王长法[1]2003年在《文昌鱼体液和鱼类血清补体溶血系统比较研究》文中研究指明补体的系统发育进化是当今免疫学研究热点之一。虽然对补体研究已有100多年历史，但补体最早出现于哪类动物及其激活适应系统演化仍不十分清楚。本文选择了在系统演化上占据主要地位的文昌鱼以及软骨鱼和硬骨鱼，对它们的补体系统进行了研究。 本文首次将脊椎动物血清补体溶血活性标准测定方法运用到文昌鱼体液免疫研究中，首次建立了测定无脊椎动物体液补体溶血ACH50的方法。我们发现文昌鱼体液出现补体样的溶血活性。文昌鱼体液可溶解悬浮在10mmol／L EGTA-Mg-GVB缓冲液中的正常的兔血红细胞、绵羊红细胞、及部分哺乳动物、鸟类、两栖类和鱼类的代表动物的血红细胞；而在GVB~(2+)缓冲液中时对抗体包被的绵羊红细胞却没有溶血活性。文昌鱼体液的溶血活性和靶红细胞的动物种类在系统发育上和文昌鱼的亲缘关系远近没有直接联系。文昌鱼体液在EGTA-Mg-GVB缓冲液中对兔血红细胞发生溶血的最适条件是：温度是20℃，最适pH是7.5，最适Mg~(++)的浓度是10mmol／L。溶血活性是二价离子依赖的，热敏感的(溶血活性热灭活温度是45℃)。文昌鱼体液对兔血红细胞的溶血活性在受到酵母聚糖、甲胺、肼、PMSF、EDTA、兔抗人补体3抗血清处理时，溶血活性消失。此外，本实验还运用免疫比浊法以绵羊抗人的补体3的抗血清检测了文昌鱼体液中的补体3浓度为1.17mg／ml。此浓度和人血清及狗血清中的C3浓度基本相当。这些结果说明：文昌鱼体液中存在着类似于脊椎动物替代途径补体样的溶血活性。 此外，文昌鱼体液中是否存在凝集素及其性质如何一直没有报道。本文运用血细胞凝集试验证实在文昌鱼体液中存在凝集素。同时还首次发现文昌鱼体液中的凝集素活性是SH依赖型，还特异性被多个含D—半乳糖苷的多糖抑制。经注射鸡大肠杆菌后，文昌鱼体液中的凝集素对人B、O型红血细胞，兔、草鱼和蟾蜍红血细胞的凝集活性明显增强。此结果显示，文昌鱼体内可能存在一定获得性免疫反应。 全世界鱼类据估计大约有24，000种左右，其中仅有少数几种鱼类的免疫系统被系统研究过。但在被研究过的少数几种鱼类中，淡水鱼类占了绝大多数，只中国海洋大学博士学位论文中文摘要有一种软骨鱼类一长鳍斑竹鳖的补体系统多年前被研究过。本文运用脊椎动物血清补体溶血活性标准测定方法定性、定量地研究了软骨鱼条纹斑竹鳖的血清溶血补体系统。发现条纹斑竹鳖血清中既存在补体经典溶血途径，又存在补体替代溶血途径。条纹斑竹鳖血清ACH50和CH50值分别为257.2 Units/ml和35.8士13.1Units/ml(n=6)。条纹斑竹鳖血清对悬浮在EGTA一Mg一GVB缓冲液中的正常的兔血红细胞、绵羊红细胞、及部分哺乳动物、鸟类、两栖类和鱼类等代表动物的血红细胞具有溶血活性;在GVBZ十存在时对抗体包被的绵羊红细胞具有溶血活性，而在EDTA一GVB缓冲液中不论是对正常的兔红细胞或其他脊椎动物的红细胞还是对抗体包被的敏感绵羊红细胞都没有溶血活性。此外，条纹斑竹鳖血清对不同脊椎动物红细胞的溶血活性和靶红细胞的动物种类在系统发育上和条纹斑竹鳖的亲缘关系远近没有直接联系。条纹斑竹鳖血清通过补体替代途径对兔血红细胞发生溶血的最适条件是:温度是20℃，最适PH是7.5，最适Ms++的浓度是smM。溶血活性是二价离子依赖的，热敏感的(溶血活性热灭活温度是45℃)。条纹斑竹鳖血清通过补体替代途径对兔血红细胞的溶血活性在受到PMSF、EDTA、酵母聚糖、甲胺、脐处理时，溶血活性消失，将条纹斑竹鳖血清预先经兔抗人C3抗血清处理后，其对兔红细胞的溶血活性部分受到抑制。另一方面，条纹斑竹鳖血清通过补体经典途径发生溶血的特性是:需要同种鱼抗绵羊红细胞抗血清致敏的绵羊红细胞作为靶细胞;需要二价CaZ+和M广离子参与:温度是25℃;作用时间是60分钟;该溶血过程可被特异性抑制剂如L一赖氨酸、角叉藻聚糖、酵母聚糖、甲胺和腆所抑制。实验结果显示:条纹斑竹鳖血清中存在着类似于哺乳动物经典、替代途径补体溶血系统，并且条纹斑竹鳖体内的替代途径补体溶血活性比哺乳动物的要高得多，且其溶血补体系统在低温环境下(如0一4℃)皆可充分激活，显示补体替代溶血途径在条纹斑竹鳖抵御外界病原微生物的侵染时起着重要作用。较高的ACHSO值可以扩大其天然免疫识别能力，弥补体内不成熟的获得性免疫能力。 除软骨鱼之外，我们还运用脊椎动物补体溶血途径的标准检测方法，定性、定量地研究了硬骨鱼草鱼血清溶血补体系统。发现草鱼血清中既存在补体经典溶血途径，又存在补体替代溶血途径，其ACHSO和CHSO值分别为46.9 Units/ml和8.8士5.1 Units/耐(n二6)。草鱼血清可溶解悬浮在缓冲液EGTA一Mg--GVB中的正中国海洋大学博士学位论文中文摘要常的兔血红细胞、绵羊红细胞、及部分哺乳动物、鸟类、两栖类和鱼类的代表动物的血红细胞;而对悬浮在缓冲液EDTA一VB中的这些脊椎动物代表动物的血红细胞却没有显示溶血活性。同时还发现草鱼血清通过激活替代途径的溶血活性大小和靶红细胞的动物种类在系统发育上和草鱼的亲缘关系远近没有直接联系。草鱼血清通过补体替
