刘凌凤[1]2003年在《分子信标荧光探针用于核酸连接过程的实时监测及病毒RNA的检测》文中研究说明核酸是生命体系中的关键物质，它承载着传递遗传信息、编码其它相关生物分子的重要任务，在分子生物学和生物技术领域受到广泛关注，是发展非常迅速的研究重点。核酸相关生命功能的完成需要蛋白质(酶)的协同参与。对核酸和相关蛋白的相互作用研究正是以功能基因组和蛋白质组的研究为标志的后基因组时代所关注的热点之一。 核酸的转录、修复和重组是细胞生命周期中的重要过程，由核酸连接酶催化的核酸连接反应是这些过程中不可或缺的步骤，传统的核酸连接分析的研究手段主要是凝胶电泳技术，无法满足实时监测核酸连接过程的要求，限制了人们对于这一作用过程更为具体和根本的机理的深入了解。有关核酸与连接酶作用的实时过程信息的获得将不仅有助于对一些生命过程机理的研究，还将为新药的设计提供新的技术手段，为疾病的治疗找到新的方法。 病毒基因组RNA的快速检测对于由RNA病毒感染的疾病诊断与防治具有重要意义。目前普遍运用的RT-PCR方法对于模板的提纯有较高的要求，于是，发展简便、快速而灵敏的技术用于病毒RNA的检出变得尤为重要。 1996年，Tyagi和Krammer研究出一种新型荧光探针—分子信标。这种探针是在寡聚核苷酸探针的基础上发展起来的一类具有茎—环结构的寡聚核苷酸单链探针，具有高灵敏度、高特异性和背景值极低，无需分离未杂交探针等优点，不仅适用于核酸分析，而且同样也适用于蛋白质(酶)等能与核酸发生相互作用的物质分析，为实时监测蛋白质(酶)与核酸作用的过程提供了极好的技术手段。 本实验室唐志文博士利用分子信标核酸探针，发挥其研究核酸及相关蛋白质(酶)的优势，创新性地开展对核酸连接、核酸磷酸化以及核酸酶切过程的实时监测研究，本论文作为唐志文博士论文工作的一部分，从分子信标实时监测核酸与蛋白质(酶)的作用过程和分子信标快捷地检测病毒RNA两个角度开展研究，发展了基于分子信标的新的检测技术和应用研究体系，可从分子水平上获取生物大分子之间相互作用的动态信息： (1)利用分子信标实时监测了T4 DNA连接酶催化的DNA连接过程，并建立与实现反应体系相应的动力学模型。 建立一了一种新的核酸连接实时监测方法，利用分子信标作为核酸连接反应的DNA模板和检测分子，在核酸分子连接的同时检测荧光信号。首次实时、准确地获取核酸连接过程信息，为核酸连接酶分析、核酸连接动力学过程研究提供全新、有效的手段，也为深入研究核酸连接酶与核酸分子间的相互作用提供了新的思路与技术。一与传统的研究方法相比，该方法避免了放射性同位素标记、变性凝胶电泳、放射性自显影等复杂的操作，为核酸连接过程研究提供一种新的非同位素分析方法，并建立了该方法的动力学模型，将有助于我们进一步揭示核酸与蛋白质这两种生命中最关键物质之间的相互作用与关系。在此基础上建立了快速、、准确检测T4 DNA连接酶的分析方法。其检测下限为2 .3xlo礴U/mL。 (2)基于分子信标实时监测大肠杆菌DNA连接酶催化DNA连接的活性，并建立了高灵敏地分析连接酶活性的方法。 核酸连接酶除了一类与T4 DNA连接酶相似，以戌1，P为辅酶的之外，另一类以NAD十为辅酶的连接酶也具有同要重要的研究价值。因此，在上一章建立的研究T41〕NA连接酶的技术的基础之上，本章进一步发展了对以NAD+为辅酶的E. coliDNA连接酶的活性及其催化的DNA连接过程的实时监测方法。 该方法灵敏、实时地监测了E coli DNA连接酶催化的DNA连接反应的进程。建立了快速、准确检测E。011 DNA连接酶的分析方法，检测下限为4.0xl了U/ml。