嗜热菌丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的原核表达、纯化及活性分析

论文摘要

嗜热菌,是一类能适应高温的微生物。其生长速度较快,代谢较强,在高温下有着显著的生存优势,在环境保护、能源利用等方面具有广泛的应用。嗜热酶,是从嗜热菌中分离得到,能够适应高温反应条件的酶。酶偶联法是体外测定酶活性的常用方法之一。如:丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）是测定核苷二磷酸（nucleoside diphosphate,NDP）生成反应的常用偶联酶。嗜热菌苍白空气芽孢杆菌（Aeribacillus pallidus JH-7）的最适生长温度为50℃。为了分析其PK和LDH是否可以作为50℃反应条件的偶联酶,本研究从A.pallidus JH-7基因组中克隆其pk和ldh,分别构建入表达载体pET24a,经蛋白质的诱导表达、纯化得纯度达95%以上的apPK和apLDH。利用分光光度法,分别对apLDH和apPK的催化效率和动力学常数及进行了探讨,我们发现apPK的最适底物为ADP,其催化效率是5×104M-1.s-1,最适pH为8.0,最适温度为45℃;NADH为apLDH的最适底物,催化效率为3.7×105M-1·s-1,最适pH为5.8,最适温度为35℃。虽然50℃不是apLDH和apPK的最适温度,但它们在此温度下kcat分别为16.4 s-1和64.5 s-1,暗示它们可以作为此温度下的偶联酶。TFSAC（Thermobifida fusca,嗜热放线菌;硫酸盐复合体）是嗜热放线菌的硫酸盐活化酶复合体,其缺失了ATP硫酸化酶的活性,但是具有腺苷磷酰硫酸激酶（adenosine 5’-phosposulfate kinase,APSK）的活性。APSK在硫的同化代谢中具有不可替代的功能。利用apLDH和apPK作为偶联酶,分析了其在50℃的反应条件下,其底物ATP和APS的动力学常数。结果我们发现KmAPS为0.65μM,kcat值为4.6 s-1。而在25℃的反应条件下,其KmAPS为0.56μM、kcat为2.45s-1。所以在50℃的反应条件下,TFSAC酶APSK的kcat值是25℃反应条件下的1.9倍,KmAPS值是25℃反应条件下的1.1倍,其APSK活性在50℃和25℃的活性相差不大,也说明apLDH和apPK可以作为偶联酶应用于NDP的测定。

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摘要

ABSTRACT

第一部分文献综述

第一章嗜热菌简介

1 嗜热菌

1.1 兼性嗜热菌

1.2 专性嗜热菌

1.3 极端嗜热菌

1.4 超嗜热菌

2 嗜热酶的来源

3 嗜热酶的耐热原理

4 应用价值

第二章含硫化合物在生命体中的功能

1 硫代谢相关酶

1.1 ATP硫酸化酶

1.2 APS激酶

第三章丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶和TFSAC蛋白

1 丙酮酸激酶

1.1 植物丙酮酸激酶

1.2 动物丙酮酸激酶

1.3 微生物丙酮酸激酶

2 乳酸脱氢酶

2.1 动物组织乳酸脱氢酶

2.2 微生物乳酸脱氢酶

2.3 实际应用

3 TFSAC（Thermobifida fusca,TF嗜热放线菌;硫酸盐复合体）

第二部分研究内容

第一章嗜热菌丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的原核表达与活性测定

1 前言

2 材料与方法

2.1 生化试剂和菌株载体

2.2 培养基

2.3 常用试剂配方

2.4 嗜热菌PK和LDH的基因克隆

2.5 pET24a-PK和pET24a-LDH表达载体的构建

2.5.1 质粒提取

2.5.2 双酶切表达载体pET24a和质粒pMD19T-pk和pMD19T-ldh

2.5.3 割胶回收

2.5.4 T4连接和转化

2.6 PK和LDH蛋白的表达和纯化

2.6.1 His-Tag蛋白纯化原理

2.6.2 PK和LDH的诱导表达

2.6.3 PK和LDH蛋白纯化

2.7 蛋白纯度以及浓度的测定

2.7.1 制胶

2.7.2 电泳相关步骤

2.7.3 染色和脱色

2.7.4 蛋白浓度的测定方法

2.9 嗜热菌PK和LDH酶活性影响因素测定

2.9.1 pH对嗜热菌PK和LDH酶活性影响的测定

2.9.2 温度对嗜热菌PK和LDH酶活性的影响测定

2.9.3 不同阳离子对嗜热菌PK和LDH酶活性的影响测定

2.9.4 嗜热菌PK和LDH酶稳定性测定

3 结果与分析

3.1 appk序列和apldh序列的PCR扩增

3.2 TA连接转化成功后,菌液PCR验证

3.3 pMD19T-pk和pMD19T-ldh酶切验证

3.4 T4连接后PK和LDH菌液PCR验证

3.5 蛋白表达纯化SDS-PAGE电泳图分析

3.5.1 ap-PK蛋白的电泳结果

3.5.2 ap-LDH蛋白的电泳结果

3.6 蛋白浓度测定

3.7 嗜热菌PK和LDH酶活性影响因素的分析

3.7.1 apPK和apLDH的最适pH分析

3.7.2 apPK和apLDH的最适反应温度分析

3.7.3 不同阳离子对apPK和apLDH活性影响的分析

3.7.4 apPK和apLDH的热稳定性分析

3.7.5 apPK和apLDH的动力学常数分析

4 小结

第二章嗜热菌PK和LDH作为偶联酶的应用

1 前言

2 生化试剂

3 方法

4 APSK活性测定

5 结果与分析

6 讨论与展望

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王文珍

导师: 孙梅好

关键词: 嗜热菌,丙酮酸激酶,乳酸脱氢酶,原核表达,酶活性测定

来源: 浙江师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 浙江师范大学

基金: 国家自然科学基金(30800019)

分类号: Q936

DOI: 10.27464/d.cnki.gzsfu.2019.000036

总页数: 65

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嗜热菌丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的原核表达、纯化及活性分析

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