栗志民[2]2008年在《青岛文昌鱼体液补体介导弧菌溶菌活性及弧菌逃避补体攻击机制的研究》文中认为补体的系统发育进化是当今免疫学研究热点之一。比较免疫学研究表明脊椎动物和无脊椎动物补体系统有着共同的祖先。在过去10年里,在无脊椎动物后口类、甚至原口类中,结构和功能相似的一些重要补体组分如C3和B因子已经得到了鉴定,但有关这些动物补体功能的研究相当有限。文昌鱼(Amphioxus)是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是研究脊椎动物进化的珍贵材料。本文选择了在系统演化上占据重要地位的文昌鱼,对其体液补体介导弧菌溶菌活性进行研究,并对弧菌逃避补体攻击机制进行探讨。本文首次将测定脊椎动物血清补体溶菌活性的标准方法运用到文昌鱼体液免疫研究中,对文昌鱼体液补体的溶菌活性进行研究。通过文昌鱼体液与弧菌相作用,文昌鱼体液能够在体外抑制溶藻胶弧菌HW284(Vibrio alginolyticus HW284)、副溶血弧菌HW458(Vibrio parahaemolyticus HW458)、哈维氏弧菌SF-1(Vibrio harvey SF-1)的生长,存活率分别为42%, 28%和59%。这样的数据在无脊椎动物的后口类尚属首次。扫描电镜观察表明正常文昌鱼体液存在溶菌活性,例如,能溶解溶藻胶弧菌HW284,而经灭活的体液及无菌过滤海水处理的溶藻胶弧菌HW284表面光滑,细胞完整。用热灭活的兔抗人C3血清处理文昌鱼体液后,再与溶藻胶弧菌HW284相作用,体液溶菌活性明显降低,而经免疫前的兔血清或PBS处理的体液,溶菌活性不受影响,此外,体液经热处理(45℃, 30 min)和反复冻融处理后,文昌鱼体液抑制溶藻胶弧菌HW284生长的活性明显降低,其存活率分别为89%和81%,而正常体液(对照组)作用后,弧菌的生长不受影响。这些结果表明补体作用可能是抑制弧菌生长的主要因素。40 mM EGTA (包含4 mM MgCl2)处理的文昌鱼体液没有影响溶菌活性,与正常体液(对照组)相比,具有相似的溶菌活性,其存活率分别为42%和44% ,在EGTA处理组中添加10 mM CaCl2,没有增强体液的溶菌活性,相反,用40 mM EDTA处理文昌鱼体液,体液的溶菌活性消失,其存活率为86%,在EDTA处理中添加4 mM MgCl2,恢复了体液的溶菌活性,这些实验结果表明文昌鱼体液补体介导的溶菌活性依赖Mg2+,而不依赖Ca2+。另外,用补体替代途径的选择性激活剂—酵母聚糖A处理后的文昌鱼体液,再与溶藻胶弧菌HW284相作用,体液溶菌活性明显降低,与未处理的体液相比,在2倍稀释的体液中,其存活率分别为82%和43%,这些实验结果强烈暗示着补体替代途径的激活与文昌鱼体液的溶菌活性相关。值得注意的是,7种弧菌中,其中4种弧菌—河弧菌HW293(Vibrio furnissi HW293)、辛辛那提弧菌HW287(Vibrio cincinnatiensis HW287)、鳗弧菌W-1(Vibrio anguillarum W-1)和哈维氏弧菌Z3G2(Vibrio harveyi Z3G2)能够抵制文昌鱼体液补体介导的溶菌作用。本文首次将脊椎动物血清补体消耗标准测定方法运用到文昌鱼溶菌功能研究中,使用蛋白酶K消化法分别提取辛辛那提弧菌HW287和溶藻胶弧菌HW284的LPS,经12% SDS-PAGE电泳、银染色后,发现辛辛那提弧菌HW287 LPS既有高分子量的O-抗原又有低分子量的O-抗原的梯状带结构,而溶藻胶弧菌HW284几乎没有高分子量的O-抗原带。高分子量的O-抗原缺乏是与溶藻胶弧菌HW284对文昌鱼体液敏感相一致的。而辛辛那提弧菌HW287具有许多高分子量的O-抗原呈现出补体抵制,表明O-抗原的大小与体液抵制之间是正相关的。此外,用辛辛那提弧菌HW287或溶藻胶弧菌HW284处理后的文昌鱼体液,然后与兔红细胞相作用,结果表明2种弧菌对补体都有消耗,但是与辛辛那提弧菌HW287相比,溶藻胶弧菌HW284对补体消耗显着高的水平。所有这些结果都表明高分子量的O-抗原似乎具有双重的作用:它既能够避免激活补体,又能够阻止结合到细菌表面上的补体损伤细菌细胞膜。由此保护了包括辛辛那提弧菌HW287在内的对文昌鱼体液的杀伤产生抵制作用的弧菌。
