马铃薯StCRK1和StCRK2亚细胞定位及其互作蛋白的初步筛选

论文摘要

马铃薯是世界第三大主粮作物之一,但其在培育过程中极易受到各种病害的影响,导致产量和品质降低。因此研究马铃薯自身的防御机制,对控制马铃薯病害具有重要的理论和实践意义。类受体激酶（receptor-likekinases,RLK）作为保守的上游信号分子,可调节植物发育和胁迫适应等生物过程。富含半胱氨酸的类受体激酶（cysteine-rich receptor-like kinase,CRK）是一类重要的 RLK,在植物的抗病性和细胞死亡中起重要作用。本研究克隆了马铃薯StCR1和StRK2无终止密码子的CDS序列,利用Gateway系统中的LR反应构建了马铃薯StCRK1/2-GFP表达载体,将表达载体转化农杆菌GV3101通过浸染本氏烟草叶片进行瞬时表达,发现马铃薯StCRK1和StCRK2均定位在质膜上;同时克隆了StCRK和和StCK2中包含近膜和激酶结构域的序列,构建了用于酵母双杂交的诱饵载体;并构建了致病疫霉（Phytophthora infestans）诱导下的马铃薯cDNA文库。利用酵母双杂交技术筛选与StCRK1和StCRK2相互作用的蛋白,经过初步筛选,共获得了 32个与StCRK1互作的阳性克隆,39个与StCRK2互作的阳性克隆。本研究为进一步阐释StCRK1和StCRK2的功能以及研究其在抗病防御反应中的作用提供了理论依据。

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摘要

Abstract

缩略语表

1 引言

1.1 植物类受体激酶

1.2 富含半胱氨酸的植物类受体激酶

1.3 亚细胞定位

1.4 酵母双杂交

1.5 本研究的目的与意义

2 马铃薯StCRK1/2的亚细胞定位

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.1.1 植物材料

2.1.1.2 试验菌种

2.1.1.3 试剂及载体信息

2.1.1.4 引物序列

2.1.2 方法

2.1.2.1 相关试剂及溶液的配制方法

2.1.2.2 DB3.1大肠杆菌电转化感受态细胞制作方法

2.1.2.3 GV3101农杆菌电转化感受态细胞制作方法

2.1.2.4 BTH处理DM试管苗

2.1.2.5 马铃薯DM试管苗Total RNA的提取

2.1.2.6 除去RNA样品中的基因组DNA

2.1.2.7 反转录成cDNA

2.1.2.8 StCRK1/2无终止密码子的cDNA序列的克隆

2.1.2.9 Gateway入门载体StCRK1/2-L16的构建

2.1.2.10 LR反应将目的片段置换到表达载体pGWB605

2.1.2.11 表达载体StCRK1/2-pGWB605转化农杆菌感受态细胞

2.1.2.12 农杆菌介导转化烟草叶片瞬时表达

2.3 结果与分析

2.3.1 StCRK1/2目的片段的克隆

2.3.2.1 PCR扩增StCRK1/2目的片段

2.3.2.2 StCRK1/2与pEASY-T1克隆载体连接

2.3.2 StCRK1/2测序比对结果

2.3.3 StCRK1/2-pGWB605表达载体构建

2.3.3.1 StCRK1/2-L16入门载体构建

2.3.3.2 利用Gateway重组技术构建表达载体StCRK1/2-pGWB605

2.3.4 农杆菌介导注射本氏烟草叶片瞬时表达

2.4 讨论

3 StCRK1/2互作蛋白的初步筛选

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.1.1 植物材料

3.1.1.2 试验菌种

3.1.1.3 试剂及载体信息

3.1.1.4 引物序列

3.1.2 方法

3.1.2.1 溶液及培养基配制方法

3.1.2.2 Y187/HF7C酵母感受态细胞制作

3.1.2.3 Colony-lift Filter Assay

3.1.2.4 StCRK1/2近膜及胞内激酶结构域（JK）编码序列的克隆

3.1.2.5 StCRK1/2-pMC86诱饵载体构建

3.1.2.6 StCRK1/2-pMC86表达载体转化HF7C感受态细胞

3.1.2.7 StCRK1/2-pMC86诱饵质粒毒性检测及自激活检测

3.1.2.8 均一化cDNA文库的构建

3.1.2.9 酵母双杂交筛选cDNA文库

3.2 结果与分析

3.2.1 StCRK1/2JK编码序列的克隆

3.2.1.1 PCR扩增StCRK1/2JK序列

3.2.1.2 胶回收产物与克隆载体pEASY-T1连接

3.2.2 表达诱饵载体StCRK1/2-pMC86的构建

3.2.3 StCRK1/2诱饵蛋白毒性检测

3.2.4 StCRK1/2诱饵蛋白自激活检测

3.2.5 cDNA文库构建

3.2.5.1 克新一号Total RNA的提取

3.2.5.2 LD-PCR合成cDNA

3.2.5.3 cDNA的均一化处理

3.2.5.4 ds cDNA的合成

3.2.5.5 均一化cDNA文库的构建

3.2.6 StCRK1和StCRK2互作蛋白的初步筛选

3.3 讨论

4 结论

致谢

参考文献

作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王双

导师: 白薇

关键词: 马铃薯,亚细胞定位,酵母双杂交,互作蛋白

来源: 内蒙古农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 内蒙古农业大学

分类号: S532;Q943.2

DOI: 10.27229/d.cnki.gnmnu.2019.000348

总页数: 64

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