论文摘要
猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）可引起急性、高度接触性的猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED,此病的主要临床症状为呕吐、腹泻、脱水性下痢等,尤其是新生仔猪的高致死率给养猪业带来严重的经济损失。近年来,PED在世界各地频繁暴发,众多研究表明,PEDV变异使现有疫苗不能提供足够的保护,是导致疫情加剧的主要原因之一,因此,加强对新变异毒株的研究对PEDV的防控具有重要意义。本论文从PEDV野毒株的分离鉴定、抗PEDV单链抗体的改造以及含单链抗体基因的猪胎儿成纤维细胞系的建立与鉴定进行了研究。1.PEDV毒株CH/JX226/2018的分离鉴定。从江西的某猪场采集了 9个疑似PEDV感染致死的仔猪的小肠等组织样品,用RT-PCR法鉴定其中5个样品为PEDV阳性。样品处理后,接种vero细胞,培养分离病毒,然后进行形态学和分子生物学鉴定。结果表明,盲传至第6代时,细胞上清中仍含有PEDV,将其命名为CH/JX226/2018。对分离株的S、ORF3、E及M基因进行扩增并测序,利用DNASTAR、MEGA7.0软件将其与GenBank上已公布的参考序列进行相似性对比分析,遗传进化树分析。结果表明,分离株CH/JX226/2018的S蛋白与参考毒株氨基酸的相似性在91.3%-98.9%之间,其中与CV777、LZC、SM98等传统型毒株的相似性分别为92.7%、91.8%、91.3%,与2014年流行的YC2014毒株的S蛋白相似性最高,为98.9%。S基因遗传进化树分析结果同样表明,该分离株与传统型毒株如CV777等亲缘关系较远,与近年来流行性毒株YC2014等的亲缘关系较近。2.抗病毒单链抗体的改造。利用定点突变等方法,对实验室抗PEDV的单链抗体（scFv）的重链和轻链之间的linker（Gly4Se）3进行定点突变,分别得到linker为Gly4Ser的突变体v1,linker为GlySer的突变体v2,以及缺失linker的突变体v3。分别将其测序鉴定,并利用原核表达系统大肠杆菌BL21（DE3）进行表达,优化后的表达条件为37℃,终浓度为0.6 mM的IPTG诱导表达7 h。目标蛋白表达效率与未改造的scfv相当。经SDS-PAGE及Western Blot鉴定正确表达后,用非竞争性Elisa法检测各突变体与CH/JX226/2018毒株的结合能力,结果表明,scFv结合活性明显大于v1、v2、v3,而v1、v2、v3之间没有明显差异。3.含单链抗体基因的猪胎儿成纤维细胞系的建立与鉴定。用与CH/JX226/2018毒株结合活性高的抗PEDV的scFv为目的基因,设计含有猪ROSE26位点的同源臂、HLF启动子、带有Cre基因和同向的两个Loxp、Neo正向筛选标记、DTA负向筛选标记等的基因打靶载体,利用核转仪,当原代胎儿成纤维细胞的培养到F3代时,选择程序A-003进行转染,经过G418筛选,共得到86个克隆点细胞。设计跨同源臂引物,进行PCR扩增,结果表明成功筛选到1株长白雌性的原代胎儿成纤维单克隆细胞系,基因打靶的中靶率为1.2%,为抗PEDV的scFv转基因猪的制备提供了基础材料。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 尹志安
导师: 杨国庆
关键词: 猪流行性腹泻病毒,单链抗体,连接肽,基因打靶载体,猪原代胎儿成纤维细胞系
来源: 河南农业大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,畜牧与动物医学
单位: 河南农业大学
分类号: S852.651
DOI: 10.27117/d.cnki.ghenu.2019.000233
总页数: 55
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标签：猪流行性腹泻病毒论文; 单链抗体论文; 连接肽论文; 基因打靶载体论文; 猪原代胎儿成纤维细胞系论文;