和亚男[3]2008年在《文昌鱼Bf/C2基因的克隆、表达与进化分析》文中研究说明文昌鱼属于脊索动物门头索动物亚门,长久以来一直被认为是现存的与脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物。其形体结构、发育模式和基因组都代表了脊椎动物最简单的模式,为研究脊椎动物免疫的起源和免疫基因的进化提供了一个最理想的实验动物模型。虽然缺乏类似脊椎动物的适应性免疫系统,文昌鱼仍然能够在多种生存环境下健康生长,繁殖后代,它们的成功很大的程度上依赖于其有效的先天性免疫系统。补体系统是先天性免疫系统的重要组成部分,是一个复杂的限制性蛋白水解系统。补体成分可以通过经典途径、替代途径以及凝集素途径活化。补体B因子又称C3激活剂前体,是补体替代激活途径的关键酶之一,主要由肝脏合成。B因子及其同源基因的克隆在人、黑猩猩、鼠、非洲爪蟾、斑马鱼、七鳃鳗、海鞘、海胆、鲎、海葵等动物中都有报道,而且已有实验表明文昌鱼存在补体替代途径,但文昌鱼B因子基因的克隆及其进化分析迄今未见报道。本论文主要利用分子生物学方法,克隆得到文昌鱼具有完整编码框的B因子cDNA全长,并对B因子的表达和功能进行分析。文昌鱼B因子cDNA全长2362 bp,开放阅读框2259 bp,编码752个氨基酸的蛋白质(理论蛋白分子量为82.6 KDa)。文昌鱼B因子为嵌合蛋白,结构域组成为CCP-EGF_CA-CCP-CCP-vWFA-SP,与哺乳动物B因子结构域相比在结构域CCP1与结构域CCP2之间另外具有一个EGF_CA结构域,是Bf/C2家族的一个新成员。荧光实时定量PCR结果显示文昌鱼受脂多糖(LPS)刺激后,其肝盲囊中BbBf/C2表达量迅速升高且持续维持在升高水平,而后肠中BbBf/C2表达量上调较晚并在显着升高后迅速下降到基准水平。同样,Immuno-Dot Blotting结果显示文昌鱼受到LPS刺激后,其肝盲囊和后肠中BbBf/C2蛋白表达量都有显着升高,而前者表达量升高更显着。所有这些结果都表明肝盲囊和后肠都是文昌鱼受LPS刺激后的免疫反应器官,但是与脊椎动物肝脏同源的肝盲囊是文昌鱼受LPS刺激后BbBf/C2主要合成器官,在急性反应中具有重要作用。
高瞻[4]2015年在《文昌鱼补体因子C1q和C3a基因的鉴定、表达和功能研究》文中研究表明文昌鱼是研究脊椎动物起源与进化的重要模式动物,研究文昌鱼补体系统有助于追溯脊椎动物补体系统的起源。补体系统是先天性免疫的重要组成部分,它能够帮助抗体和吞噬细胞清除病原微生物,从而起到连接先天性免疫和获得性免疫的重要作用,其激活途径一般认为有经典途径、替代途径和凝集素途径3条途径。我们从文昌鱼体内克隆得到补体类Clq基因和C3a基因,并进行了表达和功能研究。具体结果如下。在对文昌鱼基因组中C1q-like基因分析之后,我们从中选择并克隆了一个与脊椎动物C1q序列相似度高、含有与IgG、C1r-C1s吉合关键位点的基因。进化分析显示该基因与脊椎动物C1q直系同源,因此我们将之命名为BjC1q。Real-timePCR分析表明BjC1q基因在文昌鱼肝盲囊、后肠和脊索大量表达,并且其表达量在文昌鱼受到免疫刺激(细菌、脂磷壁酸或脂多糖)之后显着上升,这表明BjC1q参与免疫相关功能。接着,我们重组表达并纯化了BjC1q蛋白以及它的胶原结构域和gC1q结构域,并利用ELISA、 Western blot、溶血活性测定、亲和层析等技术,重点研究了BjC1q是否具有参与经典激活途径的能力。我们发现重组表达的BjC1q可以形成多聚体,这是C1q激活经典途径所必需的。与人C1q蛋白一样,BjC1q及其gC1q结构域能够与脂磷壁酸、脂多糖结合,甚至还能与人IgG结合。与七鳃鳗C1q不同的是,BjC1q不具备凝集素活性。更重要的是,将BjC1q加入去除了C1q的人血清后,补体经典途径的溶血活性得以恢复。我们还进一步证实BjC1q能够结合并激活人C1r-C1s。以上结果表明,BjC1q具有参与经典激活途径的能力。为了深入探索文昌鱼体内是否存在类C1q介导的补体激活系统,我们又进行了下面一系列实验。首先,利用pull-down技术分离并鉴定了BjC1q的互作蛋白,该蛋白含有叁个免疫球蛋白结构域,故命名为BjIgSF。