与传统的研究方法相比，该方法既避免了同位素标记、变性凝胶电泳、放射自显影等复杂的操作，又为深入研究核酸连接酶与核酸的相互作用提供了实时、丰富的动力学数据，为蛋白质(酶)与核酸的相互作用研究提供了新的思路、方法和有效的手段，对于推动其动力学过程的深入研究具有重要的意义。 (3)基于分子信标荧光探针快速检测烟草花叶病毒的新方法研究 根据常见的烟草花叶病毒(tobacco mosaic vios，TMV)的遗传物质RNA序列，设计一了一种新型分子信标荧光探针，发展了一种直接检测病毒基因组RNA的新方法，由于分子信标具有高特异性、对病毒RNA的提取不需要严格的纯化，就可以用于植物病毒的检测，克服了传统的RFPCR过程要求制备高质量核酸模板的限制，实现了病毒RNA快速、准确的检测。
颜鸿飞[2]2005年在《新型分子探针的设计及其在甲基化酶和限制性内切酶实时分析及药物筛选中的应用》文中研究指明核酸和蛋白质作为生命体中最重要的生物大分子,它们之间的相互作用构成了生命发生、发展和繁衍的基础。在分子水平上研究DNA、蛋白质等生物大分子之间的相互作用已成为当前生命科学研究的热点。然而,传统的研究方法往往需要放射性标记、凝胶电泳和放射性自显影等繁杂操作,且无法获取实时过程信息,在一定程度上阻碍了人们对这些生命过程的深入研究。因此,如何获取生物大分子之间相互作用的实时信息,特别是核酸与蛋白质相互作用的过程信息,已成为迫切需要解决的科学问题。本论文着眼于实时研究生物大分子之间的相互作用,在设计新型发夹核酸探针的基础上,巧妙地结合甲基化酶、限制性内切酶的特殊性质和功能,实时监测了DNA的甲基化和酶切过程。在此基础上建立了DNA甲基化酶和限制性内切酶的荧光分析方法。本论文的主要内容包括以下叁个方面:(1)基于双发夹分子信标分析核酸甲基化酶及药物筛选我们设计了新型分子信标-双发夹分子信标,该探针具有比传统分子信标更稳定的分子结构,与互补核酸链杂交后发夹结构不完全打开,但在酶切反应后其发夹结构被破坏,荧光又可恢复。由于许多DNA酶如限制性内切酶和甲基化酶等的识别位点都是双链序列,因此双发夹分子信标比传统的分子信标更适用于限制性内切酶和甲基化酶分析。我们将Alu I限制性内切酶和甲基化酶识别位点设计在双发夹分子信标的环部,建立了快速、准确分析AluI甲基化酶活性的新方法,并探讨了该方法在影响甲基化酶活性的药物筛选中的应用。(2)新型发夹荧光探针用于甲基化酶催化过程的实时监测及药物筛选我们将Dam甲基化酶的识别位点设计在另一发夹荧光探针的茎部,通过构建由发夹荧光探针、Dam甲基化酶和DpnI限制性内切酶组成的酶偶联反应,实现了核酸甲基化过程的实时监测。在此基础上建立了一种准确、快速检测Dam甲基化酶活性的荧光分析方法,同时考察了一系列药物对甲基化酶活性的影响。该方法有望成为Dam甲基化酶的抑制、激活因子的高通量筛选方法。(3)利用分子信标实时监测限制性内切酶切割单链DNA过程基于限制性内切酶切割分子信标引起荧光信号增强,实时监测了单链DNA的酶切过程,在此基础上提出了一种新的限制性内切酶活性分析方法。利用该方法对其切割机制进行了探讨,证实了单链DNA识别位点瞬时匹配的假设。本论文进一步发挥了新型分子探针在研究核酸与蛋白质相互作用中的优势,实时监测了DNA与甲基化酶、限制性内切酶的动态作用过程,探讨了其在药物筛选中的应用,为在分子水平上研究生物大分子之间的实时作用及药物开发提供
