萼花臂尾轮虫野外群体遗传多样性的研究

论文摘要

周期性孤雌生殖的萼花臂尾轮虫（Brachionus calyciflorus）是淡水生态系统中浮游动物的重要种类,并且是群体遗传结构研究中常见的模式生物。生活史包括孤雌生殖和有性生殖两个阶段,种群刚建立是水体沉积物中大量休眠卵孵化出非混交雌体进行孤雌生殖快速扩增种群,如果水体环境因子（如温度过高或氧含量过低等）不适时种群开始进行有性生殖产生休眠卵沉入水体沉积物中,保证种群的延续。研究表明,萼花臂尾轮虫群体是由隐蔽种复合体组成而且一般认为在野外水体中,在周期性孤雌生殖轮虫种群刚开始建立时有很高的基因型多样性,但在孤雌生殖阶段会受到克隆选择的影响,种群基因型多样性随着季节更迭逐渐降低。因为周期性孤雌生殖轮虫生活史的特点,野外种群和实验室种群都不可避免的存在近交衰退现象,而种群的近交回避策略又是这种独特交配系统的进化动力。然而,国际上对周期性孤雌生殖生物的基因型多样性和近交衰退现象的关注较少,国内也几乎没有开展过相关工作。本研究在国内外相关研究的基础上,以大连儿童公园明泽湖中萼花臂尾轮虫为研究对象,基于ITS（internal transcribed spacer,内部转录间隔区）和微卫星分子标记技术,探讨以下几个问题（1）小型人工水体是否存在隐蔽种复合体（2）在野外水体中萼花臂尾轮虫是否会经历克隆选择效应以及存在近交衰退现象（3）萼花臂尾轮虫微卫星位点突变率的高低。主要研究结果如下:1.本次研究以明泽湖中萼花臂尾轮虫实验种群为基础,通过转录组测序共获得1141个潜在的多态性微卫星位点,以萼花臂尾轮虫实验种群为对象,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,分析了其中150个微卫星位点的多态性水平,共获得单态性位点22个;两种多态性位点17个;三种多态性位点7个;四种多态性位点5个;五种多态性位点3个;同时结合已经公布的具有高多态性的萼花臂尾轮虫微卫星位点（12个）,最后确定利用7个微卫星位点进行萼花臂尾轮虫野外种群遗传结构和微卫星位点突变率分析。2.为确定明泽湖中萼花臂尾轮虫隐蔽种复合体的组成,本次研究应用ITS分子标记技术,通过比较ITS基因序列差异（>4%为不同的隐蔽种）以及构建系统发育树,发现明泽湖中萼花臂尾轮虫隐蔽种复合体由Clade1和Clade2构成。与国际发表的萼花臂尾轮虫分类标准相结合,最终确定明泽湖中Clade1为隐蔽种D,拉丁名为B.calyciflorus s.s.;Clade2为隐蔽种C,拉丁名为B.fernandoi sp.nov.。为方便后续结果的描述,定义Clade1为BC-D;Clade2为BC-C。因为BC-D对温度的耐受性比BC-C低,所以BC-D在早春出现一段时间后被BC-C替代。3.本次研究利用7个微卫星分子标记分析了BC-D和BC-C的遗传多样性,结果表明BC-D群体的观测等位基因数和有效等位基因数分别为4.9286和2.8138;BC-C群体的观测等位基因数和有效等位基因数分别为3.4078和2.2552。在BC-D和BC-C群体中观测杂合度和期望杂合度分别为0.6077和0.6123以及0.6918和0.5203;Nei氏期望杂合度分别为0.5932和0.5123。表明野外萼花臂尾轮虫种群遗传多样性较高。但Hardy-Weinberg遗传平衡检验,每个种群至少有2个位点偏离Hardy-Weinberg平衡。遗传偏离指数D显示种群处在杂合子过剩状态。种群偏离Hardy-Weinberg平衡状态可能是杂合子过剩导致。2个稀有等位基因的频率变化反映出萼花臂尾轮虫中存在一定程度的近交衰退现象。通过基因型多样性分析表明萼花臂尾轮虫种群基因型多样性较高,而且在随着种群的演替经历了克隆选择效应。4.为了确定野外萼花臂尾轮虫种群杂合子过剩的原因,我们进行了萼花臂尾轮虫微卫星位点突变率的相关研究。本次研究检测实验室克隆培养的4个萼花臂尾轮虫种群约30和50世代在7个微卫星位点的数据,计算得到4个克隆种群的微卫星位点突变率。结果显示30世代时7个微卫星位点平均每个世代突变率在8.25×10-4—3.33×10-2之间,所有微卫星位点平均每个世代突变率为1.37×10-2;50世代时7个微卫星位点平均每个世代突变率在0—2×10-2之间,所有微卫星位点平均每个世代突变率为4.65×10-3。对比其他研究结果,萼花臂尾轮虫微卫星位点的突变率处在相对较高的水平。通过比较野外萼花臂尾轮虫种群和实验室4个克隆种群的等位基因频率分布可知捕食压力促进了稀有等位基因的产生。而且在遗传结构上均表现出杂合子过剩的状态,说明杂合子过剩是微卫星位点较高的突变率导致的。综上所述,大连儿童公园明泽湖中萼花臂尾轮虫种群是由非重叠的隐蔽种复合体组成,分别为隐蔽种BC-C（B.calyciflorus s.s.）和BC-D（B.fernandoi sp.nov）。两个种群均具有较高的遗传多样性。同时在温度和晶囊轮虫的双重压力下,导致BC-D在水体中消失,但由于休眠卵库的补充,孵化出BC-C继续种群的繁衍。BC-C的遗传结果表明种群经历了克隆选择效应并且种群内存在一定程度的近交衰退现象。在捕食压力下和微卫星位点突变率较高的情况下,萼花臂尾轮虫种群在倾向孤雌繁殖的同时有产生新的等位基因,使得杂合子过剩,导致种群偏离Hardy-Weinberg平衡。

