乌龟性别决定系统和性腺早期发育与成体功能维持表观遗传的研究

论文摘要

乌龟（Mauremys reevesii）是典型的具温度依赖性性别决定（TSD,Temperature-dependent sex determination）机制的物种,当受精卵孵化温度在32℃时,子代全为雌性;孵化温度在26℃时,子代全为雄性;孵化温度为29℃时,子代雌、雄比例约为1:1。迄今,有关TSD的分子机制研究成果丰硕,然而,具TSD的物种是否具有性染色体的分化一直存有争议,且外界信号究竟如何影响性别关键基因的表达尚不清晰。本文以乌龟为研究对象,采用性腺发育的形态学观察、RNA干涉、表观遗传分析、高通量测序等分子生物学技术研究了其性别决定系统和性腺早期发育与成体功能维持的表观遗传。主要研究结果如下:1.采用三个温度梯度孵化受精卵,鉴定胚胎发育温度敏感期性腺形态特征。通过雄性孵化温度（male producing temperature,MPT,26℃）、雌性孵化温度（female producing temperature,FPT,32℃）和关键温度（Pivotal temperature,PvT,29℃）下的乌龟受精卵孵化实验,比较结果显示胚胎性腺发育始于第15期,15期至21期雌、雄性腺发育并无明显差异,根据前人的研究,确定15期至21期为性腺发育温度敏感期。雌雄性腺发育在第23期开始出现不同的发育特征:雄性性腺呈椭圆形;而雌性性腺呈细长形,并伴有输卵管的分化,显示性腺已经分化完全。2.采用分子性别鉴定方法,研究了乌龟性别决定系统。乌龟雌雄个体来自本实验室PvT下孵化的四年龄龟,采用荧光定量PCR（qPCR）的方法比较18个与性染色体有关基因（ADARB2、ATP2A2、ENOX2、LPAR4、GPATCH8、CCDC92、MED13L、SP4、PEBP1、GAD2、ITGB1、ARMC4、DMRT1、SOX9、AMH、CYP19A1、WT1和SF1）的雌雄拷贝数差异,以中华鳖（ZZ/ZW型）为对照组,结果表明其中17个基因的雄性拷贝数是雌性的2倍,推测它们位于Z染色体上,有1个基因的拷贝数是1:1,推测其位于常染色体上。采用荧光原位杂交技术（FISH）对PvT孵化的子代性别决定相关基因AMH和WT1进行验证,结果显示在雄性个体中均存在2个杂交信号;而雌性个体中仅有1个杂交信号,首次证实乌龟为ZZ/ZW型性别决定系统。乌龟为典型的具TSD机制物种,后代性别比仍然受到温度的调控,推测乌龟虽有性染色体分化,但性别决定主要受到表观遗传的影响,其性别决定机制可能为GSD+TE类型。3.性腺发育温度敏感期DNA甲基化对性别决定相关基因表达的影响。采用亚硫酸氢盐修饰测序法比较分析了乌龟胚胎MPT和FPT的17期、19期和21期性腺性别相关基因（CYP19A1、FOXL2、DMRT1、SOX9和AMH）近端启动子区的DNA甲基化水平,同时采用qPCR技术检测了5个性别相关基因的mRNA表达水平。结果表明性别相关基因的mRNA表达水平与启动子区的CpG甲基化状态呈极显著负相关（CYP19A1:r=-0.98,P<0.001;FOXL2:r=-0.95,P<0.01;DMRT1:r=-0.87,P<0.001;SOX9:r=-0.82,P<0.01;AMH:r=-0.94,P<0.001）。