刘斌[3]2007年在《荧光分子探针技术在基因表达产物研究中的应用》文中进行了进一步梳理现代科学认为:许多疾病的发生与细胞内的基因结构和表达水平变化有着直接的联系。但是,如何借助有效的研究手段,从分子水平上实时、灵敏、特异地获取这些信息变化,尤其是基因表达信息的变化,已经成为医学研究所面临的严峻挑战,同时也为分析化学加强与医学的融合提供了新的机遇。荧光分子探针技术作为一种灵敏、准确的研究手段和方法,结合生物大分子的一些特殊生化性质,如核酸杂交、核酸-蛋白质的相互作用、蛋白质(酶)对底物的特异性识别和切割等,将生物分子信息转变为易于检测的荧光信号,有望在获取基因表达产物信息方面取得突破。但是,由于受到荧光分子探针类型的限制和基因表达产物多样性的影响,目前基于荧光分子探针检测基因表达产物的方法还不多。因此,进一步发展可用于检测基因表达产物的荧光分子探针新方法、新技术和新原理是一项非常有意义的前瞻性研究工作。本论文以细胞中能降低肿瘤发生风险的一类基因表达产物损伤修复蛋白为研究对象,利用这些蛋白的催化功能,结合研制新型荧光分子探针,从检测尿嘧啶糖苷酶(UDG)着手,以发展操作简单快速、灵敏度高、选择性好、而且样品量小的新方法为研究主线,利用新的双链荧光探针建立了损伤修复蛋白UDG、APE1和T4DNA连接酶的活性分析新方法,利用已有的分子信标探针开展了损伤修复蛋白hOGG1活性分析;同时利用分子信标开展了基因表达产物mRNA的定量检测研究。这种用于基因表达产物研究的荧光分子探针技术具有操作简单、快速、可实时监测等优点,一定程度上克服了基于放射性标记、凝胶电泳等经典分析方法费时、费力以及无法实时获取基因表达产物信息的缺陷。论文主要内容归纳如下:第一部分荧光分子探针用于基因表达产物碱基损伤修复蛋白的检测1、利用双链荧光探针建立了简单快速的UDG酶活性分析的新方法。UDG酶是一种能特异消除损伤碱基尿嘧啶的蛋白,在防止基因突变,调节免疫功能等方面具有重要意义。目前采用的放射性标记和电泳分析UDG酶活性的方法,不利于酶促反应过程实时监测和活性分析。本章设计双链荧光探针作为切割底物和检测分子,通过监测尿嘧啶切割过程中溶液荧光信号的变化,建立了UDG酶高灵敏分析方法,检测下限可达0.033U/mL;考察了反应溶液中金属离子、化学药物以及底物浓度等条件变化对切割反应初速度的影响,开展了UDG酶促反应机制和动力学过程研究;这种新方法还可快速、准确检测肿瘤细胞中UDG酶活性,检测灵敏度与放射性同位素法相当。以上结果不仅证明荧光分子探针技术用于碱基损伤修复蛋白活性检测的可行性,而且有望为临床诊断提供新的辅助手段。2、利用双链荧光探针建立了简单、快速的APE1酶活性分析的新方法。APE1是细胞中水解AP位点的糖苷酶,主要参与碱基损伤修复、调节细胞周期、细胞凋亡等生命过程。为了避免传统的APE1酶活性分析方法操作复杂、费时的缺陷,我们以含有AP位点的双链荧光探针作为反应底物,在均相溶液中实时监测AP位点水解反应过程,建立了一种APE1酶活性分析的新方法,其线性检测范围为0.024-2U/mL,检测下限为0.024U/mL;通过考察和优化溶液的金属离子、化学药物以及底物浓度等实验条件,在均相溶液中实现了酶促反应机制和动力学过程研究;这种新方法还可用于肿瘤细胞中APE1活性水平的检测,与其他方法相比,该方法不仅灵敏度达到放射性同位素法的水平,而且特异性强、检测结果准确,有望在肿瘤早期诊断上发挥重要作用。3、利用双链荧光探针建立了DNA连接酶活性分析的新方法。核酸连接是生命科学中倍受关注的生命活动。其活性分析和机理研究有助于进一步拓展核酸连接反应在疾病检测、基因载体及核酸修饰与分析等方面的应用。利用双链分子探针作为核酸连接的模板和信号分子,通过实时监测荧光信号降低来监测T4DNA连接酶反应过程,为连接酶活性分析、连接机理及其动力学过程研究提供了一种简便快捷的方法。4、利用单链探针分子信标建立了简单、快速的hOGG1酶活性分析的新方法。