BjIgSF-BjC1q的结合与IgG-C1q的结合相似,都具有激活经典途径的能力。另外,C4和C3沉降实验结果表明,文昌鱼体液具有激活C4和C3的能力,而去除BjC1q的体液或加热至56。C的体液均失去激活能力。将BjC1q加入去除了BjC1q的文昌鱼体液后,体液激活C4和C3的能力可以恢复,证明文昌鱼体液中存在具有激活C4和C3能力的C1q-丝氨酸蛋白酶复合体。BjIgSF、BjClq-丝氨酸蛋白酶复合体等成分的存在,表明文昌鱼体内存在一个由C1q介导的补体激活途径。我们推测,类似脊椎动物简单的补体典途径可能起源于文昌鱼类C1q介导的补体系统,这是关于脊椎动物经典途径起源的一个新观点。我们还在文昌鱼中克隆得到C3a基因片段,将其命名为BjC3a,并通过原核表达系统对BjC3a进行了重组表达。序列分析和同源建模显示BjC3a蛋白结构与人C3a的结构相似,C-端都是α-螺旋结构。人C3a的C-端α-螺旋部分具有杀菌功能,我们推测BjC3a具有抑菌功能,并通过抑菌实验证实了该推测。另外,BjC3a参与免疫应答的能力与脊椎动物C3a相仿,实验证明BjC3a能够增强鲈鱼巨噬细胞的免疫应答能力,例如引起巨噬细胞的迁移,增强巨噬细胞对细菌的吞噬作用,还能增强巨噬细胞应对细菌时的呼吸爆发作用。我们同时重组表达了去除C-末端精氨酸的BjC3a,命名为BjC3a-desArg,并对其免疫活性进行了同样的检测。脊椎动物C3a的趋化因子功能以及调理功能会随着血清羧肽酶对C3a的C-末端精氨酸的切除而失去,不过抑菌等功能得到保留。实验结果表明BjC3a-desArg也保留了C3a抑菌和刺激呼吸爆发的能力,说明了C3a-desArg的免疫功能在进化过程中的保守性。总之,本次实验证明了无脊椎动物(文昌鱼)BjC3a能够与脊椎动物(鲈鱼)巨噬细胞结合并介导免疫活性,表明在最原始的脊索动物文昌鱼体内已经出现了与脊椎动物补体系统引起的炎症应答类似的免疫反应。
高媛媛[5]2007年在《文昌鱼应激反应的蛋白质组学及creatine kinase的免疫功能研究》文中研究说明由于文昌鱼在进化上的特殊地位,近年来成为众多免疫学家研究的热点。通过研究文昌鱼自身免疫的特点,寻找文昌鱼免疫相关因子,尤其是适应性免疫的分子,进一步揭示适应性免疫如何起源和进化,具有重要的意义。本文以厦门海域文昌鱼为研究材料,运用蛋白质组学、免疫学、分子学生物学等研究方法,对文昌鱼五种应激免疫反应进行研究,筛选和鉴定了多种和文昌鱼免疫相关的蛋白,并对其中最重要的肌酸激酶(creatine kinase,CK)在抵御病原菌感染中的作用进行了深入研究。在国内外首先采用差异蛋白质组学技术,研究了文昌鱼对盐度、皮肤划伤应激和对细菌感染、免疫攻毒等的体液或肌肉蛋白质组,发现了差异变化蛋白,探讨了其免疫保护特征,旨在初步阐明文昌鱼免疫进化特点。通过比较分析上述文昌鱼免疫反应的试验结果,发现了文昌鱼15个免疫相关因子,其中ribosomalprotein S10,CAVPT,Cathepsin,Intermediate filament protein以及CK在多种免疫反应中表达都发生变化,对进一步确定文昌鱼相关免疫因子具有重要的参考价值。特别重要的是,CK在双向电泳图谱中表现为11种不同形式的蛋白点,位于酸端的CK1的变化最为显着,值得进一步研究。通过Western blotting检测和酶活力测定,进一步证明割伤后体液中CK的酶活力和蛋白含量都有一个先升高再恢复的动态变化过程,说明CK是一个典型的APP。此外,通过对文昌鱼CK的克隆测序分析和磷酸化分析,探讨了CK在双向电泳图谱中表现形式的多样性的原因,推测这种多样性不是由基因多样性造成,而是由翻译后修饰造成的。通过pull-down试验证明,文昌鱼体液中的CK蛋白可以和多种细菌结合。纯化的原核表达CK可以使多种菌凝集,进一步证明了这种结合是一种直接的相互作用。通过酶活力测定发现,细菌菌体结合CK后能抑制其酶活力。不同菌对CK结合抑制能力不同,并且这种影响呈剂量效应。Far-western blotting和Co-IP试验证明了大肠杆菌通过OmpA,OmpX,OmpW叁个外膜蛋白和CK直接结合。叁个蛋白在Ecoli BW25113与突变株△OmpA,△OmpW和△OmpX的含量不同,并且对CK的影响能力也不同:OmpA和OmpW在菌体中含量大,对CK活力的抑制作用比较强,而OmpX的含量相对比较少,并且没有抑制作用。因此,Ecoli BW25113与突变株△OmpA,△OmpW和△OmpX对CK的结合能力和对其活力的抑制作用不同。Far-Western blotting的结果显示,OmpA和OmpW都同时和CK的两个结构域domainC及domainN结合,而OmpX仅和domainC结合,这可能是导致OmpX不能抑制CK酶活力的原因。RNA干扰试验说明,CK在文昌鱼抵御病原菌侵入方面有重要的作用。不同浓度的副溶血弧菌感染文昌鱼的试验和抑菌试验的结果表明,一定浓度的CK只能抑制一定数量的病原菌的生长,如果菌数目过多则不能达到抑制的目的。因此,我们推测文昌鱼的CK在抵御病原菌入侵的时候,既有识别功能,也具有一定抑菌作用。
