迟胜起[1]2004年在《核基质结合区对马铃薯Y病毒非翻译CP基因及反向重复片段介导抗病性的影响》文中指出病原介导的抗病性是一种RNA介导的抗病性,也是一种转录后基因沉默。实践证明利用病毒来源的基因材料培育抗病毒植物是植物抗病毒基因工程的一种潜在有效的策略。核基质结合区是真核生物染色体中可以与核基质结合的一段DNA序列。它通过与核基质结合,把染色体分隔成一个个环状结构。许多研究表明核基质结合区能增强基因的转录、提高和稳定转基因的表达。利用核基质结合区构建表达载体被证明是一种提高基因表达的有效方法。本研究以马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN )的衣壳蛋白(CP)基因和烟草(NC89)为材料,拟通过将不同表达活性的MARs(TM1为弱MAR,TM2为强MAR)构建在能形成单链非翻译的PVYN-CP基因和形成hairpin-RNA结构的98bp反向重复结构表达盒外侧来转化烟草,探究不同表达活性的MARs对单链全长非翻译的PVYN-CP基因及反向重复结构所介导的抗病性差异。主要的研究结果和结论如下:1. 不同表达活性的MARs对单链全长非翻译的PVYN-CP基因介导抗病性的影响(1)以表达载体pROKII为基础,用全长非翻译的PVYN-CP基因构建植物表达载体pRPVYCPN,在此基础上构建了两个在表达盒两侧带有不同表达活性MARs的表达载体pRTM1CPNTM1 和pRTM2CPNTM2。(2)以烟草栽培品种NC89为转基因材料,通过农杆菌介导的转基因策略将基因转入并整合到烟草中,经100mg/L的卡那霉素的筛选最终获得转化pRPVYCPN的T0代转基因植株72株、转化pRTM1CPNTM1的T0代转基因植株369株和转化pRTM2CPNTM2的T0代转基因植株344株。(3)转基因植株的抗病性分析表明,在转化pRPVYCPN的72株T0代烟草植株中得到高抗的转基因植株6株,抗性比率为8.3%,而转pRTM1CPNTM1的369株T0代烟草植株中有58株高抗,抗性比率为15.7%,转pRTM2CPNTM2的344株T0代烟草植株有52株高抗,抗性比率占15.1%。带MARs的构建比不带MARs的构建抗性比率提高将近一倍,但在转pRTM1CPNTM1(弱MAR)和转 pRTM2CPNTM2(强MAR)所得到的烟草植株的抗病比率之间没有差异。(4)转基因植株总DNA PCR和Southern blot分析表明目的基因已经整合到植物基因组中,但转基因的拷贝数与抗病性无明显的相关性。(5)Northern blot分析显示抗病植株体内几乎检测不到RNA的存在,而感病植株体内
迟胜起, 宋云枝, 朱常香, 郑成超, 刘晓玲[2]2005年在《核基质结合区对马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因介导抗病性的影响》文中认为为探索核基质结合区(m atrix attachm ent reg ions,MAR s)对RNA介导的病毒抗性的影响,我们将从烟草中克隆到的核基质结合区TM 2构建在包含马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因的植物表达载体pRPVYCPN的表达盒的两侧,构建了植物表达载体pRTM 2CPNTM 2。采用农杆菌介导基因转化法,将表达载体pRPVYCPN和pRTM 2CPNTM 2转入烟草品种NC89中,分别获得了144株和344株转基因烟草。抗病性检测发现,核基质结合区的存在能明显提高RNA介导抗性的产生效率。在含MAR s转基因植株中,抗病植株的比率为15.1%,而不含核基质结合区的转基因植株的抗病比率则为8.3%。这一研究结果对抗病毒植物的分子育种和转基因表达调控有指导意义。
姜芳[3]2011年在《马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA和人工的miRNA介导的病毒抗性的影响》文中研究指明基因沉默是生物体长期以来形成的一种防御机制,阻止外源基因、转座因子、病毒等外源核酸的侵入,保护生物基因组的完整性。小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)和微小RNA(microRNA, miRNA)是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子,是沉默RNA的最主要组成部分。RNA介导的病毒抗性(RNA mediated virus resistance, RMVR)是RNA沉默的一种表现形式,侵入植物细胞的病毒基因组与转基因转录产物具有部分同源性,因此在转录后基因沉默所导致的RNA降解过程中,RNA降解系统识别侵入细胞内的病毒基因组并将其与转基因RNA一起降解。