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禽腺病毒血清4型重组株的构建及生物学特性研究

2020-12-10阅读(278)

禽腺病毒血清4型重组株的构建及生物学特性研究

论文摘要

肝炎-心包积水综合征（Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS）是由禽腺病毒血清4型（Fowl adenovirus 4,FAdV-4）引起的以肝炎、心包积水为特征的疾病。自2015年以来,HHS在我国大面积流行,给我国养禽业造成了严重的经济损失。然而关于FAdV-4的毒力基因则研究较少。为探讨ORF17基因对FAdV-4复制和毒力的影响,本研究以FAdV-4流行毒株HN/15102株为亲本病毒,采用同源重组技术构建ORF17基因缺失的重组病毒。首先将表达EGFP的pΔORF17-EGFP转染已感染HN/151025的鸡肝癌细胞（LMH）,构建重组病毒rHN-ΔORF17-EGFP。再将EGFP表达盒去除,经蚀斑反向筛选获得rHN-ΔORF17。将rHN-ΔORF17在LMH细胞上连续传代20代,每5代进行PCR检测,结果表明rHN-ΔORF17遗传稳定。生长动力学曲线测定结果表明2株重组病毒与亲本病毒的生长动力学趋势基本一致,均在接种后96 h病毒滴度达到高峰。rHN-ΔORF17与亲本病毒HN/151025病毒滴度相近,分别为2.22×108PFU/mL和4.26×108PFU/mL,表明ORF17基因缺失不影响病毒复制能力;而rHN-ΔORF17-EGFP滴度显著下降（1.53×106PFU/mL）与亲本病毒HN/151025差异显著（P<0.05）。中国分离株FAdV-4与加拿大ON1弱毒株相比,基因组3′端缺失1966-bp序列（ORF19和ORF27）,为了解该自然缺失对病毒毒力的影响,本研究以基因组3′端35430-35431位点自然缺失1966-bp序列的HN/151025为亲本病毒,构建表达EGFP的重组病毒rHN-Δ35430-EGFP。然后将1966-bp序列替换EGFP表达盒,构建补足ON1株来源的1966-bp序列的重组病毒rHN-Δ35430-ON1。rHN-Δ35430-ON1在LMH细胞上连续传代20代,每5代进行PCR检测,结果表明rHN-Δ35430-ON1遗传稳定。重组病毒生长动力学曲线测定结果表明2株重组病毒与亲本病毒的复制动力学趋势基本一致,均在接种后96 h病毒滴度达到高峰。rHN-Δ35430-EGFP滴度为6.8×107PFU/mL,rHN-Δ35430-ON1滴度（2.66×108PFU/mL）与亲本病毒HN/151025（4.26×108 PFU/mL）相近,说明插入1966-bp序列不影响病毒复制。对rHN-ΔORF17和rHN-Δ35430-ON1进行致病性评价。将40只28日龄SPF鸡随机分成4组,其中3组分别用rHN-ΔORF17、rHN-Δ35430-ON1和HN/151025通过滴鼻点眼途径进行攻毒,攻毒剂量为0.1 mL 8×105 PFU,对照组为等体积无菌PBS,攻毒后观察鸡只症状。攻毒后第3 d,rHN-ΔORF17和HN/151025组鸡只开始出现临床症状,rHN-Δ35430-ON1组鸡只于攻毒后第4 d出现临床症状,发病鸡只表现为精神沉郁、缩脖、羽毛蓬乱、喜卧嗜睡等;攻毒组发病率均为100%,发病高峰期均在攻毒后第46 d,攻毒后第14 d各组鸡只逐渐开始康复。攻毒组中,HN/151025组死亡率为10%,rHN-ΔORF17组死亡率为20%,rHN-Δ35430-ON1组死亡率为10%,对照组为0。对死亡鸡只进行病理剖检,攻毒组均表现心包积液、肝脏黄色坏死灶、肾肿大,无明显差异。免疫组化攻毒组肝脏均检测到抗原。攻毒后第428 d,每4 d采集咽肛拭子和血清抗体。咽肛拭子排毒检测中,3组攻毒组鸡只均在第420 d检测到100%排毒,第24 d排毒下降,3组表现一致。血清抗体检测中,整体抗体水平无差异,仅在抗体阳转率存在差异。HN/151025组阳转率最高达88.9%,rHN-ΔORF17组阳转率最高为50%,rHN-Δ35430-ON1阳转率最高为33.3%。在第32 d进行第2次攻毒,3组均无明显临床症状。抗体阳转率也无明显差异。咽肛拭子排毒,第427d排毒率100%,第3455 d下降后上升,在第62 d排毒率达100%,3组表现一致,无明显差异,且均排毒反复,排毒期长。上述结果表明,2株重组病毒对鸡的致病性与亲本病毒差异不显著。综上,ORF17基因缺失和插入自然缺失1966-bp序列对病毒复制和致病性均无影响。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 引言
  •   1.1 禽腺病毒引起的相关疾病
  •   1.2 禽腺病毒
  •     1.2.1 禽腺病毒分类
  •     1.2.2 禽腺病毒生物学特性
  •     1.2.3 禽腺病毒基因组结构和功能
  •     1.2.4 禽腺病毒毒力相关基因
  •     1.2.5 禽腺病毒诊断方法
  •     1.2.6 禽腺病毒防控
  •   1.3 重组禽腺病毒研究进展
  •     1.3.1 重组病毒构建方法
  •     1.3.2 重组禽腺病毒研究进展