CYP19A1和FOXL2的表达水平在FPT下显著高于MPT（P<0.0001）,DMRT1、SOX9和AMH的表达水平MPT下显著高于FPT（P<0.0001）。本研究还采用qPCR技术检测了MPT、PvT和FPT性腺的17期、19期和21期的DNA甲基化酶基因（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、TET1、TET2和TET3）以及组蛋白去甲基化酶基因（KDM5B、KDM1A、KDM6B、KDM8、KDM3B、NO66、JMJD6和PHF2）的mRNA表达。结果表明,NO66和KDM6B的表达随温度上升显著下降（P<0.0001）,且NO66和KDM6B的表达量与雄性性别相关基因DMRT1、SOX9和AMH的表达量极显著正相关（NO66-DMRT1:r=0.96,P<0.001;NO66-SOX9:r=0.87,P<0.001;NO66-AMH:r=0.9,P<0.001;KDM6B-DMRT1:r=0.94,P<0.001;KDM6B-SOX9:r=0.85,P<0.01;KDM6B-AMH:r=0.88,P<0.001）。该结果提示组蛋白去甲基化酶基因KDM6B和NO66均受到温度调控表达,它们的组蛋白去甲基化作用可促进雄性性腺发育。鉴于KDM6B基因的作用前人已经阐明,因此NO66基因如何发挥作用值得进一步研究。4.组蛋白去甲基化酶基因NO66对乌龟胚胎性腺发育的影响。采用携带NO66 mRNA特异性shRNA的慢病毒载体转染乌龟第14期胚胎,成功构建了NO66基因表达敲低模型。NO66的低表达能导致乌龟MPT胚胎雌性化。与对照组相比,第21期胚胎中,DMRT1基因启动子区甲基化程度显著上调（P<0.001）,而表达量显著下调（P<0.001）,DMRT1下游基因SOX9和AMH的表达量显著下调（P<0.001）,而CYP19A1和FOXL2的表达量显著上调（P<0.001）,但KDM6B的表达并没有显著降低。该结果提示,去甲基化酶基因NO66也可通过调控雄性性别发育关键基因DMRT1基因的表达,促进雄性性腺发育,推测其作用或是在KDM6B的下游,或是两者共同发挥作用。由于NO66和KDM6B基因双敲模型胚胎致死率过高,难以获得有效证据,需要采用免疫共沉淀等技术进一步验证NO66和KDM6B之间相互关系。5.高通量转录组测序比较睾丸和卵巢组织mRNAs和miRNAs的差异表达。通过比较转录组学分析,筛选了差异表达基因（DEGs,differentially expressed genes）,KEGG分析了与性腺维持相关的通路,推测了性别决定基因分子信号级联调控网络。本文还同时注释和分析了乌龟的miRNA及差异表达特征,并预测映射到相应靶基因。基于miRNAs和靶标基因调控网络,着重进行了性别决定相关基因靶标富集分析,初步构建了乌龟成体性腺配子发生和功能维持的关键分子机制和调控网络。本研究以具TSD机制的乌龟为对象,首次证实了乌龟具有ZZ/ZW性别决定系统,推测其性别决定机制可能为GSD+TE类型;探究了表观遗传对胚胎早期性腺发育的影响和在成体性腺功能维持的作用;采用基因操作技术,证明了NO66对MPT胚胎性腺发育的促进作用。本研究提供了表观遗传调控TSD的直接证据,对深入研究TSD的分子机制具有重要的科学意义。