RMVR具有抗病程度高(近乎免疫)、抗性持久、生物安全性高等优点。在基因沉默的研究中已发现“位置效应”的存在,siRNA的有效性可能受到靶序列所处的位置影响。在RNA介导的植物病毒抗性研究中,目前尚未见有关“位置效应”的系统报道。本研究以马铃薯Y病毒外壳蛋白为靶基因分别以hpRNA和人工的miRNA两种方式构建RNA干扰的植物表达载体,系统性的比较PVY CP基因不同区段对RNA介导的病毒抗性的影响,为寻找引发基因沉默的有效片段及更好利用RMVR培育抗病毒转基因植物提供了依据。研究结果和主要结论如下:(1)马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA介导的病毒抗性的影响将PVY CP基因人工的划分为16段各50bp的区段。通过PCR扩增,得到相应的不同区段的正向和反向的片段,通过酶切连入植物表达载体pROKⅡ中;热激法转化大肠杆菌DH5α,筛选并获得hpRNA结构的植物表达载体pROK CPs(pROK CP9~pROK CP16)。用成功构建的16个植物表达载体(另外8个为吴斌构建)瞬时侵染本生烟验证其有效性,Northern Blot结果显示,16个植物表达载体均能在植物体内成功表达产生siRNA,且瞬时表达的siRNA能有效地下调靶基因PVY CP的表达。将构建的8个植物表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测确定转基因植株。T0代转基因植株自交,种子置于含卡那霉素的筛选培养基上进行筛选,共得到的pROK CP9~pROK CP16各50株、62株、56株、55株、45株、63株、72株和55株T1代转基因植株。抗病性分析发现除了转基因株系pROK CP1、pROK CP2、pROK CP3、pROK CP4未获得抗性植株外,其余12个转基因株系中抗性植株的比例分别为27.15%、6.27%、67.65%、70.83%、66.01%、61.34%、66.04%、23.59%、11.11%、55.56%、77.78%和67.25%。结果表明在利用hpRNA介导的抗PVY病毒的研究中,以PVY CP基因上的50bp序列为茎足以介导宿主植株的基因沉默的产生,但由于hpRNA靶位置的差异产生不同的抗病效率,靶向于3′端nt701~nt750区段表现最高水平的抗性;且以CP基因3′端为靶序列的hpRNA转基因植株比以5′端为靶序列的植株更能有效地介导对PVY的抗性。转基因植株的Northern杂交分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,抗性与RNA积累量呈负相关,证实病毒抗性是由RNA介导的;对转基因植株的siRNA表达量的分析,表明植株对病毒的敏感程度与siRNA积累量之间没有明显的相关性。对T2代的转基因植株的抗病性分析结果发现,几乎所有的抗性转基因植株的后代均表现很强的抗病毒侵染能力,说明由hpRNA介导的PVY抗性在T2代植株中能够稳定遗传。(2)马铃薯Y病毒CP基因不同区段对人工的miRNA介导的病毒抗性的影响以PVY CP基因的全长cDNA序列为靶基因,根据miRNA的特征选取8个不同的位置,M1(nt96~nt115)、M2(nt140~nt159)、M3(nt322~nt341)、M4(nt380~nt399)、M5(nt475~nt494)、M6(nt567~nt586)、M7(nt679~nt698)和M8(nt735~nt754)为amiRNA的靶区。选用拟南芥miR319a前体作为amiRNA表达的骨架,通过PCR扩增的方式替代掉原有的pre miR319a中具有生物学功能的miRNA和miRNA*,得到含有amiRNA和amiRNA*的DNA片段。将扩增产物连入植物表达载体pROKⅡ中。热激法转化大肠杆菌DH5α,筛选并获得重组表达载体pROK amiRcp1~pROK amiRcp8。用构建的amiRNA表达载体瞬时侵染本生烟,Northern Blot验证其有效性,结果显示,8个amiRNA植物表达载体均能在植物体内成功表达amiRNA,且瞬时表达的amiRNA能有效地下调靶PVY CP基因的表达。将成功构建的amiRNA表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89。再生植株经卡那霉素抗性筛选和PCR检测确定为转基因植株。