根据hOGG1酶能切割损伤碱基8-oxoG和裂解DNA链双重功能的特性,将8-oxoG设计在分子信标茎部,发展了一种可作为hOGG1酶底物的新型荧光探针。通过实时监测hOGG1酶识别切割8-oxoG后引起的溶液荧光信号变化,建立了一种分析hOGG1酶活性的新方法,检测线性范围为0.0125-5U/mL,检测下限为0.0125U/mL;通过考察和优化反应溶液中金属离子、化学药物以等实验条件,开展了hOGG1酶促反应机制和动力学过程研究;这种新的荧光分析方法用于多种肿瘤细胞hOGG1活性水平准确检测的结果表明:这种新方法可望为临床肿瘤早期诊断提供辅助手段。第二部分荧光分子探针用于基因表达产物mRNA的检测5、利用分子信标体外定量检测肿瘤抑制基因ING1 mRNA的表达。基于肿瘤抑制基因ING1 mRNA的序列保守区设计合成分子信标,将其与体外转录的ING1 RNA杂交,得到了ING1分子信标/RNA杂交标准曲线;通过考察杂交缓冲溶液的离子强度、pH值以及其他核酸分子对分子信标与细胞mRNA杂交过程的影响和体系优化,在均相溶液中实现了ING1 mRNA表达水平的定量检测,并利用RT-PCR法验证了检测结果。与其他mRNA检测方法相比,该方法简单、快速,而且检测过程不经过扩增步骤,进一步保证了实验结果的准确,还能用于基因芯片来发展高通量的检测方法。6、利用单链探针分子信标定量检测p21 mRNA的表达。为了进一步拓展分子信标在mRNA检测中的应用,在前一章的工作基础上,利用分子信标检测了p21 mRNA的表达水平。基于p21 mRNA的保守序列设计了分子信标,将其与通过基因重组和体外转录得到的p21 RNA杂交,构建了p21分子信标/RNA杂交标准曲线;通过考察杂交缓冲溶液的离子类型、浓度、pH值以及溶液中的核酸分子对分子信标检测法的影响和体系优化,在均相溶液中定量检测了基因转染和5-氟尿嘧啶处理的MCF-7细胞,以及RNAi处理的CNE2细胞中p21 mRNA的表达水平。这种检测技术操作简单,无需对细胞mRNA进行转录和扩增,即可直接实现靶基因mRNA表达水平的检测。7、5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的HNE1细胞ING1 mRNA表达变化检测与生物学特性分析。利用分子信标检测了5-氟尿嘧啶处理基因转染前后鼻咽癌HNE1总RNA杂交后引起的溶液荧光信号变化,用这种荧光信号变化值直接表示ING1 mRNA表达水平的高低;利用细胞生长速度检测法、流式细胞术、蛋白质杂交法和MTT法等分析手段考察ING1 mRNA表达变化对细胞生理特征的影响。对基于不同分析方法得到的实验结果进行比较分析,发现ING1 mRNA表达水平能作为判断细胞生长速度、细胞周期分布、蛋白质表达水平和对抗肿瘤药物敏感性的一个有效指标。
马昌杯[4]2007年在《分子信标技术在生物酶和ATP等重要生物分子检测中的应用》文中研究说明生物酶和ATP等重要生物分子是生物体和生命现象的结构基础和功能基础,在物质代谢、机体防御、血液凝固、肌肉收缩、细胞信息传递、个体生长发育、组织修复等方面发挥着不可替代的重要作用,它们的含量和活性直接关系到生物体的健康。因此,深入研究这些生物分子之间的相互作用,特别是建立这些生物分子快速、简便、准确、灵敏的分析方法,对分子水平上阐明生命的奥秘、新型药物的开发,攻克许多疑难病症以及促进信息科学的发展都有重要的意义,是当前生物分析化学研究的前沿和热点。本论文以上述科学问题为目标,结合当前发展的核酸探针技术和分子生物学手段,巧妙地利用了核酸酶(连接酶或聚合酶)、核酸以及分子信标核酸探针的特殊性质,发展了激酶、磷酸酶和限制性内切酶等生物酶活性实时检测的新方法。