贾筱琴[1]2004年在《TRAIL分子胞外段克隆表达及其凋亡效应的初步研究》文中研究表明TRAIL为Ⅱ型跨膜蛋白，属于TNF家族分子。它可诱导某些敏感细胞的凋亡，包括肿瘤细胞与转化细胞。尽管TRAIL与其它TNF家族分子如TNF-α、FasL等在结构上存在同源性，但功能上却有很大差异，主要表现在它选择性诱导多种肿瘤细胞的凋亡却保护大多数正常细胞免于受损，突破了TNF-α、FasL等分子在体内应用的局限性。 本研究构建人TRAILcDNA的真核表达载体，对TRAIL分子的凋亡效应进行初步研究。 通过高保真聚合酶链式反应(PCR)方法扩增带有人TRAIL114～281aa的基因片段。随即将目的片段连入pGEX-6p-1，经过酶切与测序证实扩增得到的DNA的正确性。重组表达载体pGEX-6p-1-TRAIL在大肠杆菌表达系统中进行IPTG诱导表达，将表达产物免疫小鼠，制备多克隆抗血清。将经过DNA序列测定后的人TRAILcDNA克隆进真核表达载体pcDNA3，真核重组表达载体pcDNA3-TRAIL经脂质体介导转染CHO细胞，间接免疫荧光检测到人TRAIL在CHO细胞中的表达。采用MTT法和Annexin V-FITC法及流式细胞仪技术测定重组TRAIL对7402肝癌细胞的抑制活性。将7402肝癌组织移植于裸鼠皮下，建立裸鼠皮下肿瘤模型，构建了真核表达载体pcDNA3-TRAIL，对建立的皮下肿瘤模型进行治疗。 DNA序列测定结果显示：克隆的人TRAILcDNA与文献报道基本一致。SDS-PAGE电泳结果显示，人TRAILcDNA可以在大肠杆菌表达系统中表达。间接免疫荧光显示转染后的CHO细胞的胞浆内有目的蛋白的表达。MTT和流式细胞仪结果显示重组TRAIL在体外可抑制7402肝癌细胞的生长，凋亡率可达31%，治疗结果显示，克隆的人TRAILeDNA可以在小鼠体内表达，达到抑制7402肝癌细胞在裸鼠体内的生长。本研究成功克隆并表达了人TRAIL，可以用来对裸鼠皮下肿瘤模型进行治疗。
田生和, 全家妩[2]2005年在《人TRAIL细胞外段基因在大肠杆菌中的表达及其包涵体的复性》文中研究指明目的 在大肠杆菌中表达人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段 (sTRAIL)基因 ,并研究其包涵体的复性。方法 应用RT- PCR法从正常人外周血单核细胞中获得sTRAIL的编码基因 ,将其克隆到原核表达载体pBV2 2 0 ,于大肠杆菌DH5α中通过温控诱导表达 ;将包涵体进行变性和复性处理后 ,采用离子交换层析纯化表达产物 ,并经Dotblot及MTT试验鉴定。结果 通过温度诱导 ,目的基因主要以包涵体形式高效表达 ,包涵体蛋白经梯度透析法复性可获得具有抗肿瘤活性的重组人sTRAIL。结论 已获得大量纯化重组人sTRAIL ,为开发新型抗肿瘤制剂奠定基础。
参考文献：
[1]. TRAIL分子胞外段克隆表达及其凋亡效应的初步研究[D]. 贾筱琴. 扬州大学. 2004
[2]. 人TRAIL细胞外段基因在大肠杆菌中的表达及其包涵体的复性[J]. 田生和, 全家妩. 中国生物制品学杂志. 2005
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