  •     1.3.3 报告基因选择
  •   1.4 研究目的及意义
  • 第二章 重组病毒rHN-ΔORF17的构建及鉴定
  •   2.1 材料与仪器
  •     2.1.1 毒株、细胞和质粒
  •     2.1.2 主要试剂
  •     2.1.3 主要试剂配制
  •     2.1.4 主要仪器
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 转移载体pΔORF17-EGFP的构建及鉴定
  •     2.2.2 重组病毒rHN-ΔORF17-EGFP的构建及鉴定
  •     2.2.3 转移载体pΔORF17的构建及鉴定
  •     2.2.4 重组病毒rHN-ΔORF17的构建及鉴定
  •     2.2.5 重组病毒rHN-ΔORF17遗传稳定性评价
  •     2.2.6 重组病毒rHN-ΔORF17-EGFP和rHN-ΔORF17生长动力学曲线
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 转移载体pΔORF17-EGFP的构建
  •     2.3.2 重组病毒rHN-ΔORF17-EGFP的构建及鉴定
  •     2.3.3 转移载体pΔORF17的构建
  •     2.3.4 重组病毒rHN-ΔORF17的构建及鉴定
  •     2.3.5 重组病毒rHN-ΔORF17遗传稳定性评价
  •     2.3.6 重组病毒rHN-ΔORF17-EGFP和rHN-ΔORF17的生长动力学曲线
  •   2.4 讨论
  • 第三章 重组病毒rHN-Δ35430-ON1的构建及鉴定
  •   3.1 材料与仪器
  •     3.1.1 毒株、细胞和质粒
  •     3.1.2 主要试剂
  •     3.1.3 主要试剂配制
  •     3.1.4 主要仪器
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 转移载体pΔ35430-EGFP的构建及鉴定
  •     3.2.2 重组病毒rHN-Δ35430-EGFP的构建及鉴定
  •     3.2.3 转移载体pΔ35430-ON1的构建及鉴定
  •     3.2.4 重组病毒rHN-Δ35430-ON1的构建及鉴定
  •     3.2.5 重组病毒rHN-Δ35430-ON1遗传稳定性评价
  •     3.2.6 重组病毒rHN-Δ35430-EGFP和rHN-Δ35430-ON1生长动力学曲线
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 转移载体pΔ35430-EGFP的构建及鉴定
  •     3.3.2 重组病毒rHN-Δ35430-EGFP的构建及鉴定
  •     3.3.3 转移载体pΔ35430-ON1的构建及鉴定
  •     3.3.4 重组病毒rHN-Δ35430-ON1的构建及鉴定
  •     3.3.5 重组病毒rHN-Δ35430-ON1遗传稳定性评价
  •     3.3.6 重组病毒rHN-Δ35430-EGFP和rHN-Δ35430-ON1生长动力学曲线
  •   3.4 讨论
  • 第四章 重组病毒致病性评价
  •   4.1 材料与仪器
  •     4.1.1 毒株、细胞及实验动物
  •     4.1.2 主要试剂
  •     4.1.3 试剂配制
  •     4.1.4 仪器
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 病毒滴度测定
  •     4.2.2 动物实验分组
  •     4.2.3 样品采集
  •     4.2.4 病理组织和免疫组化
  •     4.2.5 血清抗体检测
  •     4.2.6 排毒检测
  •     4.2.7 二次攻毒及抗体和排毒检测
  •   4.3 实验结果
  •     4.3.1 病毒滴度
  •     4.3.2 临床症状
  •     4.3.3 病理观察
  •     4.3.4 免疫组化
  •     4.3.5 抗体检测和咽肛拭子排毒情况
  •     4.3.6 二次攻毒后抗体和咽肛拭子排毒
  •   4.4 讨论
  • 第五章 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 柴冬华

    导师: 李慧昕

    关键词: 禽腺病毒,血清型,基因缺失,自然缺失,重组病毒

    来源: 中国农业科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国农业科学院

    基金: 重点研发计划课题“畜禽重要疫病流行病学数据库和传播风险评估模型构建”课题(2017YFD0500105),国家青年基金项目“血清4型禽腺病毒3′端135-bp自然缺失影响病毒致病性的研究”(31702268)

    分类号: S852.65

    总页数: 71

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