PRRSV诱导应激颗粒形成的机制研究

论文摘要

在热休克、饥饿、氧化应激、紫外线照射、缺氧或病毒感染等环境压力下,真核细胞的翻译被抑制,从而使mRNA（messenger RNA）和相关蛋白聚集形成一种无膜动态结构,这种结构被称为应激颗粒（Stress granules,SGs）。应激颗粒的主要功能是存储处于压力条件下细胞的mRNA,并保护其不被降解。应激颗粒的组成成分非常复杂,在不同压力条件下存在差异,且可能包含很多信号通路中的关键蛋白。因此,应激颗粒能参与多种信号通路的调控,进而影响很多疾病的发生及发展,例如肿瘤、神经退行性疾病、病毒感染等。G3BP1（RAS GTPase-activating protein SH3domain-binding protein 1）是应激颗粒的成核蛋白之一,也被证实是一种新型抗病毒因子,能够拮抗多种病毒的增殖。猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是目前影响全球养猪业发展的重要疾病之一。因此,本文针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）开展了其调控应激颗粒形成的分子机制研究,发现PRRSV通过激活PERK（PKR-like endoplasmic reticulum kinase）诱导经典应激颗粒的形成,且利用自身编码的N蛋白上调G3BP1的磷酸化水平,进而逃避G3BP1的抗病毒作用。主要研究内容如下:1.PRRSV感染诱导经典应激颗粒的形成为了检测PRRSV感染是否诱导应激颗粒的形成,首先以应激颗粒的关键成核蛋白TIA1（T cell-restricted intracellular antigen 1）和G3BP1作为标志蛋白,通过间接免疫荧光实验检测病毒感染后不同时间点TIA1和G3BP1的聚集情况。结果显示,在病毒感染细胞中,TIA1和G3BP1均聚集成点状颗粒分散于细胞质中,且TIA1与G3BP1在PRRSV感染细胞中存在共定位,提示PRRSV感染诱导应激颗粒的形成。为了检测该颗粒是否是经典的应激颗粒,进一步检测了经典应激颗粒的标志蛋白翻译起始因子3η（eukaryotic initiation factor 3,eIF3η）在细胞中的定位。结果发现,在感染后期,eIF3η与G3BP1之间存在共定位,说明PRRSV诱导经典应激颗粒的形成;然而紫外灭活的PRRSV不能诱导应激颗粒的形成,表明PRRSV诱导应激颗粒的形成依赖于其正常复制。2.PRRSV通过PERK诱导应激颗粒的形成为了进一步分析PRRSV诱导应激颗粒可能的信号通路,通过Western blot实验发现,PRRSV感染上调eIF2α的磷酸化水平,推测PRRSV诱导应激颗粒形成依赖于eIF2α的磷酸化。eIF2α上游存在四种激酶,分别为PKR（protein kinase RNA-dependent kinase）、HRI（heme-regulated initiation factor 2αkinase）、GCN2（general control non-derepressible 2）及PERK。为了确定在PRRSV感染细胞中诱导eIF2α磷酸化的激酶,首先利用PKR特异性抑制剂C16及2-AP（2-aminopurine）处理细胞,发现C16及2-AP均不能抑制PRRSV诱导应激颗粒的形成;而用PERK抑制剂PERK-I（516535 PERK Inhibitor I,GSK2606414）处理细胞能显著降低PRRSV诱导应激颗粒的数量;另外,考虑到没有针对GCN2及HRI的特异性抑制剂,通过转染GCN2和HRI相应的siRNAs,发现干扰GCN2和HRI均不影响PRRSV诱导应激颗粒的聚集。以上结果说明PRRSV诱导应激颗粒的形成不依赖于PKR、GCN2及HRI,而是通过PERK途径。Western blot实验结果显示,只有PERK-I能抑制PRRSV上调的eIF2α磷酸化水平,而抑制PKR、干扰GCN2或HRI均对PRRSV诱导的eIF2α磷酸化水平无显著影响,进一步证实PRRSV诱导应激颗粒的形成依赖于PERK。3.应激颗粒及其组成成分G3BP1轻微抑制PRRSV增殖以前的研究证实同时干扰TIA1、G3BP1及TIAR（TIA1-related protein）的表达能显著抑制亚砷酸钠诱导应激颗粒产生。为了探讨应激颗粒形成对PRRSV增殖的影响,通过特异性siRNA同时干扰细胞的TIA1、TIAR及G3BP1,发现抑制应激颗粒形成只能轻微促进PRRSV增殖,但显著上调PRRSV诱导炎症因子的产生。应激颗粒的组成成分G3BP1被认为是一个新型抗病毒因子,但超表达或稳定表达G3BP1均只能轻微抑制PRRSV增殖。以上结果表明,应激颗粒及其组成成分G3BP1仅能轻微抑制PRRSV增殖,提示PRRSV可能拮抗应激颗粒及G3BP1的抗病毒作用。4.PRRSV N蛋白上调G3BP1的磷酸化水平,从而逃避其抗病毒作用本实验室前期通过PRRSV感染细胞的磷酸化蛋白质组学数据分析发现,PRRSV能上调G3BP1的磷酸化水平,本研究通过Western blot实验进一步证实了组学结果。为了检测G3BP1磷酸化修饰对PRRSV感染的影响,将其149及231位丝氨酸（S）残基突变为丙氨酸（A）或谷氨酸（E）,分别模拟其去磷酸化（S149A/S231A）及磷酸化（S149E/S231E）状态。结果发现,S149A/S231A突变体抑制PRRSV增殖的能力较G3BP1野生型增强,而S149E/S231E突变体对PRRSV增殖无显著影响,提示PRRSV可能通过上调G3BP1的磷酸化水平,逃避G3BP1的抗病毒作用,但PRRSV通过哪种编码蛋白逃避G3BP1的抗病毒作用尚不清楚。从以前关于PRRSV N蛋白与宿主细胞蛋白相互作用组学的数据库中发现,N蛋白与G3BP1之间存在潜在的相互作用。本研究进一步通过Co-IP实验证实,在PRRSV感染或者N蛋白超表达条件下,G3BP1与N蛋白存在相互作用,且发现PRRSV N蛋白显著上调G3BP1的磷酸化水平。以上结果表明,PRRSV可能通过N蛋白上调G3BP1的磷酸化水平,从而拮抗G3BP1的抗病毒作用。总之,本研究对PRRSV感染细胞后的应激颗粒形成机制进行了研究,发现PRRSV感染细胞后应激颗粒标志蛋白TIA1、G3BP1、eIF3η在细胞质中聚集成点状颗粒,且存在共定位,表明PRRSV诱导经典应激颗粒的形成;随后发现PRRSV通过PERK上调eIF2α的磷酸化水平,诱导应激颗粒的形成;然而应激颗粒及其组成成分G3BP1仅能轻微抑制PRRSV增殖,进一步研究发现PRRSV能通过N蛋白上调G3BP1的磷酸化水平,从而拮抗G3BP1的抗病毒作用。

论文目录

文章来源

类型: 博士论文

作者: 周艳荣

导师: 肖少波

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒,应激颗粒,蛋白,抗病毒作用,磷酸化修饰

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000109

总页数: 101

文件大小: 5802K

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