猪脑心肌炎病毒VR-129B株VP2重组蛋白的构建表达及其免疫活性分析

猪脑心肌炎病毒VR-129B株VP2重组蛋白的构建表达及其免疫活性分析

论文摘要

为获得大量猪脑心肌炎VP2基因及蛋白研究的细胞模型,构建pDC315-EMCV-VP2真核表达载体,且将其转染到293T细胞,筛选出阳性质粒进行克隆。EMCV VR-129B株VP2基因序列参照GenBank(登录号:X74312),利用RT—PCR方法扩增VP2的全基因序列,将其与质粒pDC315经NheI和XhoI双酶切后连接,构建pDC315-EMCV-VP2重组表达质粒,并将其转染至293T细胞。使用荧光定量PCR方法观察pDC315-EMCV-VP2真核表达载体在细胞中的表达情况。双酶切PCR结果获得大小为780 bp的基因片段,测序结果显示与GenBank上已经公布的同名基因(登录号:X74312)序列片段同源性为100%,重组质粒构建成功。实时荧光定量PCR(QPCR)结果显示,重组质粒转染组与空质粒组之间相比,EMCV-VP2基因的表达量显著上调(P<0.001);在荧光显微镜下观察转染细胞,转染成功部分出现较亮绿色荧光,EMCV-VP2基因表达稳定。从转染细胞中提取重组蛋白与EMCV阳性血清和阴性血清进行ELisa反应,具有较好免疫活性。

论文目录

  • 1 材料
  •   1.1 生物材料
  •   1.2 主要试剂
  •   1.3 仪器
  • 2 方法
  •   2.1 引物设计
  •   2.2 VP2蛋白基因的RT-PCR扩增及序列分析
  •   2.3 重组质粒pDC315-EMCV-VP2的构建
  •   2.4 pDC315-EMCV-VP2真核表达载体的酶切及序列测定
  •   2.5 重组质粒pDC315-EMCV-VP2的细胞转染
  •     2.5.1 细胞培养
  •     2.5.2 转染
  •   2.6 pDC315- EMCV-VP2表达检测
  •   2.7 Elisa实验鉴定重组蛋白的免疫活性
  • 3 结果
  •   3.1 EMCV-VP2基因PCR扩增
  •   3.2 重组质粒pDC315- EMCV-VP2双酶切鉴定及序列分析
  •   3.3 293T细胞瞬时转染
  •   3.4 重组质粒pDC315- EMCV-VP2的Q- PCR结果
  •   3.5 Elisa实验鉴定重组蛋白的免疫活性
  • 4 结论
  • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 吴云,赵月,吴庆荣,陈柯君,张俊辉,万华印,李茹冰,李健

    关键词: 脑心肌炎病毒,重组质粒,转染,免疫活性

    来源: 科学技术与工程 2019年34期

    年度: 2019

    分类: 工程科技Ⅱ辑,基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 广东药科大学药学院,中国科学院大学深圳医院,中国人民解放军南部战区总医院药剂科,广州市众为生物技术有限公司

    基金: 国家军队后勤科研项目(CGZ16C009),广州市科技计划(201704020173),深圳市光明区卫生计生局中医药科研项目(2019A01)资助

    分类号: S852.651

    页码: 116-122

    总页数: 7

    文件大小: 2466K

    下载量: 42

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