素c和caspase酶均无影响。研究表明，Ad-VP通过线粒体途径诱导了EC-109细胞凋亡，caspase-3、-6和-7在此过程中发挥了重要作用。本研究的动物实验表明，瘤内注射Ad-VP可以显着抑制肿瘤的生长并提高了荷瘤动物的生存率，但是没有彻底消灭荷载的肿瘤，以上结果补充了体内研究的实验数据。总之，双特异性溶瘤腺病毒Ad-VP诱导EC-109细胞发生了显着的凋亡，而这种细胞凋亡诱导作用是通过caspases激活的线粒体途径实现的。Ad-VP在今后食管癌的临床基因治疗中可能会具有很大的潜力。
李霄[8]2009年在《双特异性抗肿瘤重组腺病毒的构建、鉴定及实验免疫》文中研究说明本研究利用分子生物学、病毒学和免疫学等技术和手段,旨在探索抗肿瘤过程中存在的安全性和有效性问题。首先,通过同源重组方法构建了分别含有肿瘤特异性启动子hTERTp、PEG3p和特异性抑癌基因HN、Apoptin的双特异性重组腺病毒:Ad-VT、Ad-VP、Ad-HT、Ad-HP;同时构建了表达EGFP基因的对照重组腺病毒病毒:Ad-GT、Ad-GP。通过一系列实验研究证明,所获得重组腺病毒性状稳定,形态完整、增殖性能未受影响。本研究采用MTT染色、AO/EB染色、流式细胞术等方法检测了重组腺病毒感染对A549肺癌细胞的抑制作用。结果表明,Ad-VT、Ad-VP、Ad-HT、Ad-HP均可不同程度地抑制体外培养的A549肿瘤细胞。利用Annexin V染色、DAPI染色、Caspase活性检测等方法探讨了所构建重组腺病毒致A549细胞死亡的方式。结果表明,Ad-VT、Ad-VP、Ad-HT、Ad-HP主要以诱导凋亡的方式抑制体外培养的A549肿瘤细胞。本研究复制了C57BL/6小鼠荷小鼠肺癌(LLC)肿瘤模型,探讨了所构建双特异性抗肿瘤重组腺病毒对体内实体肿瘤的抑制作用。实验结果显示,Ad-VT、Ad-VP、Ad-HT、Ad-HP均可不同程度地抑制实体肿瘤的生长,提高荷瘤动物模型生存率,延长荷瘤动物模型生存期。另外,Ad-HT、Ad-HP还可以刺激产生抗肿瘤免疫反应。上述研究为研制安全、高效的抗肿瘤制剂奠定了基础,并为揭示HN、Apoptin的抑瘤和免疫调控机理提供了参考数据。
侯德富[9]2011年在《鼻咽癌候选抑瘤基因NPCEDRG表达调控的初步研究》文中研究说明鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种具有明显种族和地区分布特征的上皮源性头颈部恶性肿瘤。其病因涉及到遗传因素、EB病毒的感染、饮食和某些环境中的化学致癌物的作用等。鼻咽癌的发生是一个多因素多步骤的病理过程,研究发现数十个与鼻咽癌相关的基因,其中抑瘤基因的失活更为普遍,如位于染色体3p21-3区的RASSF1A、BLU、LTF、LARS2、SEMA3B、SEMA 3F和GNAT1等候选抑瘤基因与鼻咽癌发生密切相关。本所对湖南鼻咽癌高发家系进行连锁分析,发现染色体3p21部分区域与湖南家族性鼻咽癌发病紧密连锁。有研究证实在我国南方,正常鼻咽上皮和鼻咽癌前病变以及鼻咽癌组织存在3p染色体(包括3p21.3)丢失,这有力地证明染色体3p21.3区抑瘤基因的功能失活为鼻咽癌发生发展中的早期事件。NPCEDRG基因是我们实验室采用基因定位候选克隆策略获得的一个在正常鼻和鼻咽癌组织表达差异具有显着性的基因,定位于染色体3p21-3,该点存在于湖南家族性鼻咽癌的遗传易感区3p21.31-21.2区域内。我们前期研究结果表明,NPCEDRG在部分鼻咽癌细胞系、鼻咽癌组织中表达下调,过表达NPCEDRG基因可抑制鼻咽癌细胞增殖和细胞周期进程,并部分逆转CNE2的恶性表型,提示NPCEDRG基因可能为个鼻咽癌候选抑瘤基因。为了揭示NPCEDRG基因在鼻咽癌细胞和组织中表达下调的分子机制,更深入地阐明NPCEDRG基因的生物学功能,本研究应用生物信息学对候选抑瘤基因NPCEDRG基因进行全面分析,应用5'-Race及3'-RACE及RT-PCR等技术对其选择性剪接变异体进行了探讨,并对预期的蛋白异形体进行了氨基酸序列的推导和功能预测。应用生物信息学预测NPCEDRG基因的启动子区域及转录因子结合位点,成功克隆了其5’-端启动子区域,并利用缺失突变,报告基因、转染技术对该该基因启动子区域进行初步鉴定,应用电泳迁移阻滞分析实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)的分析顺式作用元件。以期明确NPCEDRG基因在鼻咽癌发生机制中的功能提供一些线索。[NPCEDRG基因结构及同源性分析]人NPCEDRG基因定位于湖南家族性鼻咽癌的遗传易感区3p21.31-21.2区域内,其基因全长为6992 bp,由于剪接方式不同形成至少9种mRNA剪接变异体,编码至少3种不同的蛋白质。