寡孢节丛孢中亲和性cAMP磷酸二酯酶功能的初步研究

论文摘要

磷酸二酯酶（Phosphodiesterases,PDEs）在细胞信号转导过程中发挥重要作用,其能够水解胞内第二信使cAMP（环磷酸腺苷）,从而终止cAMP所参与的信号转导途径的功能。目前,在大多数真菌中报道的磷酸二酯酶家族包含了高亲和性磷酸二酯酶（pde2/pdeH）和低亲和性磷酸二酯酶（pdel/pdeL）,它们在真菌的营养菌丝生长和致病性发育过程中发挥了重要的调控作用。捕食线虫真菌的代表菌株-寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）在饥饿条件下产生三维菌网（three-dimensional networks）作为捕食器官捕捉线虫为自身生长获取营养,但是捕食器官形成的信号调控机制还不清楚。本论文以寡孢节丛孢中与构巢曲霉等丝状真菌同源的高亲和性磷酸二酯酶（AoPdeH,AOL s00083g160）和低亲和性磷酸二酯酶（AoPdeL,AOL s00097g378）为研究对象,对磷酸二酯酶编码基因进行敲除,探究磷酸二酯酶在寡孢节丛孢营养菌丝生长和致病性发育过程中所发挥的功能。主要实验结果:1.磷酸二酯酶的功能结构域和聚类分析对寡孢节丛孢两种磷酸二酯酶的功能结构域分析表明,AoPdeH含有以下的保守结构域和位点:3’5’-环核苷酸磷酸二酯酶超家族结构域（IPR036971）、磷酸二酯酶结构域（IPR003607）、3’5’-环核苷酸磷酸二酯酶催化结构域（IPR002073）和3’5’-环核苷酸磷酸二酯酶保守位点（IPR023174）;AoPdeL也含有多个保守结构域,包括是富含亮氨酸的重复结构域超家族（IPR032675）、核糖核酸酶Z/羟基酰基谷胱甘肽水解酶样（IPR036866）和cAMP磷酸二酯酶结构域（IPR000396）。聚类分析表明,AoPdeH和AoPdeL分别聚类于2个不同进化分支上,由此可以初步推断这两个蛋白在真菌中可能发挥着不同的作用。2.磷酸二酯酶敲除突变株的营养菌丝生长、抗逆性和致病性分析利用同源重组技术对两种磷酸二酯酶编码基因进行敲除,成功获得两种磷酸二酯酶基因的敲除突变株,对突变株的菌丝形态、生长速率、抗逆境胁迫能力、杀线虫能力、胞外蛋白酶活性以及三维菌网形态和数量进行了统计比较。结果发现AoPdeH基因的缺失造成其突变株生长速率显著减慢、气生菌丝出现缺陷、菌丝横膈膜增多且发生膨大变形、对环境压力敏感性增强,除此之外,ΔAoPdeH突变株失去形成成熟三维菌网的能力,杀线虫能力显著降低但并没有完全丧失杀线虫能力,对其发酵液进行蛋白酶活性分析,发现突变株胞外蛋白酶活性没有明显变化。