更重要的是,首次将分子信标探针用于叁磷酸腺苷(ATP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)等重要生物小分子的检测。主要内容归纳如下:首先,拓展了NTFS平台技术的应用,将其用于ATP、NAD、NADP、肌酸激酶、蛋白激酶等重要生物分子的检测,具体包括以下六个部分:1、分子信标技术结合T4 DNA连接酶用于ATP的检测。利用T4 DNA连接酶对ATP的高度依赖性,我们发展了一种ATP检测新方法。在ATP存在的条件下,T4 DNA连接酶以分子信标为模板,将两段短核酸片段连接,连接产物将分子信标打开,荧光信号增强,从而达到检测ATP的目的。该方法灵敏,简单,其线性响应范围为1~300 nM,检测下限为0.14 nM。并利用该方法对细胞内的ATP水平进行了初步分析。2、分子信标技术用于肌酸激酶活性的检测。二磷酸腺苷(ADP)与磷酸肌酸在肌酸激酶催化作用下生成肌酸和ATP,由于T4 DNA连接酶对ATP的高度依赖性,T4 DNA连接酶就会识别并利用生成的ATP进行DNA连接反应,产生的长链DNA将分子信标打开,使荧光信号增强,达到检测肌酸激酶活性的目的。其线性响应范围为1~50 U/L,检测下限为0.64 U/L。并用此方法考察了药物对CK活性的影响。该方法快速、简便、灵敏度高。3、分子信标技术用于蛋白激酶A活性的检测。以蛋白激酶A为模型,通过测定蛋白激酶催化后所剩余的ATP的量来检测蛋白激酶的活性。T4 DNA连接酶和分子信标底物被用于ATP的检测,其线性响应范围为12.5~150 nM,检测下限为1.25 nM。并考察了药物染料木素对蛋白激酶A的抑制作用。该方法不用进行同位素标记、操作简便、具有通用性。4、分子信标结合酶信号放大检测ATP。结合连接酶、腺苷酸激酶和核苷二磷酸激酶对ATP进行了检测。连接反应消耗ATP生成单磷酸腺苷(AMP),AMP与叁磷酸脱氧胞苷酸(dCTP)在腺苷酸激酶的催化下生成ADP和2-脱氧胞苷5-二磷酸(dCDP),ADP和dCTP在核苷二磷酸激酶催化下生成ATP,使得ATP得到循环。利用T4 DNA连接酶对ATP的高度依赖性,ATP的不断产生使得被打开的分子信标不断增加,检测的线性范围为0.01~10 nM,检测下限为5 pM,与最灵敏的ATP检测方法生物发光法的灵敏度相当。5、基于分子信标的NAD高灵敏检测方法。本章利用大肠杆菌DNA连接酶对NAD的高度依赖性,发展了一种NAD检测新方法。在NAD存在的条件下,大肠杆菌DNA连接酶被激活,并以分子信标为模板,将两段短核酸片段连接,连接产物将分子信标打开,荧光信号增强,从而达到检测NAD的目的。该方法灵敏,简单,其线性范围为0.3~40 nM及40~300 nM,检测下限为0.3 nM。并利用该方法考察了卡路里限制对MCF7细胞内NAD水平的影响。6、基于分子信标的NADP高灵敏检测方法。首先利用碱性磷酸酶将NADP的磷酸根切除转化生成NAD,然后将NAD加入到分子信标及大肠杆菌DNA连接酶连接体系中进行检测,通过记录并计算荧光增强的初速度来定量,检测的线性范围为5~200 nM,检测下限为2 nM。这是一种简单、快速、高灵敏度的NADP分析新方法,且具有良好的特异性。其次,对NTFS平台技术进行了改进,基于聚合酶延伸反应发展了一种更简便快速的用于实时研究核酸与蛋白质(酶)相互作用的新技术,主要包括以下四个部分:7、分子信标用于DNA聚合酶活性的实时监测。研究聚合酶活性的传统方法主要是放射性同位素标记结合凝胶电泳,操作复杂费时,并且不能提供实时信息。本章利用分子信标技术,建立了一种简单、快速、灵敏地实时监测聚合酶活性的方法。