利用比较基因组学分析发现人NPCEDRG基因与黑猩猩、猕猴、狗、牛及小鼠等5种动物高度同源,说明NICN1基因是一个比较保守的基因。[生物信息学预测NPCEDRG基因表达调控元件]利用多种生物信息学软件对NPCEDRG基因5’-端上游调控区-3500～+500bp区域进行分析。该区域存在2个CpG岛,分别位于-1573～-960bp和-624～+265bp,其中-624～+265bp区域包含所有剪接变异体的第一外显子及约600 bp的5’末端上游调控序列,提示该区域可能为NPCEDRG基因的启动子区域并且在基因表达过程中起重要的调控作用。NPCEDRG基因可能有多个TSS位于-225 bp～+137 bp区间,主要介于ATG上游-99 bp～-17 bp区间。Gene2promoter软件分析TSS位于-73bp和-49 bp处,启动子介于-624 bp～+75 bp。PromoterInspector未预测到任何启动子区。综合分析各软件预测结果,初步确定NPCEDRG启动子区可能介于-624 bp～+75 bp区间。选取人类NICN1基因5’末端上游调控区(-625bp～+250bp)875bp序列,采用Matlnspector V2.2软件和TESS软件搜索转录因子结合位点。如图1-7所示,均未检测到经典的TATA保守序列,但包含CCAAT、SP1、AP1、AP2、STAT1、c-Myb、AREB6、Nkx2-5、ZF5、E2F1、CREBP1和RBPJK等重要调控元件。利用在线程序ECR Browser进行系统发育进化足迹分析,结果显示在人和小鼠等6物种间在-180 bp～+240 bp区间约420 bp序列高度保守,该保守区域中存在包括CCAAT, STAT1和SP1/SP1_Q2/SP1_Q6/E2F_Q2/ZF5/CACD等转录因子结合位点。这些预测结果为进一步鉴定NPCEDRG基因的启动子区及其调控元件,为探讨其表达调控机制奠定了基础。[NPCEDRG基因在肿瘤细胞中的表达检测及mRNA剪接变异体分析]利用RT-PCR检测11种鼻咽癌细胞及4种其他肿瘤细胞中NPCEDRG基因总体mRNA和AF538150 mRNA的表达情况,结果显示NPCEDRG基因总mRNA表达在HK1和6-10B细胞中非常低,在其他细胞中表达相对较高；而AF538150 mRNA在HNE1、HNE2、HNE3、C666-1、HK1、HONE1、5-8F、6-10B、915及A549细胞中表达非常低,而在CNE1、CNE2、NP69、MCF7、HeLa及HL60细胞中其表达相对较高。利用5'-RACE、3'-RACE和RT-PCR在CNE2细胞中进行各种剪接变异体克隆、鉴定,结果发现至少有7种剪接变异体,编码分别由213、171和98个氨基酸组成的蛋白质。NPCEDRG基因至少有7个转录起始位点,分别位于起始密码子ATG上游-95nt、-85 nt、-58 nt、-52 nt、-25nt、-22 nt及-19 nt,其中NM_032316的TSS位于ATG上游-85 nt处、AF538150和AK094248的TSS位于-25 nt处。证实AF538150不存在第2外显子中6核苷酸序列(5'-TTGCAG-3')的缺失,其CDs为516 bp,编码一种由171个氨基酸组成的蛋白质(而非GenBank中公布的CDs为510 bp,一种由169个氨基酸组成的蛋白质)。成功克隆得到一种新的NPCEDRG基因的mRNA剪接变异体V2,其TSS位于-23 nt处,其CDs为297 bp,编码—种由98个氨基酸组成的蛋白质,其分子量为10.4 kD,等电点为7.1。[NPCEDRG基因启动子的克隆、鉴定及其调控元件的初步分析]依据生物信息学分析结果,构建一系列5’-或3’-端缺失的启动子片段Luc报告基因载体。瞬时转染至MCF7. HeLa和CNE2叁种细胞中,荧光素酶活性分析结果表明NPCEDRG基因5’-端调控区-1180～-8 bp区间各Luc报告基因质粒均有较强启动子活性,其中pGL3-en617的荧光素酶活性最强,约为pGL-contral的33.46-52.34%,提示-625～-8 bp区间为最佳的启动子区域；pGL3-en138的荧光素酶活性约为pGL-contral的15.80-21.12%,表明-146～-8 bp区间为NPCEDRG基因的基础启动子区域。