论文目录

摘要

abstract

缩略词对照表

第一章爬行动物性别决定分子机制的研究进展

1 爬行动物性别决定模式的多样性

1.1 鳄目物种的性别决定机制

1.2 有鳞目物种的性别决定机制

1.3 龟鳖目物种的性别决定机制

1.4 喙头目物种的性别决定机制

2 爬行动物性别决定相关基因的研究

2.1 DMRT1

2.2 SOX9

2.3 AMH

2.4 CYP19A1

2.5 FOXL2

2.6 WNT4

3 爬行动物性别决定的表观遗传机制

4 本研究的目的和意义

第二章乌龟胚胎发育温度敏感期性腺形态特征的观察

1 材料和方法

1.1 龟卵采集

1.2 龟卵孵化

1.3 胚胎发育时期的鉴定

1.4 胚胎的性腺组织观察

2 结果

2.1 乌龟胚胎15 期-25 期的个体形态特征

2.2 乌龟TSP期的性腺特征及性腺差异表型出现的时期

3 讨论

第三章分子性别鉴定法研究乌龟的性别决定系统

1 材料和方法

1.1 样本采集

1.2 DNA提取

1.3 qPCR比较基因拷贝数鉴定Z特异性基因

1.4 细胞培养与制备

1.5 荧光原位杂交（FISH）

2 结果

2.1 乌龟不同性别之间的基因拷贝数比较

2.2 乌龟AMH,WT1的FISH检测结果

3 讨论

3.1 发现乌龟存在性染色体

3.2 乌龟性别决定机制可能为GSD+TE型

3.3 尚需要进一步研究的问题

第四章乌龟性腺发育温度敏感期DNA甲基化对性别决定相关基因表达影响的研究

1 材料和方法

1.1 材料收集与动物伦理

1.2 性别决定相关基因启动子区域的克隆和序列分析

1.3 亚硫酸氢盐修饰测序法测定性别决定相关基因启动子区的DNA甲基化水平

1.4 性别相关基因及DNA甲基化酶基因和组蛋白去甲基化酶基因的表达分析

1.5 统计分析

2 结果

2.1 性别决定相关基因基因近端启动子结构分析

2.2 温度敏感期性腺中性别决定相关基因近端启动子的DNA甲基化水平

2.3 温度敏感期性腺中性别决定相关基因的mRNA表达分析

2.4 温度敏感期性腺中性别决定相关基因调控区的DNA甲基化水平与基因表达水平的关系

2.5 性腺中DNA甲基化酶基因以及组蛋白去甲基化酶基因的mRNA表达与性别相关基因表达的相关性分析

3 讨论

3.1 温度对TSP期性腺中性别决定相关基因表达的影响

3.2 DNA甲基化对TSP期性腺中性别决定相关基因表达的影响

3.3 组蛋白去甲基化酶基因对TSP期性腺中性别决定相关基因表达的影响

第五章组蛋白去甲基化酶NO66的RNA干扰对乌龟MPT胚胎性腺发育的影响

1 材料和方法

1.1 材料收集与动物伦理

1.2 慢病毒载体lentivector-NO66-shRNA的构建

1.3 龟胚感染

1.4 统计分析

2 结果

2.1 NO66 在乌龟胚胎早期性腺发育中的表达模式

2.2 乌龟胚胎NO66 敲低模型的构建

2.3 NO66 敲低模型胚胎的发育观察

2.4 NO66 敲低后对MPT胚胎性腺性别相关基因表达量的影响

3 讨论

3.1 RNA干扰技术中提高龟卵存活率的创新

3.2 组蛋白去甲基化酶基因NO66 对性腺分化的影响

3.3 组蛋白去甲基化酶基因NO66和KDM6B的潜在关系

第六章乌龟卵巢和睾丸MicroRNA和 m RNA表达谱的比较研究

1 材料和方法

1.1 伦理批准

1.2 样品收集和RNA提取

1.3 c DNA文库和小RNA测序文库的构建,测序

1.4 测序数据处理

1.5 RNA-seq注释及miRNA的鉴定

1.6 mRNA和 miRNA差异表达分析

1.7 miRNA预测靶mRNA和 miRNA-mRNA互作网络的构建

1.8 qRT-PCR验证mRNA和 miRNA的差异表达

2 实验结果

2.1 RNA-seq测序及从头组装和miRNA测序数据分析

2.2 Unigene功能注释及miRNA的预测

2.3 mRNA和 miRNA的差异表达分析

2.4 差异表达mRNA的富集分析

2.5 miRNA靶基因的预测和富集分析

2.6 qRT-PCR验证RNA-seq和 miRNA数据

3 讨论

3.1 miRNA参与乌龟中性腺维持和配子发生的基因调控网络

3.2 性成熟时期参与睾丸和卵巢功能维持的信号通路

3.3 候选基因FANK1 可能与睾丸生精的调控有关

第七章主要结论与展望

1 主要结论

2 创新点

3 研究展望

附件

附件1

附件2

附件3

附件4

参考文献

博士在读期间发表学术论文

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 熊磊

导师: 聂刘旺

关键词: 性别决定机制,表观遗传,转录组,基因

来源: 安徽师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 安徽师范大学

分类号: Q492

DOI: 10.26920/d.cnki.gansu.2019.000042

总页数: 153

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