王雷雷[6]2013年在《扇贝补体相关分子的结构及功能研究》文中研究说明补体系统是多细胞有机体内重要的免疫效应系统，在固有免疫防御中发挥重要作用。补体相关分子存在于多个无脊椎动物门类中，并参与了宿主的免疫防御。目前，软体动物补体相关分子以及补体激活途径的研究刚刚起步，亟待深入。本论文采用分子生物学、生物信息学和免疫学等多种技术，对栉孔扇贝（Chlamysfarreri）和海湾扇贝（Argopecten irradians）中的含C1q结构域蛋白（AiC1qDC-2，CfC1qDC-1和CfC1qDC-2）、含硫酯蛋白（CfTEP）、C型凝集素（AiCTL-9）以及纤维蛋白原相关蛋白（CfFREP）等补体相关分子进行了结构和功能的研究，探讨了它们在扇贝免疫系统中的作用。利用RACE技术从海湾扇贝中克隆获得了AiC1qDC-2基因的cDNA序列全长，该分子开放阅读框编码的蛋白序列中含有一个gC1q结构域，具有C1qDC蛋白家族典型的由十个β折叠片形成的球形结构以及特征氨基酸残基。RT-PCR检测结果显示AiC1qDC-2的mRNA主要在肝胰腺和性腺中表达，并且在扇贝受到不同微生物刺激后，血细胞中的表达量均显着上升。重组的AiC1qDC-2可结合LPS、PGN、Yeast-glucan和polyI：C等多种PAMPs，并可凝集Escherichia coli、Vibro anguillarum、Bacillus subtilis和Pichia pastoris等微生物。利用RT-PCR技术检测了栉孔扇贝CfC1qDC-1mRNA的表达模式，发现LPS，PGN或β-glucan可显着上调血细胞中该分子的表达水平；在扇贝早期胚胎发育过程中该分子的表达量在D型幼虫期开始迅速上升，在眼点幼虫期达到最高。免疫荧光检测显示，CfC1qDC-1蛋白主要存在于扇贝的肝胰腺、鳃、肾和性腺组织中。重组的CfC1qDC-1能够结合LPS、PGN、β-glucan、polyI:C以及人热聚集的IgG分子，并且与IgG的结合能力可以被LPS所阻断。此外，rCfC1qDC-1还能显着增强血细胞对E.coli的吞噬作用。高级结构分析表明CfC1qDC-1gC1q结构域表面带正电荷氨基酸残基的分布模式与人补体C1q ghB相似。利用RACE技术从栉孔扇贝中克隆获得了CfC1qDC-2基因的cDNA序列全长，该分子的氨基酸序列包含叁个典型的gC1q结构域，能够形成与人补体C1q相似的钟型叁聚体高级结构。RT-PCR检测显示，CfC1qDC-2的mRNA在肝胰腺中表达量最高，在扇贝早期胚胎发育到D型幼虫时表达量开始显着上升，在眼点幼虫期达到最高表达水平；当扇贝受到LPS、PGN或β-glucan刺激后，血细胞中该分子mRNA的表达水平显着上升。重组的CfC1qDC-2具有广谱的配体结合谱，可结合6种不同类型PAMPs、8种微生物、扇贝凋亡细胞以及人热聚集IgG和IgM分子，并能抑制兔血清C1q依赖的溶血活性。利用RACE技术从海湾扇贝中克隆获得了AiCTL-9基因的cDNA序列全长，该分子所编码的氨基酸序列包含四个CTLD结构域，具有C型凝集素家族典型的结构和特征基序。RT-PCR检测显示，AiCTL-9的mRNA在肝胰腺和性腺中表达量较高，并且当扇贝受到不同微生物刺激后，血细胞中的表达量均显着上升。重组的AiCTL-9可结合LPS、β-glucan、MAN等多种PAMPs，凝集E. coli、V.angulillarum、B. subtili和Micrococcus buteus等微生物，还能显着增强血细胞的包囊化作用。利用同源克隆技术从栉孔扇贝中克隆获得了CfFREP基因的cDNA序列全长，该分子的氨基酸序列包含一个FBG结构域，具有FREP家族典型的结构和特征序列。RT-PCR检测结果显示，当扇贝受到LPS或PGN刺激后，血细胞中CfFREPmRNA的表达量均显着上升。