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摘要

Abstract

第一章综述

1.1 萼花臂尾轮虫简介

1.2 DNA条形码技术

1.3 隐蔽种的存在及鉴别

1.4 微卫星标记及其应用的研究

1.4.1 微卫星简介

1.4.2 微卫星标记的优势

1.4.3 微卫星开发存在的问题

1.4.4 微卫星标记多态性形成机理

1.4.5 微卫星标记分析流程

1.4.6 微卫星标记的应用

1.5 本研究的目的与意义

第二章基于转录组微卫星标记的开发

2.1 前言

2.2 微卫星开发

2.2.1 萼花臂尾轮虫的培养和收集

2.2.2 萼花臂尾轮虫转录组测序

2.3 微卫星标记初筛

2.3.1 实验仪器

2.3.2 实验试剂

2.3.3 萼花臂尾轮虫DNA提取

2.3.4 引物退火温度的筛选

2.3.5 琼脂糖电泳检测

2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.4.1 实验仪器

2.4.2 实验试剂

2.4.3 实验过程

2.5 实验结果

2.6 讨论

2.6.1 转录组测序技术在开发微卫星标记中的应用

2.6.2 微卫星序列特征分析

2.6.3 PCR体系优化

2.6.4 部分引物或个体得不到扩增产物的原因

第三章萼花臂尾轮虫隐蔽种的鉴定

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 样品采集和培养

3.2.2 DNA提取,PCR扩增和测序

3.2.3 DNA数据分析

3.2.4 系统发育树构建

3.3 结果

3.3.1 采样结果

3.3.2 琼脂糖电泳结果

3.3.3 ITS序列校准

3.3.4 BLAST结果

3.3.5 序列相似性

3.3.6 ITS序列特征

3.3.7 系统发育树分析

3.4 讨论

3.4.1 系统发育关系

3.4.2 季节演替

第四章萼花臂尾轮虫种群遗传结构的变化

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 样品采集与培养

4.2.2 DNA提取

4.2.3 微卫星（SSR）检测

4.2.4 数据分析

4.3 结果与分析

4.3.1 样品采集

4.3.2 群体遗传多样性分析

4.3.3 基因型多样性

4.4 讨论

4.4.1 样本数量

4.4.2 群体遗传多样性

4.4.3 稀有等位基因

4.4.4 基因型多样性和克隆选择

第五章萼花臂尾轮虫实验室种群微卫星位点突变累积研究

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 样品采集与培养

5.2.2 实验过程

5.2.3 DNA提取

5.2.4 微卫星（SSR）位点检测

5.2.5 ITS扩增检测

5.2.6 数据分析

5.2.7 隐蔽种的鉴定

5.2.8 系统发育树的构建

5.3 结果

5.3.1 ITS序列差异和系统发育关系

5.3.2 微卫星位点突变实验

5.3.3 等位基因频率分布

5.3.4 种群遗传多样性

5.4 讨论

5.4.1 突变率

5.4.2 等位基因频率

5.4.3 种群遗传多样性

结论

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢

附录1

附录2

附录3

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张吉

导师: 殷旭旺

关键词: 萼花臂尾轮虫,微卫星,遗传多样性,突变率

来源: 大连海洋大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 大连海洋大学

分类号: Q958

DOI: 10.27821/d.cnki.gdlhy.2019.000082

总页数: 112

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