T0代自交后,经卡那霉素筛选和PCR鉴定,分别获得pROK amiRcp1~pROK amiRcp8的T1代转基因植株98株、96株、114株、116株、117株、111株、110株和116株。抗病性结果显示,表达靶向于马铃薯Y病毒CP基因的amiRNA转基因植株能介导对马铃薯Y病毒的抗性,抗性比例分别为37.68%、50.29%、53.76%、37.75%、29.86%、17.05%、26.27%、64.69%。针对马铃薯Y病毒CP基因不同区段设计的amiRcps其转基因植株所介导的抗病性效果之间存在差异,靶向于3′端的amiRcp 8(nt735~nt754)能表现更高水平的抗性。转基因植株的Northern杂交分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,且植株的抗性与转基因的表达量成负相关,表明amiRNA介导的病毒抗性是由RNA介导的。对转基因植株的amiRNA的Northern Blot分析,结果显示,所有抗病转基因植株中都有amiRNA存在,且植株的抗性与amiRNA的表达量成正相关。对T2代的转基因植株的抗病性分析结果发现,所有的抗性转基因植株的后代都表现高的抗病率,表明由amiRNA介导的PVY抗性在T2代植株中能够稳定遗传。
陈伟[4]2008年在《dsRNA介导的沉默抑制子抗马铃薯Y病毒病的研究》文中认为本研究首先对采自安徽不同地区的感染马铃薯Y病毒(PVY)的烟草和马铃薯病样进行病毒株系的分子鉴定。再利用dsRNA技术,构建HC-Pro基因部分片段反向重复载体转化烟草,沉默外源侵染寄主的PVY沉默抑制子HC-Pro基因,在RNA水平上将HC-Pro基因的mRNA降解,使其不能表达发挥作用,从而提高转基因烟草的抗病毒RNA沉默效率。HC-Pro反向重复表达载体以农杆菌介导转化烟草,以获得能够稳定遗传的高抗或免疫PVY的转基因烟草。1.来自安徽不同寄主PVY分离物的血清学鉴定及其CP基因分子进化分析采集安徽不同地区感染马铃薯Y病毒(PVY)的烟草、马铃薯和番茄病样,部分病样的ELISA检测结果呈阳性。RT-PCR克隆4号样和7号样PVY的CP基因并测序。结果表明,来自烟草PVY的CP基因(PVY-CP-4)和来自马铃薯PVY的CP基因(PVY-CP-7)序列全长均为801 nts,编码267个氨基酸。构建PVY CP基因系统关系树及进行序列相似性比较,PVY-CP-4与PVY~O、PVY~(N:O)聚成一个分支,且与PVY~O(EF026074)的序列相似性最高,达99.4%,说明来源于安徽合肥烟草上的PVY应该属于PVY~O株系;而PVY-CP-7与PVY~N、PVY~(NTN)聚成另一分支,且与PVY~(NTN)(AJ890347)、PVY~(NTN)(EF026075)和PVY~(NTN)(AJ585342)的序列相似性最高,达98.3%,推测来源于安徽五河马铃薯上的PVY-CP-7可能属于PVY~(NTN)株系。2.侵染烟草的马铃薯Y病毒(PVY)HC-Pro基因的克隆及序列分析根据ELISA的检测结果,选择阳性反应强烈的4号样(烟草),RT-PCR克隆PVY HC—Pro基因并测序。结果表明,来自烟草PVY的HC-Pro基因(HC-Pro-4)全长1359 bp,编码453个氨基酸,与PVY~N(AM268435)HC-Pro基因的核苷酸序列相似性最高,达99.0%。构建PVY HC-Pro-4与其它14个PVYHC-Pro基因的系统关系树,可以看出PVY HC-Pro-4与PVY~N(AM268435)的亲缘关系最近。HC-Pro基因的克隆为进一步研究抗病毒基因工程奠定了基础。3.马铃薯Y病毒部分辅助成分蛋白基因的反向重复植物表达载体构建根据PVY HC-Pro-4(AM905427)的核苷酸序列设计特异性引物,分别克隆正反向ΔHC-Pro基因片段。先将反向片段ΔHC-Pro(i)插入含内含子的载体pSK-In,获得中间载体pSK-In-ΔHC-Pro(i)。再将In-ΔHC-Pro(i)从pSK上切下,插入表达载体pBI121上,获得重组质柆pBI-In-ΔHC-Pro(i)。最后将正向片段ΔHC-Pro(r)插入pBI-In-ΔHC-Pro(i),得到含ΔHC-Pro反向重复的植物表达载体pBI-ΔHC-Pro(r)-In-ΔHC-Pro(i)。4.反向重复表达载体以农杆菌介导转化烟草利用叁亲交配法将反向重复表达载体pBI-ΔHC-Pro(r)-In-ΔHC-Pro(i)导入农杆菌EHA105菌株中,采用叶盘法分别转化本氏烟和普通烟品种云烟85。
