芽孢杆菌CDJYB来源角蛋白酶基因克隆、表达及酶学特性研究

论文摘要

角蛋白主要存在于动物的毛发、鳞片、羽毛、蹄、角等部位,由于其分子间富含二硫键以及疏水氨基酸,角蛋白往往难以降解,角蛋白酶可以在较为温和的条件下高效降解角蛋白,使角蛋白得以被绿色环保的利用。角蛋白酶的作用底物广范,在食品、药品、清洁及皮毛加工等领域都有着应用价值。本文利用多序列比对和分子克隆的方法,筛选出了一株芽孢杆菌CDJYB的角蛋白酶（Keratinase）基因,并构建了重组质粒pET-28a-Ker,经诱导纯化得到角蛋白酶,并探究了其酶学性质及其在降解羽毛粉和羽毛中的应用。具体研究内容与结果如下:1.利用多序列比对,设计引物,克隆得到未知芽孢杆菌CDJYB的角蛋白酶基因,构建重组质粒pET-28a-Ker,在Escherichia coli BL21菌株中重组表达角蛋白酶。在最佳诱导温度20℃时,粗酶液中角蛋白酶酶活为389.7 U/mL。2.采用单因素法测定了重组角蛋白酶的最适反应pH为10、最适反应温度为50℃,该酶热稳定较差,在50℃及以上孵育一小时后酶活损失超过80%。Ca2+、Mg2+、Fe2+、Co2+、Ba2+、Cu2+、Zn2+和Fe3+等金属离子对角蛋白酶有着促进作用,其中Cu2+和Co2+对重组酶的促进作用尤其明显。以可溶性角蛋白为底物时,还原剂DTT（DL-Dithiothreitol）和GSH（Glutathione）能部分抑制角蛋白酶活性,表面活性剂也能抑制重组酶,其中SDS（Sodium dodecyl sulfate）的抑制效果超过70%,重组酶被低浓度PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride,0.01%,w/v,mg/mL）强烈抑制,表明该酶是一种典型的丝氨酸蛋白酶,该酶对于磺化角蛋白的动力学参数Vmax和Km分别为62.5μg/（mL·min）和19.56 mg/mL。3.通过重组角蛋白酶降解羽毛粉和羽毛的应用研究发现:在角蛋白酶的作用下,羽毛粉（部分二硫键及其他化学键被破坏）在反应6 h时后,酪氨酸释放量为9.74 mg/g羽毛粉,达到酸法水解效果的39.4%;羽毛降解过程中DTT起着重要的作用,当反应中DTT浓度达到0.25%（w/v）时,其对角蛋白酶降解羽毛的促进效果达到最大(降解产物OD280为0.37),降解效果为不含DTT组(降解产物OD280为0.019)的19.5倍;其次使用脂肪酶和蒸煮预处理羽毛后,都能够加快角蛋白降解羽毛的速度,其中蒸煮法处理后效果显著,但是脂肪酶和蒸煮法混合处理的效果却没有好于单一蒸煮法。电镜扫描图片显示脂肪酶和蒸煮法预处理过后羽毛表面都变得更加粗糙,但经过蒸煮后的羽毛表面显得更加干燥蓬松。

论文目录

摘要

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第1章引言

1.1 角蛋白酶的来源、分类及性质

1.1.1 角蛋白酶的来源

1.1.2 角蛋白酶的分类

1.1.3 角蛋白酶的理化性质

1.2 角蛋白酶的制备

1.2.1 选择合适的表达宿主

1.2.2 角蛋白酶基因的改造

1.2.3 角蛋白酶的分离纯化

1.3 角蛋白酶的作用机制

1.3.1 二硫键的还原

1.3.2 疏水氨基酸的切割

1.4 角蛋白酶的应用

1.4.1 饲料中的应用

1.4.2 药物辅助剂

1.4.3 朊病毒的降解

1.4.4 动物皮毛制造

1.4.5 去垢剂添加剂

1.4.6 食品行业中的应用

1.4.7 在其他方面的应用

1.5 本研究的意义、目的及内容

1.5.1 研究的目的及意义

1.5.2 研究内容

第2章 Bacillus sp中角蛋白酶基因的克隆及重组表达

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 质粒

2.1.3 培养基

2.1.4 主要试剂

2.1.5 主要仪器

2.1.6 主要软件

2.1.7 试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 角蛋白酶基因的获取

2.2.2 全长PCR产物与T载体的连接、转化以及阳性克隆子鉴定

2.2.3 角蛋白酶基因与表达载体p ET-28a的连接、转化以及阳性克隆子鉴定

2.2.4 重组大肠杆菌BL21（p ET-28a-Ker）的诱导表达及SDS-PAGE分析

2.2.5 不同温度条件下的蛋白表达量的SDS-PAGE分析及酶活测定

2.3 结果与讨论

2.3.1 芽孢杆菌CDJYB基因组DNA的提取结果

2.3.2 多序列比对结果以及兼并引物的设计和PCR扩增效果

2.3.3 角蛋白酶基因的扩增

2.3.4 角蛋白酶与T载体的连接、转化及鉴定结果

2.3.5 角蛋白酶与表达载体的连接、转化及鉴定结果

2.3.6 蛋白质标准曲线

2.3.7 重组大肠杆菌BL21（p ET-28a-Ker）产物的SDS-PAGE分析结果

2.3.8 不同温度条件下的蛋白表达SDS-PAGE分析结果

2.3.9 酪氨酸-福林酚反应标准曲线及角蛋白酶酶活测定

2.4 本章小结

第3章重组角蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

3.1 实验材料

3.1.1 菌株

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.1.4 试剂配制

3.2 实验方法

3.2.1 重组角蛋白酶的分离纯化

3.2.2 重组角蛋白酶的酶学性质研究

3.3 结果与讨论

3.3.1 重组角蛋白酶的分离纯化结果

3.3.2 重组角蛋白酶的酶学特性

3.4 本章小结

第4章重组角蛋白酶降解羽毛粉和羽毛的应用

4.1 实验材料

4.1.1 原料

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器

4.1.4 试剂配制

4.2 实验方法

4.2.1 羽毛粉的降解

4.2.2 羽毛的降解

4.3 实验结果

4.3.1 羽毛粉的降解

4.3.2 羽毛的降解

4.4 本章小结

第5章总结与展望

5.1 总结

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 蒋少龙

导师: 蔡俊

关键词: 角蛋白,角蛋白酶,基因工程,分离纯化,酶学特性,羽毛降解

来源: 湖北工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 湖北工业大学

分类号: Q936;Q78

总页数: 78

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