免疫荧光显示CfFREP蛋白主要存在于扇贝的肝胰腺，鳃，肾以及血细胞周围。重组的CfFREP可结合LPS、PGN、β-glucan和polyI:C，但无凝菌活性。利用RT-PCR技术对栉孔扇贝CfTEP mRNA的检测结果显示，当扇贝受到LPS、PGN或β-glucan刺激后，血细胞中该分子的表达量均显着上升；在扇贝早期胚胎发育过程中，该分子的表达量从D型幼虫期开始显着上升，在眼点幼虫期达到最高。免疫荧光表明CfTEP蛋白主要分布于扇贝肝胰腺、鳃、肾、性腺和外套膜中，并且在D型幼虫、面盘幼虫和眼点幼虫外围也均有分布。Westernblotting显示CfTEP蛋白在扇贝血清中以断裂的片段形式存在，并且当注射甲胺使体内TEP失活后，扇贝在V. angulillarum侵染后的存活率明显下降。对以上六个扇贝补体相关分子的研究表明，它们与高等动物补体分子C1q、C3、ficolin或MBL在结构上存在相似，并具有高等动物补体分子类似的功能，可作为模式识别受体参与免疫识别，抑或作为效应分子参与病原清除，同时，具有结合高等动物免疫球蛋白和扇贝凋亡细胞的能力。该研究结果表明补体相关分子可能作为原始补体系统的组分参与扇贝的固有免疫防御，为阐明补体相关分子的进化脉络以及丰富和发展海洋无脊椎动物免疫学内容提供了分子生物学证据。
胡瑜兰[7]2009年在《硬骨鱼类补体关键因子C1q及免疫球蛋白分子克隆、进化和功能的初步研究》文中研究说明本论文对斑马鱼中补体经典途径中关键基因C1q以及免疫球蛋白基因进行了鉴定、功能以及进化的研究,共分为两个部分内容。第一部分应用生物信息学方法,利用基因组和EST数据库,在斑马鱼(Danio rerio)中成功预测并克隆了补体经典途径的关键基因C1q的C1qA、C1qB、C1qC叁个亚基编码基因,并结合哺乳动物、软骨鱼以及七鳃鳗(Lamprey)发现中报道的C1q基因,对它们进行了基因结构与分子进化等分析。同时,在硬骨鱼中对整个C1q家族成员进行了进化分析,提出了C1q家族和EMU家族存在进化关系。另外,利用原核表达系统表达了斑马鱼C1qA、C1qB和C1qC头部结构域蛋白,研究了它们在补体经典途径中的作用。研究显示,斑马鱼C1qA、C1qB和C1qC并能和体外聚合的斑马鱼IgM重链恒定区结合,但是不能结合体外聚合的IgZ重链恒定区。在以鲫鱼血清为材料进行的补体经典途径研究表明,鱼类中存在补体经典途径,并且C1qA、C1qB和C1qC分子均参与经典途径。此外,鱼类C1qA、C1qB和C1qC还能与人热聚的IgM和IgG结合,鱼类C1qA、C1qB和C1qC的头部结构域能竞争性抑制兔C1q介导的经典途径引起的溶血反应。第二部分克隆了多个斑马鱼免疫球蛋白基因,包括已知的IgM,IgZ基因和另外两个新的免疫球蛋白基因,其中之一与斑马鱼IgZ有一定相似性,称为IgZ-2基因,另一个为由IgM的膜型外显子直接与CH1末端连接的分子,对它们进行了生物信息学分析,在mRNA水平检测了IgZ-2在斑马鱼各个器官以及受精卵各个发育的表达情况,结果表明,IgZ-2主要表达于头肾、肠和皮肤,在受精卵发育的14天开始表达。C1q分子是补体分子经典途径的起始分子,补体经典途径起始于C1q的两个或多个球形头部和免疫复合物中的IgM或IgG分子结合。本文首次克隆了斑马鱼C1q的叁个分子C1qA、C1qB和C1qC以及斑马鱼的免疫球蛋白分子,对它们进行了生物信息学分析,并用Elisa分析了C1q和免疫球蛋白之间的关系。通过对硬骨鱼补体经典途径的研究显示,硬骨鱼中存在和哺乳动物类似的补体经典途径,硬骨鱼的C1q在补体经典途径中发挥与人C1q相似的功能。
杨光[8]2017年在《半滑舌鳎免疫相关基因C8和SHP-1的克隆、重组表达和功能分析》文中指出鱼类养殖在我国水产养殖业中具有举足轻重的地位,但日益频发的病害问题严重制约了鱼类养殖业的可持续发展。目前产业上迫切需要有效的病害防治技术保障水产品质量安全。对鱼类免疫机理的深入研究是实现这一目标的根本途径。半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国重要的海水养殖鱼类,目前养殖产值达到10亿元之多,但是细菌性和病毒性病害对半滑舌鳎养殖业造成严重威胁,由于对半滑舌鳎抗菌和抗病毒免疫防御机理不清楚,缺乏有效病害防治措施。