刘德传[1]2004年在《清热祛湿法抗肝癌的分子机理研究》文中指出课题背景：肝癌是我国常见的一种恶性肿瘤，在我国城乡其发病率和死亡率均在前列，其病程短，死亡率高，危害大，治疗困难，多需采用中西医结合的综合治疗。提高肿瘤组织对化疗的敏感性，保护正常组织免受化疗的损害，减轻毒副作用，是提高恶性肿瘤治疗效果的重要途径。多年来，我国在运用中药防治化疗毒副作用和提高肿瘤细胞对化疗敏感性的研究中，已取得较大进展，但局限在中药的运用方面。本研究旨在阐明清热祛湿法在肝癌化疗中的对细胞凋亡和肿瘤血管生长作用的分子机制，以清热祛湿临床验方清香散为主和肝癌化疗的敏感药物氟脲嘧啶治疗手段，通过复制肝癌动物模型，检测肝功能、细胞凋亡、肿瘤微血管生长及其相关指标，如转氨酶(AST、ALT)、细胞因子(IL-2、IL-8、TNF、TGF-α)、细胞凋亡率、P53表达、微血管密度(MVD)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)，为开辟中药在肝癌治疗中的临床应用和实验研究，提供新的思路和研究手段。 实验方法：动物分组、造模、给药及指标检测方法 将大鼠随机分为5组：A组，正常对照组；B组，肝癌模型组；C组，氟脲嘧啶治疗组；D组，清香散治疗组；E组，联合治疗组。每组大鼠7只，全部雄性。造模参考吴仕九、王锦波方法，腹水型Walker-256肿瘤细胞株注射入大鼠皮下，长出皮下实体瘤，取瘤体周边鱼肉样组织剪成约2mm~3小块，实验组大鼠麻醉后，剖开腹腔，暴露肝脏，以眼科镊将瘤块植入肝脏包膜下，用可吸收凝胶海绵塞填压迫，防止瘤块脱出及出血，关闭腹腔，术后注射3天青霉素针剂(20万单位／只／天)。B、C、D、E四组按上述方法造模，予高糖高脂饲料饲养，置于高温高湿环境。A组不造模，予普通饲料饲养，置于普通环境。A、B组大鼠不给药；C组大鼠给予清香散水煎剂灌胃，11ml·kg~(-1)·d~(-1)，每天1次，连续15d；D组大鼠给予5-FU腹腔注射，75mg·kg~(-1)·d~(-1)，隔天1次，共7次；E组大鼠给予清香散和5-FU联合治疗，剂量及用法同C、D组。至造模第20天处死所有动物，腹主动脉取血，制备血清，进行相关指标检测，用比色法测转氨酶，放射免疫法测细胞因子(白细胞介素、TNF和TGF)。取肝脏瘤块及正常肝组织，10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片，行常规HE染色作病理学检查，原位杂交检测细胞凋亡率，免疫组化法检测P53、vEGF阳性细胞率及微血管密度(MVD)。主要结果:一、清热祛湿法对肝癌模型大鼠生存质量的影响 A组大鼠毛发光泽，活力强，进食正常，观察期间无死亡;B、C、D、E组大鼠毛发蓬松，倦怠呆卧，明显消瘦，进食逐渐减少，术后二周至四周内大鼠全部死亡。生存期:B组20.14士2.41天，C组21 .71士2.69天，D组22.86士3.18天，E组23.57士3.37天，B组最低，E组最高，呈递增趋势。部分大鼠死亡前数日始出现尿血、便血。于肝脏植瘤术后一周查肝脏B超均见Icm左右异常回声区。死后剖腹检查，腹部术口干洁，愈合良好，肝脏植瘤术处均见实体瘤，直径0.5一l.ocm，肝脏术口附近或邻近肝叶见1个或数个小转移灶，部分大鼠见腹水。结果表明，本实验所用造模方法可成功地在大鼠肝脏移植肝癌，生存期与文献报导的一个月接近，药物治疗可延长肝癌模型大鼠生存期，其中以清香散、氟脉哦睫联合治疗组最长。 本实验所复制的大鼠肝癌模型，在经典肝癌模型造模方法中，施予高温高湿环境和肥甘饮食两种湿热因素，成为病证结合之动物模型，并用清热祛湿方治疗，试图观察其对湿热条件下肝癌大鼠生存质量的影响及作用机理。清香散为湿热证的临床效验方，具有清热祛湿、行气活血作用，其中多个中药为临床及实验研究所证实有确切的抗癌效果，这是其一。既往清香散系列研究表明具有增强机体免疫功能、清除自由基促进抗氧化能力、提高胃肠肤和水通道蛋白的表达等作用，这是其二。