林超[5]2016年在《抗RBSDV转基因水稻田间生物学调查及分子特征分析》文中研究说明水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)是一种以灰飞虱为主要传播介体,在我国主要水稻种植区广泛流行的水稻病毒病。该病害常规方法难以有效防治,危害程度逐年加重,造成水稻的减产甚至绝产,给我国水稻生产造成了重大的经济损失。RNA介导病毒抗性是目前培育抗病毒转基因作物最有效、快捷的方法,转基因植株具有抗性强、抗病持久性强、生物安全性高等特点,具有重大应用价值。本研究以实验室转育获得的抗水稻黑条矮缩病转基因水稻KRBSDV为实验材料,以受体镇稻88为对照,对水稻的农艺性状、除草剂抗性、病毒抗性、种子营养成分等生物学特性进行了检测;进而对外源基因的整合、转基因水稻与野生型之间在RNA和蛋白水平表达差异等分子生物学特性进行了分析;同时,从食品安全角度对转基因水稻安全性进行了评估。主要的研究结果和结论如下:(1)转基因水稻的农艺性状、抗性及种营养成分分析农艺性状调查及抗性鉴定的结果显示,转基因水稻KRBSDV在生长各个时期,植株表型与镇稻88在形态上无明显差异,转基因水稻表现出良好的对PPT和RBSDV的抗性;种子营养成分析显示,转基因水稻种子中的水分、灰分、维生素含量、矿物质含量、蛋白质含量、植酸含量及胰蛋白酶抑制剂含量等与野生型水稻差异不显着。上述结果表明,转入的发夹RNA(hpRNA)结构的RBSDV-CPM基因能够有效地干扰RBSDV的侵染,同时转基因水稻的表型性状并未受到插入基因的明显影响。(2)Southern杂交表明,转基因植株中外源基因为单拷贝,且只有一个插入位点。利用hiTAIL-PCR技术测定了转基因插入位点两侧序列,最终确认插入位点为水稻二号染色体93244至94002bp区间,并伴随着24个核苷酸缺失的现象。该插入位点位于两个基因之间,这两个基因均为编码假定蛋白的基因。(3)提取分蘖期水稻叶片mRNA,利用RNA-seq进行测序分析。统计结果显示,KRBSDV与镇稻88叶片mRNA表达共有6869条具有显着差异(P<0.05);两者间表达显着差异mRNA表达分布在全部12对染色体上,插入位点附近及水稻二号染色体上的差异表达显着的m RNA数量,相对其他染色体并无明显增多。转基因水稻中,选择标记基因bar基因的相对表达量为10215,目的基因RBSDV-CPM基因的相对表达量为6531,在野生型水稻中未检测到bar基因和RBSDV-CPM基因的表达。分析表达差异显着的mRNA,发现其主要涉及转运、转录翻译调控、蛋白结合转录、结合蛋白、结构分子活性等多种不同种类的蛋白,如核糖体、ATP转运合成相关蛋白、伴侣蛋白、热敏蛋白、组蛋白等。(4)对KRBSDV转基因水稻和镇稻88种子蛋白质进行SWATH分析,共标记蛋白1887种,其中346个蛋白表现出显着差异,其中20s、40s、60s核糖体蛋白、ATP转运合成相关蛋白、几种伴侣蛋白、谷蛋白、组蛋白和几种病原菌诱导防御反应蛋白以及热敏蛋白含量与野生型间差异尤为显着。选择标记基因bar基因表达的PPT乙酰转移酶(Phosphinothricin N-acetyltransferase,PAT)在种子中能够检测出,但相对表达量不高;未检测到目的基因片段RBSDV-CPM的表达。对表达差异显着的蛋白进行整体分析,发现根据功能划分蛋白比例与测定到的整体功能蛋白比例接近。在NCBI检索显着差异蛋白序列,利用过敏原筛查数据库The allergen Online Database对序列进行筛查,未发现转基因水稻中产生新的致敏性蛋白和毒性蛋白。综合以上结果,转基因水稻中外源基因的表达赋予水稻对除草剂PPT抗性,显着地提高了水稻对RBSDV的抗性,但转基因植株的农艺性状及种子的营养成分与野生型水稻无显着差异;外源基因的插入虽引起部分水稻基因在RNA水平和蛋白水平的差异表达,但未发现毒性蛋白和新的过敏原蛋白的产生,表明转基因水稻具有良好的食品安全性。
参考文献：
[1]. 核基质结合区对马铃薯Y病毒非翻译CP基因及反向重复片段介导抗病性的影响[D]. 迟胜起. 山东农业大学. 2004
[2]. 核基质结合区对马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因介导抗病性的影响[J]. 迟胜起, 宋云枝, 朱常香, 郑成超, 刘晓玲. 植物病理学报. 2005
[3]. 马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA和人工的miRNA介导的病毒抗性的影响[D]. 姜芳. 山东农业大学. 2011
[4]. dsRNA介导的沉默抑制子抗马铃薯Y病毒病的研究[D]. 陈伟. 安徽农业大学. 2008
[5]. 抗RBSDV转基因水稻田间生物学调查及分子特征分析[D]. 林超. 山东农业大学. 2016