控制TaAGPL1基因表达上游调控因子的分离及其功能研究

论文摘要

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉生物合成中的关键酶,由成对的两个大亚基（AGPL）和成对的两个小亚基（AGPS）组成的异源四聚体,分为胞质型和质体型两种,因此,在植物细胞内存在四类AGPase亚基:AGPase胞质型大亚基（AGPL1）、胞质型小亚基（AGPS1）、质体型大亚基（AGPL2）和质体型小亚基（AGPS2）。课题组前期研究结果表明,小麦淀粉合成基因TaAGPL1的过表达能显著提高小麦籽粒AGPase活性和淀粉积累速率,从而证明了它在小麦籽粒淀粉合成中的重要作用。本研究运用酵母单杂交技术,通过将TaAGPL1 promoter与小麦籽粒cDNA文库进行酵母单杂交,筛选出控制TaAGPL1基因表达的上游调控因子,并利用大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默（BSMV-VIGS）技术对调控因子进行功能研究,从而探究了调控TaAGPL1基因表达的分子机制。主要结果如下:（1）运用酵母单杂交技术筛选出控制TaAGPL1表达的两个调控因子（TabHLH39转录因子和TaPDIL1-2分子伴侣）。分离出TabHLH39基因的cDNA序列,它编码了486个氨基酸,蛋白序列包含了bHLH家族所共有的四个经典结构域。通过烟草瞬时转化和酵母自激活试验,发现TabHLH39仅定位于细胞核且具有转录自激活活性。利用小麦基因组数据库搜索获得TaPDIL1-2基因定位于4BS,其ORF编码了512个氨基酸,蛋白序列包含有四个经典的硫氧还蛋白结构域。（2）田间利用BSMV-VIGS沉默技术研究了TabHLH39基因的功能。构建BSMV-VIGS-TabHLH39沉默载体并对其进行线性化、纯化和体外转录,成功后用于接种田间灌浆期的小麦穗部。结果显示,在花后19 d、24 d、29 d和34 d,BSMV-VIGS-TabHLH39沉默植株中TabHLH39基因表达量显著降低（94.698.7%）;BSMV-VIGS-TabHLH39沉默植株成熟籽粒中粒长、粒宽、粒重及淀粉含量均显著降低（降幅为10.1%、11.7%、3.7%和8.8%）;对接种后14 d、19 d、24 d、29 d和34 d的小麦籽粒进行qPCR检测,发现BSMV-TabHLH39沉默植株籽粒内TaAGPL1的表达量也均显著下降。这些结果表明TabHLH39可能通过正向调控淀粉合成基因TaAGPL1的表达,进而参与了小麦籽粒淀粉的合成。（3）田间利用BSMV-VIGS沉默技术研究了TaPDIL1-2基因的功能。构建BSMV-VIGS-TaPDIL1-2沉默载体并对其进行线性化、纯化和体外转录,成功后用于接种田间灌浆期的小麦穗部,并对成功沉默的小麦植株籽粒进行定量检测,结果显示BSMV-VIGS-TaPDIL1-2沉默植株成熟籽粒中粒长、粒宽、粒重和淀粉含量均显著上升（升幅为3.8%、5.7%、6.8%和1.9%）;且BSMV-TaPDIL1-2沉默植株籽粒内TaAGPL1的表达量均显著上升。因此推测作为参与氧化蛋白质正确折叠的重要伴侣蛋白TaPDIL1-2,它能够确保一些转录因子（C2H2-ZFS和AP2/ERF等）的正确折叠,从而间接和负向调控TaAGPL1基因的表达并在淀粉生物合成中起重要作用。

论文目录

致谢

摘要

1 文献综述

1.1 淀粉合成相关酶路径及功能

1.2 AGPase同工酶基因研究进展

1.3 调控基因功能的相关研究

1.3.1 启动子

1.3.2 转录因子

1.3.3 酵母单杂交技术

1.4 大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默（BSMV-VIGS）技术

1.5 研究目的与意义

2 引言

3 材料与方法

3.1 试验材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 试验所用载体与菌株

3.1.3 试验所用工具酶、试剂及仪器

3.2 试验方法

3.2.1 小麦籽粒DNA的提取

3.2.2 小麦籽粒RNA的提取和c DNA的合成

3.2.2.1 小麦籽粒RNA的提取

3.2.2.2 cDNA的合成

3.2.3 Ta AGPL1 启动子活性的GUS定性和定量检测

3.2.4 小麦籽粒c DNA文库的构建

3.2.5 酵母单杂交筛选与互作验证

3.2.6 转录因子的亚细胞定位

3.2.7 转录因子自激活活性检测

3.2.8 田间小麦籽粒的基因沉默

3.2.9 实时荧光定量PCR

4 结果与分析

4.1 控制Ta AGPL1 基因表达上游调控因子的分离

4.1.1 Ta AGPL1启动子的分离

4.1.2 Ta AGPL1启动子的GUS表达活性辨析

4.1.3 酵母单杂交技术筛选控制TaAGPL1-1D表达的调控因子

4.2 调控Ta AGPL1 基因表达的转录因子TabHLH39的功能验证

4.2.1 TabHLH39 转录因子的序列、结构域及系统进化树

4.2.2 Tab HLH39转录因子与Ta AGPL1-1D淀粉合成基因的互作验证

4.2.3 转录因子TabHLH39 的亚细胞定位和转录自激活验证

4.2.4 BSMV-VIGS技术沉默TabHLH39 基因

4.2.5 Tab HLH39 基因在小麦籽粒淀粉合成中的功能鉴定

4.2.6 BSMV-GFP和 BSMV-TabHLH39 基因沉默籽粒内淀粉粒的分布

4.3 控制Ta AGPL1基因表达的调控因子TaPDIL1-2的功能验证

4.3.1 Ta PDIL1-2基因与TaAGPL1-1D启动子的互作

4.3.2 TaPDIL1-2蛋白质二硫键异构酶的结构域、进化树和组织表达

4.3.3 BSMV-VIGS技术沉默Ta PDIL1-2 基因

4.3.4 TaPDIL1-2 基因在小麦籽粒淀粉合成中的功能鉴定

4.3.5 TaPDIL1-2 基因参与小麦籽粒淀粉合成的机理研究

5 结论与讨论

6 本研究主要结论、创新点及下一步研究计划

6.1 主要结论

6.2 本研究创新点

6.3 下一步研究计划

攻读硕士学位期间发表文章及获得荣誉情况

参考文献

ABSTRACT

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 董洁

导师: 康国章,李鸽子

关键词: 葡萄糖焦磷酸化酶,小麦,酵母单杂交,淀粉合成,调控机制

来源: 河南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 河南农业大学

基金: 国家自然科学基金(31871550,31701345和31571575),国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2016ZX08002003),河南省科技创新杰出青年基金(174100510002)

分类号: Q943.2;S512.1

DOI: 10.27117/d.cnki.ghenu.2019.000029

总页数: 56

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控制TaAGPL1基因表达上游调控因子的分离及其功能研究

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