湿热证系列研究所揭示的清香散清热祛湿作用机制，也是其在本实验中抗肝癌、保护机体的机制之一，这是其叁。二、清热祛湿法对肝癌模型大鼠转氨酶的影响(一)从T^(正常对照)组36.57士s.75u，B(肝癌模型对照)组135.00 士93.60U，C(5一FU治疗)组154.17土111.58U，D(清香散治疗) 组84.33士43.02U，E(联合治疗)组54.29士36.63U。D、B组大鼠 ALT水平明显升高，与A组相比有显着差异(P<0.01)。C与B组 一3- ALT水平无显着差别(P>0.05)，D和E组大鼠都低于B组，其中 E组与B组相比有显着性差异显着(P<0.05)。E组户山T水平显着低 于C组(P<0.05)。(二)ASTA(正常对照)组39.29士7.32U，B(肝癌模型对照)组 195.33士99.92U，C(5一FU治疗)组195.00士54.31U，D(清香散 治疗)组91.67士16.93U，E(联合治疗)组88.57士27.95U。B组 大鼠AST水平明显升高，与A组相比有显着差异(P<0.01)。C组 与B组AST水平无显着差别(P>.05)，D组和E组大鼠都显着 低于B组(P<0.01)。D组和E组大鼠AST水平都显着低于C组 (P(0 .01)。 ALT主要存在于肝细胞浆内，当肝细胞受损、细胞膜通透性增大即可逸出细胞外。轻微的肝细胞受损，ALT活性可增高一倍，是肝功能受损害最灵?
杨英艺[2]2017年在《近10年临床肝癌证候及方药文献研究》文中认为目的:肝癌是发病率极高的恶性肿瘤之一,被患者及医生称为"癌王",临床具有病发隐秘,进展极快,病情凶险,容易转移复发,治疗多因此拖延且困难等特点,其死亡率极高。虽然在中医没有"肝癌"病名,但是在"肝癌"相关的疾病与症状范畴当中,古今医家记载了大量医案,总结其诊治经验,为此做出很大贡献。本文以古今文献为切入点,运用数据挖掘方法,探讨"肝癌"的病因病机、辨证论治及其遣方用药等,进一步研究其肝癌的诊治规律及经验,希冀能提高现代中医对肝癌的诊治水平。方法:古今医家记载了众多关于"肝癌"的文献,本文将对这些文献进行深层次阅读和研究。论文首先对肝癌病症的发源进展,症状体征,病因病机及辨证施治等方面进行研究,并进一步分析古代中医治疗"肝癌"的思路和异同,而总结古代医家对肝癌病症的认识、治疗的主张观点,为现代中医临床应用提供价值。第二部分从现代文献中探讨现代医家对"肝癌"辨证分型施治,和主要治法治则等方面认识,及现代中医在结合现代医疗科学技术后的研究进展,成为现代乃至后世医生可以借鉴和利用的经验认识。后续则应用中医文献学的研究思路和研究手段,全面收集文献,再进一步处理总结获取到的文献的方剂药物及其他相关资料,希冀通过对数据的总结和统计考查,能较全面的认识肝癌辨证论治的规律。利用excel软件,对方药建立数据库,进行频数统计分析,利用SPSS.21进行聚类分析和因子分析,得出治疗用药的频率的高低,分析总结古今治疗肝癌辨证分型、治法治则、遣方用药方面的特点和规律,以指导现代中医的临床诊治工作,为有效治疗肝癌提供更多思路和经验。成果:共下载论文文章共778篇。将其进行处理,并按照相关标准进行选择,得到符合要求的医案文献共623篇,其中符合辨证分型研究的文献共323篇,符合进行治疗方法、治疗原则分析研究的文献有214篇,共有312篇文献可进行方剂及中药研究。在辨证分型方面,结果显示其主要分为肝郁气结型、肝肾阴虚型、气滞血瘀型,脾虚湿盛型、湿热蕴结型、正虚血瘀型、脾肾阳虚型7类。最主要的治疗方向为扶正祛邪。具体的治法相对应的可应用疏肝解郁法,滋阴法,行气活血法,健脾祛湿法,清热祛湿法,补气活血法,温阳健脾法等。在辨证及治法治则的指导下选择合适的对应的方剂药物。包括理气、理血、补益、清热、祛痰化湿等方剂及中药。在使用的中药方面,通过数据的统计发现茯苓、甘草、白术、柴胡、当归、白芍、黄芪、党参、白花蛇舌草、陈皮、半枝莲等为高频使用的药物。通过数据挖掘中的聚类分析及因子分析,发现可组合且药效强大的药对组合,如茯苓和白术;当归、生地;柴胡,白芍等药对。结论:对文献的研究细读,全面分析和整理,及中药的统计分析,得出以下结论如下:1.从中医古代文献中挖掘肝癌病症的起源及病名演变、临床表现、病因病机、辨证施治,及得出中医治疗肝癌的思路和方法。2.从现代中医文献的阅读及总结中知悉中医结合现代医学科学技术后在肝癌诊治方面的研究进展的概况。3.通过对文献数据得的统计与分析,知悉肝癌的常见中医证型、常用方剂中药,探讨并得出医家们治疗肝癌的用药规律、特点,及用药异同。对现代中医治疗肝癌病患提供明确的思路和科学的指导。
