论文摘要
生物大分子是所有生命活动的最终执行者,而生物大分子在细胞内所行使的生理功能依赖其特定的三维空间结构。因此,对生物分子的三维结构信息进行研究,对理解分子遗传学,酶学,细胞器的工作机理以及疾病的发生等生物过程都十分重要。核磁共振、X射线晶体衍射和冷冻电镜是现今生物大分子结构解析的三大常用技术。生命过程相关的蛋白体系的结构被解析后,为了进一步研究透彻其结构-功能的内部机制,往往使用计算生物的方法以挖掘更多相关信息。其中,分子动力学模拟的方法发展迅速,已经逐渐由有机小分子转向了激酶、膜蛋白、核糖体、病毒衣壳等蛋白体系的研究应用中。本论文中,我们使用了前沿的理论和实验的分析方法,对三个非常重要的蛋白体系结构与功能的关系进行了不同层面的研究和讨论。第一个研究体系为青枯雷尔氏菌凝集素与甲基-α-L-盐藻糖苷。这是一个碳水化合物结合的蛋白体系。蛋白和碳水化合物的相互作用与细胞-细胞黏附,细胞分化和细胞内信号传导等一系列重要的生命活动过程息息相关。蛋白与碳水化合物的识别依靠二者分子间相互作用。准确预测蛋白与碳水化合物之间的亲和力是针对此类蛋白靶点的药物筛选和药物设计的基础。许多科研人员致力于方法发展来准确预测蛋白-配体的相互作用并应用于药物设计,但对于结构比较柔性的配体分子来说仍然具有挑战性。甲基-α-L-盐藻糖苷就属于结构柔性的配体分子。本研究中,我们为甲基-α-L-盐藻糖苷选择了GAFF和GLYCAM06j两种分子力场,都分别使用了相同的方法（双去耦合方法,double decoupling method,DDM）来对比两种力场的结合自由能的计算结果。自由能计算的每一步都是用Bennett acceptance ratio（BAR）的方法分析一系列中间态轨迹后得到。GLYCAM06j是针对碳水化合物设计的力场,因此计算结果比GAFF的更准确。BAR+TP方法可以用于从低水平（MM）到高水平（QM/MM）哈密顿下的自由能矫正,避免了在高水平哈密顿下进行直接采样,从而极大程度地降低了计算量。除此,我们的计算经验表明:（1）使用DDM方法时,有几个中间态中青枯雷尔氏菌凝集素和甲基-α-L-盐藻糖苷相互作用变弱,需要更长的分子动力学模拟的时间才能达到收敛;（2）使用DDM方法时,需要保持热力学循环初、末两态施加的六个简谐约束势的分布一致;（3）另外,还分别在GAFF和GLYCAM06j下用thermodynamic perturbation（TP）的方法进行了QM/MM修正。发现经过QM/MM修正后,结合自由能的结果与实验值相差更大了。因此揭示了现有方法对QM和MM区域相互作用描述的不足。对这一体系的研究加深了我们对碳水化合物结合的蛋白体系相互作用特征的理解,对于未来更准确的预测此类体系的相互作用能具有参考、指导的意义。第二个研究体系为3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）和SBF1。这是一个磷酸化蛋白结合体系。蛋白磷酸化在正常细胞的调控和信号通路异常相关疾病的发生都扮演着关键的角色。磷酸化蛋白也就自然成为了科研人员的重点研究体系。设计高亲和性、高选择性、高专一性的别构效应抑制剂逐渐成为药物设计领域的一大热点。PDK1蛋白的过量表达与炎症、关节炎、糖尿病、心血管和神经等疾病的发生相关。PDK1蛋白的PIF口袋能够与小分子结合并引起PDK1的别构。SBF1被证明对黑色素瘤和人类宫颈瘤有很好的体内、体外抗生长的作用。本研究中,我们使用了分子对接、分子动力学模拟、MM/PBSA、自由能分解、ala scanning、umbrella sampling等多种理论分析方法研究了SBF1的水解产物SBF1-与PDK1 PIF口袋结合的稳定性、亲和力大小和关键残基。并与PDK1的已知PIF口袋激活剂PS48,PS171,PS182,PS210进行了对比。此外,我们使用multistate Bennett acceptance ratio（MBAR）的方法分析了SBF1-与PDK1 PIF口袋的结合αB end-to-end distance和hinge motion两个反应坐标的二维potential of mean force（PMF）,结果暗示SBF1-是PDK1 PIF口袋潜在的别构抑制剂,对于未来实验工作者进一步验证SBF1-与PDK1 PIF口袋的别构结合提供了理论依据。第三个研究体系为鼠巨细胞病毒（MCMV）。这是一个结构十分巨大的病毒体系（衣壳分子量为兆道尔顿级）。