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芽孢杆菌纤溶酶基因的克隆表达

2020-12-08阅读(692)

芽孢杆菌纤溶酶基因的克隆表达

论文摘要

随着人类生活节奏的加快,血栓性疾病成为了一种常见病、高危病。溶栓药物的需求量也在增加。相关研究人员在微生物源纤溶酶的多方面进行了研究,例如优化各种产酶条件,用基因工程方法改造纤溶酶基因,用一些物理与化学的方法诱变产纤溶酶菌株等等。本研究主要是对产纤溶酶菌株的筛选与鉴定,再通过基因工程的手段,使纤溶酶基因在大肠杆菌表达体系中实现分泌性的表达。本研究取得了以下的成果:1、以贵州大学微生物学实验室从酒曲、酒糟、窖泥等样品中分离的13株菌作为出发菌株,这13株菌能够产酱香味和芽孢。通过脱脂奶粉平板对13株菌株进行初筛,获得6株产蛋白酶能力较强的菌株;再利用纤维蛋白双层平板对6株菌进行复筛,获得一株纤溶酶活力为2344.23IU/mL的菌株,此菌株为GZHZV-8。2、参照《微生物学实验》（沈萍等,1999）第三版、《伯杰氏系统细菌学手册》（David R.Boone等,2001）第九版和《常见细菌鉴定手册》（东秀珠,2001）对GZHZV-8菌株进行形态特征与生理生化鉴定,并结合分子生物学鉴定方法,将此菌鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。3、在数据库查找纤溶酶基因序列,设计扩增纤溶酶基因编码区的特异性引物,扩增产物与pMD18-T克隆质粒经限制性内切酶双酶切后,连接、转化到E.coil DH5α,重组质粒序列全长为1205bp,ORF区包含1089bp,编码363个氨基酸;在线对克隆序列分析显示,克隆的纤溶酶基因序列与来自解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）的AprE（aprE）基因（NCBI登录号GU825966.1）,在核酸水平上相似度为99.65%,氨基酸水平上相似度为100%;经过相关的生物信息学在线网站预测分析,是一种稳定的、亲水性的分泌型蛋白。不存在显著的跨膜区,包含两个保守结构域。蛋白分子量为36.99kDa,理论等电点（PI）为8.73,对蛋白结构预测显示,发现无规则卷曲占比36.64%,α螺旋占比28.37%,延伸链占比23.69%和β转角占比为11.29%。三维结构模型与模板3whi.1.A相似度为86.36%,具有DNA的结合区。4、使用限制性内切酶酶切目的DNA与表达空质粒,用T4 DNA Ligase enzyme连接,转入E.coli BL21（DE3）感受态细胞,得到含有纤溶酶基因的表达菌株,表达菌株用1mmol/L浓度的IPTG诱导培养48h后测定纤溶酶活性,测得发酵上清液、菌体细胞破碎上清液和菌体细胞破碎沉淀的纤溶酶活力分别为613.26IU/mL、407.38IU/mL、993.12IU/mL。表达菌株在1mmol/L的IPTG诱导7小时后,表达量较高。发酵上清液具有溶解血栓的作用。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 前言
  •   1.1 文献综述
  •     1.1.1 血栓性疾病
  •     1.1.2 血栓疾病的治疗
  •     1.1.3 溶栓药物的研究近况
  •     1.1.4 微生物纤溶酶研究现状
  •     1.1.5 纤溶酶基因的克隆表达
  •     1.1.6 纤溶酶活性测定
  •   1.2 研究目的及意义
  •   1.3 技术路线
  • 2 材料与方法
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 实验菌株
  •     2.1.2 PCR扩增引物
  •     2.1.3 实验仪器设备
  •     2.1.4 主要试剂
  •     2.1.5 主要培养基
  •     2.1.6 试剂的配制
  •     2.1.7 核酸电泳相关试剂的配制
  •     2.1.8 蛋白质电泳相关试剂的配制
  •   2.2 方法
  •     2.2.1 产纤溶酶菌株的筛选
  •     2.2.2 产纤溶酶菌株的鉴定
  •     2.2.3 纤溶酶基因的克隆
  •     2.2.4 纤溶酶基因的表达
  • 3 结果与讨论
  •   3.1 产纤溶酶菌株的筛选
  •     3.1.1 产纤溶酶菌株的初筛
  •     3.1.2 尿激酶标准曲线
  •     3.1.3 产纤溶酶菌株的复筛
  •   3.2 产纤溶酶菌株的鉴定
  •     3.2.1 形态特征观察
  •     3.2.2 生理生化鉴定
  •     3.2.3 分子生物学鉴定
  •   3.3 纤溶酶基因的克隆与序列分析
  •     3.3.1 纤溶酶基因的克隆
  •     3.3.2 重组子鉴定
  •     3.3.3 纤溶酶基因序列预测分析
  •   3.4 纤溶酶基因的表达
  •     3.4.1 重组表达质粒的构建与酶切
  •     3.4.2 重组菌纤溶酶的活力测定
  •     3.4.3 体外溶栓实验
  •     3.4.4 重组菌的诱导表达及SDS-PAGE分析
  •   3.5 讨论
  •     3.5.1 高活性纤溶酶菌株的筛选与鉴定
  •     3.5.2 表达载体的选择
  •     3.5.3 表达宿主菌的选择
  •     3.5.4 纤溶酶基因的表达
  • 4 结论
  • 5 展望
  • 致谢
  • 参考文献

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王志会

    导师: 谢和

    关键词: 纤溶酶,鉴定,基因克隆,序列分析,表达

    来源: 贵州大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 贵州大学

    分类号: Q78;Q93

    总页数: 60

    文件大小: 1557K

    下载量: 114

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