在-1180～-8 bp区间相邻各区段启动子活性比较发现,pGL3-en207与pGL3-en617比较启动子活性降幅最大,在叁种细胞中分别达到40-45%,因此,我们推测在NPCEDRG基因5’-端调控区-625～-216 bp区间可能存在增强其启动子活性的调控元件进一步构建pEGFP-en617. pEGFP-en207及PEGFP-en138等启动子区EGFP报告基因载体并转染至MCF7细胞中,荧光显微镜直接观察及Western Blot检测EGFP蛋白表达,与Luc报告基因载体荧光素酶活性测定结果基本吻合,再次确证NPCEDRG基因5’-端调控区-625～-8 bp区间为NPCEDRG基因的最佳启动子区,-146～-8 bp区间为其基础启动子区。生物信息学分析结果提示NPCEDRG基因启动子为不含TATA,含有CCAAT盒及GC富集区,可能存在CCAAT/NFY, STAT1和SPl等转录因子结合位点。凝胶电泳迁移率阻滞分析(EMSA)初步确定CCAAT/NF-Y转录因子结合位点参与了NPCEDRG基因的表达调控。
李玮[10]2013年在《GFAP及hTERT双启动子靶向性表达hNIS基因引导放射性碘治疗胶质瘤》文中认为研究目的放射性碘治疗甲状腺癌是临床常用方法。非甲状腺来源肿瘤通过转染hNIS基因也能摄取碘,端粒酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)和神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)启动子都是肿瘤特异性启动子,对于靶向性治疗胶质瘤有潜在的研究价值。方法先扩增GFAP、hTERT启动子等基因,并保存于相应质粒中。并测定各启动子的启动效率,然后构建了hTERT启动子引导腺病毒早起蛋白(early region1A, E1A)基因同时GFAP启动子引导钠碘转运体(human sodium iodide symporter, hNIS)基因的条件复制腺病毒。胶质瘤细胞被腺病毒转染后,利用病毒空斑形成实验检测条件复制腺病毒的复制能力。进行Western blots实验,1251内流及外流实验并进行1311细胞克隆实验,来评估细胞摄碘情况。最后,在细胞实验的基础上,构建胶质瘤荷瘤裸鼠模型,进行动物体内放射性碘治疗实验。结果成功扩增了相应基因并保存。实验证明GFAP启动子启动效率能达到SV40启动子的60%左右,hTERT启动子启动效率能达到SV40启动子的43%左右。成功构建了条件复制腺病毒Ad-Tp-E1A-Gp-NIS,并感染胶质瘤细胞。Western blot实验显示43、70、49、120、70、110kDa的条带,分别对应着β-acting、GFAP、 hTERT、hNIS和hTPO蛋白。病毒复制实验证明了Ad-Tp-E1A-Gp-NIS的有效性,hTERT启动子能成功的限制腺病毒在肿瘤细胞内的复制。摄1251实验证明GFAP启动子能成功引导hNIS基因表达并摄取碘。细胞克隆实验中显示感染Ad-Tp-E1A-Gp-NIS后肿瘤细胞能成功的被1311杀死。成功构建了U87荷瘤裸鼠模型了,感染Ad-Tp-E1A-Gp-NIS并进行放射性碘治疗后裸鼠生存周期延长,肿瘤生长被抑制,核素显像显示荷瘤裸鼠肿瘤部位能靶向性摄取放射性核素。结论实验证明感染条件复制腺病毒Ad-Tp-E1A-Gp-NIS后,细胞实验及动物实验均证明,胶质瘤细胞系表现出肿瘤特异性的碘摄取,并引导针对胶质瘤的放射性碘治疗。
参考文献：
[1]. 人类肿瘤特异性启动子计算机识别方法研究[J]. 王琦, 李伟鹏, 黄仲曦. 北京生物医学工程. 2005
[2]. 人类肿瘤特异性启动子计算机识别技术研究[D]. 王琦. 第一军医大学. 2004
[3]. 利用转录因子结合位点识别人类肿瘤特异性启动子研究[J]. 王琦, 李伟鹏, 黄仲曦, 杨琳. 第一军医大学学报. 2004
[4]. 睾丸特异性启动子计算机识别方法研究[J]. 唐爱发, 张振明, 桂耀庭, 蔡志明. 中国男科学杂志. 2010
[5]. 金属基质蛋白酶及其组织抑制物与卵巢癌浸润转移关系的相关研究[D]. 周杰. 广西医科大学. 2008
[6]. 生物信息学初步探索鼻咽癌发病机理[D]. 黄仲曦. 中国人民解放军第一军医大学. 2003
[7]. 双特异性溶瘤腺病毒对人食管癌细胞EC-109的体内外抑制作用研究[D]. 苏加强. 吉林大学. 2012
[8]. 双特异性抗肿瘤重组腺病毒的构建、鉴定及实验免疫[D]. 李霄. 吉林大学. 2009
[9]. 鼻咽癌候选抑瘤基因NPCEDRG表达调控的初步研究[D]. 侯德富. 中南大学. 2011
[10]. GFAP及hTERT双启动子靶向性表达hNIS基因引导放射性碘治疗胶质瘤[D]. 李玮. 天津医科大学. 2013
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