疱疹病毒种类繁多、危害广泛,而且一旦感染将终生潜伏于宿主体内,是一类应该被重视、非常重要的研究体系。目前对疱疹病毒的药物设计止步于高分辨结构的获得和靶点蛋白的选取。人类巨细胞病毒（HCMV）感染对于免疫抑制/缺陷人群的伤害是致命的,而且是子宫内胎儿的先天智力缺陷、耳聋的罪魁祸首。HCMV感染的研究不能在人体进行,因此只能用动物模型代替。MCMV就是HCMV感染大量研究中使用最多的模型体系。先前对MCMV的研究仅限于感染机制和免疫应答方面,缺乏结构方面的研究。我们因此选取了MCMV作为研究体系,使用冷冻电镜技术得到了MCMV的二十面体结构（分辨率为5?）并使用了localized reconstruction的方法提高了MCMV结构的分辨率（分辨率为3.6-3.8?）,并搭建了原子结构模型。通过对比,我们发现MCMV和HCMV的衣壳蛋白十分相似（Tri1 N-anchor结构域差别较大）,与衣壳蛋白结合的一种β-疱疹病毒特有的保守磷酸化蛋白pp150的结合模式却相差很大,具体区别为:（1）pp150在MCMV中为二聚体,在HCMV中为二聚体+单体;（2）Triplex Tc区域,MCMV没有pp150,HCMV中有三个pp150。（3）pp150二聚体相互作用,MCMV中强,HCMV中弱。通过刚性对接分析发现,triplex Tc区域pp150和相邻SCP距离较其他triplex区域更远,并且MCMV的pp150二聚体结构更加刚性,解释了为什么MCMV中pp150为二聚体以及为什么在triplex Tc区域没有pp150结合。实验上,pp150删除研究表明MCMV的pp150对于体外复制重要但不是不可或缺的,相比HCMV的pp150删除实验表明pp150对于HCMV的体外复制是缺而不可的。我们对MCMV结构的理论和实验研究对于未来对MCMV的基于结构的药物设计,不仅提供的原子结构,还提供的有用的建议:由于MCMV和HCMV衣壳蛋白的高度保守性,建议选择SCP蛋白作为药物设计的靶点;谨慎选择pp150作为药物设计的靶点。本论文通过对三种重要生物大分子在理论和实验层面上的研究,探讨了三大体系三维结构和功能实现之间的关系。研究有以下几个结论:（1）分子动力学模拟可以作为一定尺寸的蛋白体系结构-功能研究的重要工具。若研究蛋白体系在实现功能过程中伴随有较长时间尺度的结构变化,则需要使用加强采样的算法,如umbrella sampling,replica-exchange MD（REMD）,integrated tempering sampling（ITS）,meta-dynamics,accelerated MD,steered MD,targeted MD等。（2）碳水化合物结构柔性大,静电效应多而复杂。真实细胞环境中的碳水化合物的结构更加的复杂多变,现有力场对碳水化合物的描述还不够准确,发展针对碳水化合物的分子力场之路还路漫漫其修远。用QM/MM的方法描述碳水化合物与结合蛋白之间的相互作用相对力场发展来说是一条捷径,但仍然需要优化对QM和MM区域间相互作用的描述。（3）寻找到合适的反应坐标后,umbrella sampling充足采样和MBAR方法后处理能够作为蛋白别构调节研究的有效手段。（4）Localized reconstruction的方法能够有效的处理巨大病毒颗粒冷冻电镜成像时的埃瓦尔德球效应和欠焦梯度的问题,从而提高局部亚颗粒的分辨率。分子动力学模拟的全原子计算直接应用于巨大病毒结构-功能的模拟研究还具有挑战,未来我们可以尝试多尺度模型方法来进行模拟。另外近两年越来越多疱疹病毒的高分辨冷冻电镜结构被解析出来,预测未来基于疱疹病毒结构的药物设计也将成为一大新的研究方向。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 柳维
导师: 梅晔,周正洪
关键词: 分子动力学模拟,冷冻电镜技术,自由能,分子对接,疱疹病毒,碳水化合物,磷酸化蛋白
来源: 华东师范大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 华东师范大学
分类号: Q71
总页数: 152
文件大小: 16192K
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标签：分子动力学模拟论文; 冷冻电镜技术论文; 自由能论文; 分子对接论文; 疱疹病毒论文; 碳水化合物论文; 磷酸化蛋白论文;