然而,ΔAoPdeL突变株的生长速率、抗逆境胁迫能力与寡孢节丛孢野生型菌株相比没有显著差异,杀线虫能力和产生三维菌网数量有所下降,菌丝形态有膨大变形现象。以上实验结果表明AoPdeH参与了寡孢节从孢的菌丝生长、抗逆性和致病性发育相关的生物学过程的调控。3.磷酸二酯酶参与产孢过程的调控产孢量比较发现,ΔAoPdeH突变株分生孢子产量仅为野生型菌株孢子产量的2～6%,ΔAoPde 突变株的分生孢子产量与野生型菌株相比无显著差异。光学显微镜观察发现,两种磷酸二酯酶基因突变株孢子形态皆发生变形,变得狭长无横膈膜,除此之外ΔAoPdeH突变株分生孢子梗的数量明显少于野生型菌株,且孢子梗上几乎没有孢子着生,ΔAoPdeL突变株分生孢子梗数量及孢子着生方式与寡孢节丛孢野生型菌株相比无明显差异。为进一步探讨磷酸二酯酶对产孢的调控作用,选取13个产孢调控基因在产孢初期（3 days）、产孢中期（5 days）和孢子成熟期（7 days）进行荧光定量PCR分析,结果表明,ΔAoPdeH突变株13个产孢调控基因中FlbA、Acr1、FluG、VelB、NsdD、FlbC、PkaC1、Plp1、AbaA、LreA和LreB的转录水平皆下调,而在分生孢子产量与野生型菌株没有明显差异的ΔAoPdeL突变株中,13个产孢调控基因的转录水平与野生型菌株相比无明显变化。以上实验结果表明AoPdeH参与了寡孢节丛孢的产孢过程的调控。4.磷酸二酯酶参与寡孢节丛孢菌丝内cAMP水平调控通过酶联免疫法测定突变株营养菌丝生长和致病性发育过程中不同时间点的菌丝内cAMP含量,结果表明,在所选取的所有时间点ΔAoPdeH敲除株和ΔAoPdeL敲除株菌丝内cAMP含量均高于寡孢节丛孢野生型菌株。为进一步分析磷酸二酯酶对cAMP水平的调控机制,选取16个磷酸二酯酶上下游的关键基因以及参与调节cAMP含量的相关基因进行荧光定量PCR（RT-PCR）分析,其中cAMP受体样蛋白和cAMP反应原件结合蛋白、腺苷酸环化酶表达量发生了明显变化（在菌丝生长发育期间显著上调,致病性发育期间显著下调）,说明磷酸二酯酶可能通过调控上述基因的表达水平从而参与寡孢节丛孢cAMP含量的调节。本文的创新点:1.首次在寡孢节丛孢中成功敲除了磷酸二酯酶家族的蛋白编码基因,发现AoPdeH参与寡孢节从孢营养菌丝生长、无性产孢、抗逆境胁迫压力、捕食器官形成和菌丝内cAMP含量调节等重要生物学过程的调控。2.通过RT-PCR比较了AoPdeH、AoPdeL、分生孢子发育调控以及cAMP合成等相关基因在ΔAoPdeH突变株、ΔAoPdeL突变株和野生型菌株中不同时间点的转录水平变化,推测磷酸二酯酶参与寡孢节丛孢中分生孢子的发育以及cAMP合成等相关基因的表达调控。