丁晓明[3]2006年在《麝黄消瘤方抗肝癌细胞侵袭与转移作用的实验研究》文中认为目的 本课题在原有体内实验的基础上，继续研究麝黄消瘤方(SH方)在体外对肝癌细胞SMMC-7721侵袭黏附能力的影响及其可能的作用机制。重点探讨SH方对肝癌细胞与纤维连接蛋白(FN)侵袭黏附的抑制作用，及SH方对肝癌细胞内抑癌基因nm23-H1蛋白和细胞膜表面粘附分子(ICAM-1)表达的影响，以更好的为临床应用及新药开发提供客观科学的实验依据。 方法 (1)含药血清的制备 麝黄消瘤方由丹参、白术、半枝莲、莪术等中药组成，经我院中药实验室水煎、浓缩、醇沉制成，临用时用PBS稀释成含生药2g／ml的中药液，雄性新西兰大白兔6只，体重2.5kg±0.1kg，分2组，每组3只，中药组予每只20ml／d中药液灌胃，对照组予PBS液每只20ml／d灌胃，连续5d，从第4d下午开始禁食，d5时先灌服半量，2h后再灌服余半量，再过1h后颈总动脉取血，无菌分离血清，经56℃30min灭活处理后，用0.22um微孔滤膜过滤除菌，以中药兔血清，对照兔血清分别配成含血清10％的PRMI1640培养液，-20℃保存备用。 (2)细胞生长与细胞抑制率测定将2.5×10~4SMMC-7721肝癌细胞株分别接种于含10％中药兔血清和10％对照兔血清的1640培养基中，1～7天每天计数细胞浓度，绘制细胞生长曲线。1，3，5，7天均以相同细胞数4×10~3／孔接种96孔培养板，每组设3个复孔，MTT法计数1，3，5，7天的细胞数量，以光密度OD570nm表示。肿瘤细胞抑制率=(对照组平均OD570nm-中药组平均OD570nm)／对照组平均OD570nm×100％。 (3)细胞膜表面ICAM-1表达测定 细胞传代后换用中药兔血清和对照兔血清1640培养基分别培养72小时，以0.25％胰蛋白酶消化，收集细胞制成悬液，离心，PBS洗涤，加入鼠抗人ICAM-1单抗30ul，冰上孵育30min后，加入FITC标记的羊抗鼠二抗20ul，4℃孵育30min。FACS Calibur流式细胞仪检测闪烁计数值。 (4)免疫组化法检测细胞nm23-H1水平的变化 细胞涂片于6孔板中的玻璃片上，分别以中药血清与对照血清培养72小时，4％多聚甲醛固定，30％H_2O_2+纯甲醇灭活内源性过氧化物酶，BSA封闭，滴加1：200稀释一抗，再依次加二抗、SABC、DAB显色、苏木素轻度复染，脱水、透明、封片固定。用已知阳性染色的肝癌切片为每次实验的阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。 (5)肝癌细胞对FN的侵袭粘附试验 将SMMC-7721细胞悬液接种于FN包被的6孔培养板上，用含10％小牛血清的1640培养至细胞长满后，在孔底刮出一条2mm宽的无细胞带，洗去多余的细胞，分别改用中药组血清和对照组血清培养，观察细胞生长状态，贴壁情况和刮痕宽度变化，记录12h、24h、36h时以上状况。 (6)MTT定量测定肝癌细胞与FN的粘附 4×10~5／ml的细胞接种于FN包被的96孔培养板，100ul／孔，分别设中药血清，对照血清组培养，增设无细胞有药物组作阴性对照组。加入培液100ul／孔，每组设计4个复孔。置37℃，CO_25％培养箱内培养，10min，20min，40min，60min时按时间分类组分别用PBS洗去未粘附的细胞，每孔加20ul的浓度为5mg／ml的MTT，置培养箱内4小时后，倾去液体，加入DMSO150ul／孔，在震荡仪上轻轻震荡使甲替颗粒融解为红紫色溶液，上酶标仪，光密度570nm处测OD值，OD值代替粘附细胞数作统计分析。 结果 (1)SMMC-7721细胞生长繁殖力随时间变化是逐渐上升，在第4～6天最为明显。中药血清组较对照组明显抑制肝癌细胞的体外生长，1，3，5，7天平均抑制率分别为10.84％(p＞0.05)、35.97％(p＜0.01)、66.25％(p＜0.01)、30.20％(p＜0.05)，其中在第5天最突出，抑制率最高达66.25％；
