枯草芽孢杆菌中终止子和5’非编码区对外源基因表达的影响

论文摘要

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为一种重要的革兰氏阳性菌,多年来一直作为模式微生物使用。随着全基因组测序的完成、转录组学和蛋白组学等多组学分析的不断深入,B.subtilis已经成为代谢工程、重组蛋白表达和复杂遗传线路等研究的理想底盘微生物。目前在枯草芽孢杆菌中利用合成生物学构建表达模块已成为研究热点。人工基因表达元件是设计表达模块、构建基因电路的基础。目前,在枯草芽孢杆菌中已有多种不同类型的人工启动子广泛应用到基因电路中,而诸多其他类型的元件,如存在于非编码区的终止子和调控序列等尚未充分挖掘、开发,且元件在枯草芽孢杆菌中对外源基因的调控规律尚缺乏系统研究。这些问题阻碍了构建大规模复杂调控网络的发展,极大制约了枯草芽孢杆菌合成生物技术的推进。基于此,本论文分别研究了存在于枯草芽孢杆菌中3’非编码区的终止子和5’非编码区的调控序列对异源基因表达的作用,并且通过合成生物学技术对这两种调控序列进行改造,提升了外源基因的表达效率,研究取得的具体研究结果如下:（1）B.subtilis中高效终止子的鉴定及分子改造。以GFP和mCherry为报告基因,构建了基于双荧光信号的终止子强度测定平台,分析了枯草芽孢杆菌来源的10种终止子和噬菌体SP01来源的5种终止子终止效率。结果表明,终止效率变化范围为00.99,终止子TB4、TB5、TB6、TB7、TB9和ST1为强终止子,终止效率高于0.95。其中终止子TB5和TB6对转录通读的抑制效果最好。TB5与标准化的大肠杆菌终止子rrnBT1进行比较的结果表明,TB5的终止效率为rrnBT1的1.17倍,并且TB5对上游GFP的表达有一定上调作用,上调比例为rrnBT1的1.24倍,对mCherry表达的抑制程度为rrnBT1的5.54倍。构建双串联和三串联终止子,分析终止子串联后功能特性的变化规律,结果表明部分弱终止子之间的串联可以进一步提高其终止子效率,弱终止子与强终止子串联后其终止效率一般取决于强终止子的功能,并且强终止子串联后,其终止效率和对GFP表达的增强程度不会再增加,但是会进一步增强对下游mCherry表达的抑制程度。（2）mRNA的5’非编码区对外源基因在枯草芽孢杆菌中表达的调控作用和机制。确证了5’非编码区与编码区对蛋白翻译效率的影响,并提出利用通用式融合肽的方式降低特定基因5’编码区的二级结构对翻译的抑制。研究以赤拟谷盗Tribolium castaneum L-天冬氨酸-α-脱羧酶（PanD）作为模式蛋白,利用高效表达元件对PanD的调控验证翻译抑制现象,结果表明在由强启动子PspovG和PsigW分别与强RBS（RBS206）组合的高效表达元件介导下,PanD重组蛋白表达水平极低,呈现翻译抑制现象。分析5’端编码区缺失突变后mRNA二级结构的变化特征,揭示翻译抑制的机制。结果表明当起始密码子后缺失9 nt（三个氨基酸）后,突变体的蛋白表达水平和酶活水平有提高。mRNA二级结构分析表明,野生型panD 5’编码区与5’-UTR形成的发卡能不同程度地将核糖体结合位点（ribosome bind site,RBS）封闭在二级结构中,导致翻译起始效率被削弱。而缺失9 nt后产生的新5’编码区不与RBS形成抑制性的发卡结构。将sfGFP和红色荧光蛋白（mCherry）融合到PanD的N端后,能够提升重组蛋白的表达水平和酶活水平。利用在panD基因5’端融合绿色荧光蛋白编码基因sfgfp考察其对翻译抑制的影响。对融合蛋白的长度进行精简,筛选与PanD酶适配性强的融合肽,结果表明仅保留sfGFP N端143个氨基酸作为融合肽能够产出与融合全长相当的蛋白表达水平。这一策略有望将N端融合肽作为一类绝缘子与多种异源蛋白适配,消除由于mRNA分子内部的顺式作用导致的蛋白质翻译抑制现象,在合成生物学应用领域有较广泛的应用潜力。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 合成生物学在枯草芽孢杆菌中研究进展

1.1.1 合成生物学概述

1.1.2 枯草芽孢杆菌表达系统

1.1.3 影响枯草芽孢杆菌中蛋白表达的因素分析

1.2 原核生物表达的调控元件

1.2.1 启动子

1.2.2 核糖体结合位点

1.2.3 终止子——3’非编码区RNA调控元件

1.2.4 调控RNA元件——5’非编码区调控元件

1.2.5 影响mRNA稳定性的5’-UTR特征

1.2.6 RNA调控元件在基因表达调节中的优势

1.3 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的概述及应用

1.3.1 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的简介

1.3.2 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的应用

1.4 课题研究的意义与内容

第二章材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 培养基

2.1.5 主要溶液

2.2 DNA操作

2.2.1 质粒的提取

2.2.2 引物的设计

2.2.3 基因扩增

2.2.4 DNA的检测和回收

2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的转化

2.2.7 枯草芽孢杆菌感受态制备与转化

2.3 终止子重组质粒的构建

2.3.1 终止子测试质粒的构建

2.3.2 单终止子的构建

2.3.3 双串联终止子的构建

2.3.4 三串联终止子的构建

2.4 L-天冬氨酸-α-脱羧酶重组表达质粒的构建

2.4.1 L-天冬氨酸-α-脱羧酶表达质粒的构建

2.4.2 L-天冬氨酸-α-脱羧酶C末端融合sfGFP质粒的构建

2.4.3 L-天冬氨酸-α-脱羧酶N末端融合sfGFP质粒的构建

2.4.4 N端截短突变体的构建

2.4.5 融合肽精简突变体的构建

2.5 分析方法

2.5.1 绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白mCherry荧光水平的检测

2.5.2 终止效率的测定方法

2.5.3 重组蛋白表达水平的检测

2.5.4 PanD酶活水平的检测

2.5.5 荧光定量PCR

2.5.6 统计分析

第三章结果与讨论

3.1 终止子在枯草芽孢杆菌中对异源基因表达的调控及分子改造

3.1.1 终止子筛选平台的建立

3.1.2 终止子终止效率的鉴定

3.1.3 终止子TB5 与大肠杆菌标准化强终止子rrnBT1 性能比较

3.1.4 串联终止子的构建及表征

3.2 mRNA5’非编码区对异源蛋白表达的抑制机制和消除策略

3.2.1 赤拟谷盗L-天冬氨酸-α-脱羧酶在B.subtilis中表达抑制效应的鉴定

3.2.2 panD基因mRNA5’端二级结构对重组蛋白表达水平的调控作用

3.2.3 利用N端融合策略消除PanD翻译抑制

3.2.4 融合肽长度精简及筛选

3.2.5 PanD不同融合形式及突变体基因转录水平的检测

主要结论与展望

致谢

参考文献

附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 令狐梅

导师: 崔文璟

关键词: 枯草芽孢杆菌,终止子,二级结构,蛋白表达

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学,生物学

单位: 江南大学

分类号: Q933;Q78

DOI: 10.27169/d.cnki.gwqgu.2019.000116

总页数: 59

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枯草芽孢杆菌中终止子和5’非编码区对外源基因表达的影响

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