通过半滑舌鳎转录组数据中抗病组、染病组和健康组的Cs C8基因和CsSHP-1的表达量存在显着差异,而且鉴于此CsC8基因和CsSHP-1在半滑舌鳎免疫系统中的重要性,本研究以半滑舌鳎为研究对象,对CsC8基因和CsSHP-1基因进行克隆鉴定、重组表达及功能分析,阐明半滑舌鳎抗病分子机制,为半滑舌鳎的病害防治提供重要理论基础。具体研究结果如下:对半滑舌鳎CsC8基因进行了克隆和验证,结果发现半滑舌鳎补体Cs C8由CsC8α、CsC8β和CsC8γ3条链组成,分别由CsC8α、CsC8β和CsC8γ编码,其中CsC8α基因包含了1797 bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码598个氨基酸,CsC8β基因包含了1749 bp的开放阅读框,编码582个氨基酸,CsC8γ基因包含了666 bp的开放阅读框,编码221个氨基酸。将CsC8α、CsC8β和CsC8γ的基因比对半滑舌鳎基因组,发现CsC8α和CsC8β位于20号染色体上,而CsC8γ位于第3号染色体上,并不是线性分布的。CsC8α、CsC8β和CsC8γ在13种健康组织中的表达情况显示,CsC-8α、CsC8β和CsC8γ在不同组织中均有表达,其中肝脏中表达量最高,其次是脾脏和卵巢;感染鳗弧菌后,CsC8α基因在6种免疫组织中整体均表现出上调表达趋势,不同组织对鳗弧菌的敏感度不同,Cs C8α基因在不同组织的表达量峰值出现的时间点也不同,其中肝脏(48h)、血液(48h)、脾脏(12h)、肠(12h)、头肾(24h)和鳃(6h),而且CsC8α在血液中表达量变化最明显,48h时的表达量达到0h的119.3倍(P<0.01);CsC8β基因在6种免疫组织中整体表现出上调表达趋势,CsC8β基因在肝脏、脾脏和鳃中都是在24h出现表达的最高,在肠中是在6h出现表达的最大值,表现出组织敏感性,在血液中出现了反常,在6h和24h表达上调后开始下调,但在72h出现表达的峰值,在头肾中,12h和48h表达量达到峰值,而且CsC8β在头肾中表达量变化最为明显,12h的表达量为0h的17.8倍(P<0.01);CsC8γ基因在6种免疫组织中整体表现出上调表达趋势,CsC8γ基因在肝脏、头肾、脾脏、肠和鳃中都是在12h出现表达的最高峰,在血液中,CsC8γ的表达量变化最为明显,72h的表达量为0h的48.3倍(P<0.01)。重组蛋白CsC8α体外抑菌实验结果显示,重组蛋白CsC8α对鳗弧菌的抑制效果最为明显,抑菌率随着重组蛋白浓度的增加明显升高;对爱德华氏菌和副溶血弧菌的抑菌效果明显弱于对鳗弧菌的抑菌效果,但也表现出了一定的抑菌作用;当重组蛋白浓度超过0.3mg/ml后,也只达到0.5以上;对于革兰氏阳性菌的代表菌株金黄色葡萄球菌,重组蛋白对其抑菌效果不明显,抑菌率一直在0.5以下,在最高浓度0.5mg/ml时抑菌率才达到0.43,得不到明显的抑菌效果。上述结果表明,半滑舌鳎补体基因C8在免疫应答反应中发挥重要作用,尤其是对细菌性病原菌引起的免疫反应和对革兰氏阴性菌的抑制作用。通过RACE和PCR技术获得半滑舌鳎CsSHP-1基因的cDNA全长,CsSHP-1的cDNA全长2045bp,编码区共包含1743bp,控制编码580个氨基酸。SMART结构域预测分析得知CsSHP-1基因共包含2个SH2结构域,1个PTPc结构域;通过氨基酸多序列比对结果显示,半滑舌鳎SHP-1与尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus的相似度最高,达到82%;系统进化树显示鱼类的SHP-1首先聚为一支然后再与高等脊椎动物聚在一起。CsSHP-1基因在13种健康组织中的表达分析显示,半滑舌鳎CsSHP-1在各个组织中均有表达,在脾脏中的表达量最高,心脏中的表达最低;感染鳗弧菌后在6种免疫组织肝、脾、小肠、头肾、鳃、血液中均出现不同程度的上调表达,但是峰值出现的时间点不同;用4种病原模拟物处理半滑舌鳎外周血淋巴细胞后,除PolyI:C处理后表达量呈现持续下调趋势外,其他实验组出现上调表达趋势,但不是很明显。为了进一步探究CsSHP-1的功能,本研究在毕赤酵母真核表达系统成功表达出分子量为67kDa的重组CsSHP-1,用CCK-8法测试重组蛋白CsSHP-1对人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549和人乳腺癌细胞MDA-MB-231叁种癌细胞的体外细胞毒活性及强度。结果显示:重组蛋白CsSHP-1对3种癌细胞均有不同程度的细胞毒活性,其细胞毒活性强度顺序为:人肝癌细胞HepG2>人乳腺癌细胞MDA-MB-231>人肺癌细胞A549。综上所述:半滑舌鳎免疫相关基因C8和SHP-1在免疫应答中发挥着作用,对其免疫机理的研究为更加全面的了解半滑舌鳎免疫机制奠定理论基础。