朱红云[4]2013年在《初探《本草纲目》对肿瘤研究的贡献》文中研究说明目的：目前,肿瘤已成为世界上严重威胁人类生命和健康的首要敌人,其发病率还在逐年上升。祖国医学在肿瘤防治方面具有悠久的历史,其在长期的临床实践中积累了丰富的经验,在抗癌方面取得了良好的疗效。由于恶性肿瘤的发病率高,病程复杂,治疗手段多样,预后恢复不理想。因此,以中医药理论为指导,采取针对性措施进行综合治疗,具有很高的实用价值和现实药物意义。《本草纲目》是我国古代具有历史性意义的本草着作,其中收载了大量防治肿瘤的药物,为防治肿瘤提供了宝贵的临床经验和参考依据,是我们发掘和研究的最好资源,探讨总结其在肿瘤方面的贡献,以期为肿瘤的现代研究提供借鉴依据。方法：①本课题采用传统文献研究和统计分析研究相结合的方法。以古代肿瘤相关病名为主线索,整理统计《本草纲目》主治项下载有肿瘤相关病症病名的中药,每味药按其《本草纲目》主治项、来源、四性、五味、归经、毒性、功效、现代研究八个部分进行整理和归纳,作为研究资料。然后查阅整理以上所选中药的现代研究,统计出以上所选中药中据研究报道具有抗肿瘤作用的药物,统计数据,继续以此方法从数据比例方面经一步论证它们的具体一一对应关系。②整理归纳上述所选抗肿瘤药物的研究现状,总结目前研究所取得的成果,找出还存在的不足及问题,并给出解决的建议。统计分析这些已被证实有抗肿瘤作用药物的来源、四性、五味、毒性等药性内容,分析探讨这些药物在四性,五味,归经、毒性等方面的特点及依据,总结规律。结果：所得总比例数据支持古代中医肿瘤相关病症病名与现代医学肿瘤有相关性的观点。本文进一步论证了它们的具体一一对应关系,经统计发现一些统计数据支持它们之间的具体一一对应关系；同时发现一些统计数据并不支持它们之间的具体一一对应关系。经归纳发现,虽然抗肿瘤中药的研究涉及的药物数量较多,涉及的面较广,但研究“质量”不高；更多的是课题性、科研性研究与临床应用研究没有很好的联系起来。另一方面,对临床实践应用的观察与相关研究相对较少,未能及时系统总结出临床用药经验。虽然现代医学肿瘤研究取得了很大的进步,但是对以往研究进行系统性回顾分析的文献报道却很少,故抗肿瘤研究最急将现有海量的数据和信息加以分析、整合,从中寻找规律以及及时发现以往研究中存在的问题,并找到解决的对策,现代肿瘤研究才能取得更大的进步。经归纳统计发现,所筛选的具有抗肿瘤作用的中药大多来源于植物药,占85.35%,四性主要偏于寒凉性,寒凉类占所选中药总数的44.59%；以苦辛甘味为主要五味来源,归经主要以归肝肺心脾为主；记载有毒的药物占总药物的19.11%,应谨慎使用,注意用法用量；功效主要以清热解毒、化瘀、散结、补益、化痰祛湿等为主要功效。
杨荣[5]2008年在《蟾蜍皮水提物对人肝癌细胞SMMC-7721生物学行为影响的实验研究》文中指出背景和目的:恶性肿瘤已成为危害人类健康的头号病症之一,常规的化疗﹑放疗及手术治疗对于控制大多数的癌症并不理想。肿瘤患者接受放疗、化疗杀灭肿瘤细胞的同时,由于多数抗肿瘤药物缺乏选择作用,对正常机体也有相当大的损伤,导致骨髓造血功能抑制、消化道反应、肝脏及肾脏等组织的损害、免疫功能下降等。中药配合放、化疗不但可以减轻其副作用,对肿瘤的疗效也有明显提高。单纯的局部客观症状缓解并不能全面反映中医药的疗效,带瘤生存,全身治疗,改善症状,提高生命质量是中医药抗癌的特色所在。因此对天然生物及植物药物有效成分的提取作为新的防癌剂,已成为当今科研工作者们最感兴趣的研究课题。