论文目录

摘要

Abstract

第一章食线虫真菌和磷酸二酯酶的研究进展

1 食线虫真菌研究概况

2 捕食线虫真菌研究进展

3 cAMP信号级联研究进展

4 磷酸二酯酶家族功能研究进展

5 本论文选题的依据和研究意义

第二章磷酸二酯酶的功能结构域预测和聚类分析

1 前言

2 材料与方法

2.1 磷酸二酯酶氨基酸序列来源

2.2 磷酸二酯酶功能结构域分析

2.3 寡孢节丛孢磷酸二酯酶系统发育分析

3 结果

3.1 磷酸二酯酶的氨基酸序列和系统发育分析

4 讨论

4.1 寡孢节从孢两种磷酸二酯酶氨基酸序列和结构域的分析

4.2 寡孢节从孢磷酸二酯酶同源性比较分析

第三章磷酸二酯酶编码基因的敲除及转化子验证

1 前言

2 实验材料及仪器

2.1 实验菌株和载体

2.2 主要溶液及培养基

2.3 实验试剂药品

2.4 实验中使用的主要仪器及设备

3 实验方法

3.1 敲除载体构建方法

3.2 敲除引物设计

3.3 寡孢节丛孢基因组DNA提取

3.4 质粒pRS426和pSCN44的提取

3.5 pRS426质粒的双酶切

3.6 目的片段扩增

3.7 制备酵母感受态和电转化

3.8 提取酵母转化子的质粒

3.9 筛选阳性酵母转化子

3.10 扩增并回收敲除载体全长片段

3.11 制备寡孢节从孢的原生质体

3.12 寡孢节从孢原生质体的化转与再生

3.13 寡孢节从孢原生质体转化子基因组提取

3.14 敲除转化子的验证

4 实验结果

4.1 寡孢节从孢两种磷酸二酯酶基因上下游片段和潮霉素片段的扩增

4.2 酵母转化子

4.3 酵母转化子质粒PCR验证

4.4 PCR验证原生质体转化子

4.5 Southern blot验证原生质体转化子

5 讨论

5.1 构建敲除载体的关键点

5.2 寡孢节丛孢原生质体的制备及转化改进之处

5.3 敲除转化子PCR验证

5.4 敲除转化子的Southern blot验证

6 本章小结

第四章磷酸二酯酶基因敲除株与寡孢节从孢野生型菌株的表型特征比较和分析

1 前言

2 实验材料及仪器

2.1 实验菌株

2.2 主要培养基

2.3 主要药品

2.4 主要仪器设备

3 实验方法

3.1 生长速率的比较

3.2 菌丝形态比较

3.3 抗逆性测试

3.4 分生孢子的比较

3.5 捕器形成和杀线虫活性分析

3.6 磷酸二酯酶基因突变株发酵液活性化合物分析

4 实验结果

4.1 磷酸二酯酶基因敲除菌株的生长速率和菌落形态的比较

4.2 磷酸二酯酶突变菌株与野生型菌株的菌丝形态比较

4.3 磷酸二酯酶基因突变菌株的抗逆性测试

4.4 磷酸二酯酶对无性产孢的影响

4.5 磷酸二酯酶基因突变株致病性分析

4.6 磷酸二酯酶基因突变株发酵液活性化合物比较

5 讨论

5.1 营养菌丝生长和菌丝形态的比较

5.2 抗逆性测试

5.3 无性产孢的数量和形态比较

5.4 致病性和胞外蛋白酶活性分析

6 小结

第五章磷酸二酯酶基因敲除株和寡孢节丛孢野生型菌株菌丝内cAMP含量分析

1 前言

2 实验材料及仪器

2.1 实验菌株

2.2 所用培养基

2.3 所用试剂盒

2.4 设备及仪器

3 实验方法

3.1 组织样品的收集与处理

3.2 需要准备的试剂

3.3 实验步骤

4 实验结果

4.1 cAMP含量测定标准曲线

4.2 磷酸二酯酶突变菌株的cAMP含量测定结果

5 讨论

6 小结

第六章磷酸二酯酶编码基因敲除菌株表型相关基因的转录水平分析

1 前言

2 实验材料及仪器

2.1 实验菌株

2.2 所用培养基

2.3 主要药品及试剂盒

2.4 主要仪器及设备

3 实验方法

3.1 提取野生型菌株及磷酸二酯酶基因敲除株的总RNA

3.2 逆转录获取cDNA

3.3 相关基因选取及引物设计

3.4 Real-Time PCR

4 实验结果

4.1 两种磷酸二酯酶在寡孢节丛孢中的表达量分析

4.2 两种磷酸二酯酶在突变株中的表达量分析

4.3 磷酸二酯酶基因敲除株产孢相关基因表达量分析

4.4 磷酸二酯酶基因敲除株cAMP含量调节基因表达量分析

5 讨论

5.1 寡孢节丛孢生长周期内磷酸二酯酶基因的表达量分析

5.2 磷酸二酯酶在突变株中的表达量分析

5.3 产孢相关基因的表达量分析

5.4 cAMP相关基因表达量分析

6 小结

全文小结及存在的问题

参考文献

附录

附录Ⅰ 同源臂序列及潮霉素引物

附录Ⅱ 论文RT-PCR引物序列

附录Ⅲ 论文中使用的质粒图谱

附录Ⅳ 研究生期间所获成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 马妮

导师: 杨金奎

关键词: 寡孢节从孢,信号级联,磷酸二酯酶,基因敲除,捕食器官,转录水平分析

来源: 云南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 云南大学

基金: NSFC-云南联合基金重点项目:捕食线虫真菌形成捕食器官的信号调控机制研究(项目编号:U1402265)

分类号: Q78

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