陈家艳[9]2011年在《斑马鱼Properdin基因的鉴定、表达和功能特性》文中研究说明Properdin蛋白即P因子,是补体替代激活途径中的正向调节因子,起着稳定替代途径中C3转化酶(C3bBb)的作用。为了进一步阐明Properdin的结构和功能之间的关系,探索Properdin与C3b及B因子的结合位点,我们从斑马鱼中克隆并表达了该基因,以鉴定其功能特性。Properdin基因的开放阅读框全长为1314bp,编码一条含有437个氨基酸的多肽,其前20位氨基酸为信号肽,预测分子量大小为48.2KDa,也是由6个Ⅰ型凝血酶敏感蛋白重复序列构成。Properdin成熟蛋白中有40个半胱氨酸,预测有15个二硫键形成,31和58位处氨基酸可能为二个潜在的糖基化位点。对不同物种间Properdin的蛋白序列建进化树分析,结果显示斑马鱼Properdin蛋白和其它硬骨鱼Properdin聚成一簇。不同物种的Properdin蛋白序列及结构域进行多序列比对,发现斑马鱼properdin蛋白中存在保守的氨基酸基序WXXWXXW和RXR。与人、鼠、爪蟾、虹鳟(cfp1、cfp2、cfp3)的比较发现,同源性分别为42%、41%、43%、48%、48%和49%。实时荧光定量PCR结果显示:斑马鱼Properdin直到胚胎发育到30%下包时有母源性表达,且表达量随发育进行逐渐降低,但从20体节开始,合子基因开始表达。不同组织的实时荧光定量PCR结果表明,肝脏、肠、心脏、脑、眼睛、精巢、卵巢等组织中均有表达,在肠、鳍、肌肉的表达量相对较低,精巢、肝脏、眼睛、心脏、鳍的表达量较高,其中精巢中表达最多。综上所述,斑马鱼Properdin的结构域特征与哺乳动物中该蛋白的结构域特征一样,与其在系统中的发育地位是相符的。预测的一个糖基化位点位于Cys45和Cys63之间,而这两个半胱氨酸预测会形成二硫键,因此推测此二硫键为与糖类的结合位点。Properdin有母源性表达,可能提示其在发育早期起作用。不同物种间Properdin表达部位不同是否提示其功能有差异,还有待于深入研究。这是关于斑马鱼中Properdin基因表达及其表达模式的首次报道,我们已经纯化得到了Properdin重组蛋白,为以后利用免疫结合等生物学技术探索Properdin蛋白的结构、功能及作用机制奠定了基础。深入了解其功能,有助于我们阐明人类补体缺乏病理机制,也促进我们对鱼类补体系统的功能有更深入的理解。
王长法, 张士璀, 王勇军[10]2004年在《补体系统的进化》文中研究指明动物免疫由先天性免疫和获得性免疫系统组成[1]。先天性免疫是机体先天就有的 ,而且始终存在的防御机制 ,它们的作用没有特异性。获得性免疫力不是天生就有的 ,而是个体在发育过程中接触抗原后而逐步发展而来 ,它对诱发的抗原有特异性。它最早出现在有颌鱼类中。获
参考文献：
[1]. 文昌鱼体液和鱼类血清补体溶血系统比较研究[D]. 王长法. 中国海洋大学. 2003
[2]. 青岛文昌鱼体液补体介导弧菌溶菌活性及弧菌逃避补体攻击机制的研究[D]. 栗志民. 中国海洋大学. 2008
[3]. 文昌鱼Bf/C2基因的克隆、表达与进化分析[D]. 和亚男. 中国海洋大学. 2008
[4]. 文昌鱼补体因子C1q和C3a基因的鉴定、表达和功能研究[D]. 高瞻. 中国海洋大学. 2015
[5]. 文昌鱼应激反应的蛋白质组学及creatine kinase的免疫功能研究[D]. 高媛媛. 厦门大学. 2007
[6]. 扇贝补体相关分子的结构及功能研究[D]. 王雷雷. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2013
[7]. 硬骨鱼类补体关键因子C1q及免疫球蛋白分子克隆、进化和功能的初步研究[D]. 胡瑜兰. 浙江大学. 2009
[8]. 半滑舌鳎免疫相关基因C8和SHP-1的克隆、重组表达和功能分析[D]. 杨光. 上海海洋大学. 2017
[9]. 斑马鱼Properdin基因的鉴定、表达和功能特性[D]. 陈家艳. 中国海洋大学. 2011
[10]. 补体系统的进化[J]. 王长法, 张士璀, 王勇军. 海洋科学. 2004
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