本实验的研究目的是探讨蟾蜍皮水提物的体外抗肿瘤作用。中药抗肿瘤的作用机制是复杂的,不管是单味中药还是复方制剂,都含有多种成份,因此其作用不是单一的,它们可能具有多方面的作用。如何从多层次、多学科对中药抗肿瘤的作用机制进行客观、定性、定量的研究,以进一步揭示其奥秘,尚待中医药科学工作者的不断努力。相信,以数千年中医药理论和实践经验为基础,结合现代药物理论和生物技术,中药的抗肿瘤作用机制研究和临床应用将会有很大的发展。方法:1.细胞培养:肝癌细胞SMMC-7721于含10%新生牛血清、100U/ml青霉素链霉素的DMEM培养培养液中,在37oC、5%C02、饱和湿度条件下,于CO2培养箱中进行培养。2. MTT比色实验:选择在对数生长期生长良好的细胞,制成单细胞悬液,接种细胞于96孔培养板中,其中设空白对照组不加受试细胞。培养24小时后,药物组加入不同浓度的蟾皮水提物,阴性对照组加入等体积的DMEM培养液,于加药后第4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、72小时加入MTT检测,求出OD值。(1)Y轴为细胞存活率,X轴为测定时间,制作4-72小时的细胞生长曲线。(2)利用公式计算细胞24小时、48小时、72小时的细胞增殖抑制率。(3)通过EXCEL画图法做趋势线来求24小时、48小时、72小时IC50值。3.集落形成实验:收集对数生长期细胞,接种于六孔板,200个细胞/孔,通过两种方法检测集落形成的情况。设药物组,加入低、中、高浓度的药物。阴性对照组,加入等体积的DMEM培养液。检测药物作用于肝癌细胞48小时后的集落形成情况。4.转移小室实验:药物作用细胞24小时后,转入小室内,CO2孵箱内培养24小时,将小室取出,通过染色、脱水等步骤,将小室底部的膜沿壁切下,中性树胶封片,在光镜下,每个膜分别计数5个视野的穿膜细胞数,求得单个视野的平均穿膜细胞数。结果:1. MTT结果(1)增殖抑制率结果:药物浓度为0.03125mg/ml、0.0625mg/ml、0.25mg/ml时,作用24小时后,对肝癌细增殖抑制率为13%、20%、53%;作用48小时后,抑制率分别为22%、37%、68%;作用72小时后,抑制率为58%、75%、82%。与阴性对照组组相比,效果显着(P<0.05)。(2)生长曲线结果:生长曲线显示药物组细胞生长缓慢。(3)(IC50)值:药物作用于肝癌细胞24小时的(IC50)值为0.2176mg/ml;48小时为0.0655mg/ml;72小时为0.0237mg/ml。2.集落形成率的测定结果:0.005mg/ml药物作用48小时后,去含药培养液,常规培养6天,其集落形成率为12.4%。常规培养5天后,加入不同浓度的药物作用48h后去药物,继续常规培养3天,其集落形成率为14.3%,与对照相比其集落形成率和集落形成抑制率有显着差异(P<0.01)。3. Transwell小室结果:浓度的蟾皮水提物作用24小时后,其穿膜数为25.31,与对照组相比,差异具有显着性(P<0.01)。结论:相同浓度的药物作用于肝癌细胞,随着时间的延长,增殖抑制率随之上升。相同的作用时间,随着药物浓度的增加,增殖抑制率随之上升,呈现出时间浓度依赖性。且低浓度的蟾皮水提物作用肝癌细胞48小时即能抑制其集落形成;作用24小时能抑制其侵袭活性。
参考文献：
[1]. 清热祛湿法抗肝癌的分子机理研究[D]. 刘德传. 第一军医大学. 2004
[2]. 近10年临床肝癌证候及方药文献研究[D]. 杨英艺. 广州中医药大学. 2017
[3]. 麝黄消瘤方抗肝癌细胞侵袭与转移作用的实验研究[D]. 丁晓明. 湖北中医学院. 2006
[4]. 初探《本草纲目》对肿瘤研究的贡献[D]. 朱红云. 成都中医药大学. 2013
[5]. 蟾蜍皮水提物对人肝癌细胞SMMC-7721生物学行为影响的实验研究[D]. 杨荣. 大连医科大学. 2008
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