其线性响应范围为0.003~6.25 U/mL,检测下限为0.003 U/mL。并探讨了聚合酶抑制剂对酶活性的影响,为以聚合酶为作用靶标的新药开发及筛选提供了一种新的思路。8、分子信标用于核酸3’端去磷酸化过程的实时监测。利用分子信标技术,结合DNA聚合酶发展了一种核酸3’端去磷酸化实时监测方法,建立了T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)的酯酶活性分析新方法。其线性响应范围为0.1~15 U/mL,检测下限为0.1 U/mL。并探讨了酶抑制剂对T4 PNK酯酶活性的影响,为T4 PNK抑制剂筛选提供了新的思路和方法。9、分子信标用于限制性内切酶活性的实时监测。传统的检测限制性内切酶活性的方法是不连续的,费时的。本章利用分子信标技术,建立了一种简便快捷、灵敏地连续监测限制性内切酶活性的方法。其线性响应范围为1~250 U/mL,检测下限为1 U/mL。并探讨了限制性内切酶抑制剂对酶活性的影响,为以限制性内切酶为作用靶标的新药开发及筛选提供了新的手段。10、分子信标用于碱性磷酸酶活性的分析。利用分子信标技术,建立了一种简单、快速、灵敏地监测磷酸酶活性的新方法,首次利用DNA作为酶作用底物对其活性进行检测。其线性响应范围为4×10-16~4×10-14 M,检测下限为4×10-16 M。并探讨了碱性磷酸酶抑制剂对酶活性的影响,为以碱性磷酸酶为作用靶标的新药开发及筛选提供了新的思路和手段。
孟祥贤[5]2007年在《核酸探针的设计及其在疾病检测和酶学研究中的应用》文中认为目前我们对生命现象的认识和理解已经从个体、组织、细胞层次深入到分子水平,如何从分子水平上实时、原位、灵敏、特异地获取生命过程中的重要信息,一直是生物医学研究者、分析化学研究者不懈努力的目标。核酸探针,一种可以从分子水平上进行设计、标记、合成以及应用的新兴研究手段,为分子生物学和分子医学的发展起了积极的作用。各种设计巧妙、性能优良的核酸探针被开发、研制,并在基因分析、疾病诊断、蛋白质(酶)检测分析、物种分类等领域得到广泛的应用。但是,如何进一步拓展已有核酸探针在生命科学与医学中的应用;如何进一步开发研制新的核酸探针,解决现有探针技术不能解决的问题和在生命研究过程中遇到的新问题,仍然是生物医学工作者面临的严峻挑战,同时也为分析化学加强与生命科学和医学的融合提供了新的机遇。本论文以上述科学问题为目标,结合分子信标核酸探针和染料探针技术,建立了丙肝病毒核酶切割产物和限制性内切酶切割产物的超灵敏检测方法和简便快捷的地中海贫血遗传病点突变基因分型的方法;建立了体外监测DNA复制过程聚合反应的荧光方法;探讨了生命活动过程中有重要意义的连接酶的连接机理和聚合酶的活性实时分析。更重要的是,开发并研制了叁种新型的核酸探针─核酶分子探针、熔点扩大核酸探针和信号扩增核酸探针,用于丙肝病毒核酶切割过程的实时监测和地中海贫血遗传病点突变的检测。主要内容归纳如下:第一部分分子信标和染料探针技术用于疾病检测和酶学分析1、建立了核酶切割产物的超灵敏检测方法。核酶是具有切割特定RNA序列能力的小RNA分子,在抗病毒、抗恶性肿瘤基因治疗中有着重要意义。目前核酶切割产物的研究方法,一般需要将核酶或底物RNA进行标记,不利于核酶临床研究与应用。本论文利用分子信标作为核酶切割产物的连接模板和检测分子,在RNA/DNA核酸杂合体连接过程中,核酶切割产物的信息被实时转换为荧光信号。实现了在不标记核酶或RNA底物的情况下,高灵敏高特异地检测丙肝病毒核酶切割产物,检测下限可达0.05 nmol/L。为真实准确反映核酶切割反应提供了一种简便快捷的非同位素分析方法,也为核酶基因药物的快速筛选、核酶动力学、核酶在基因治疗中的深入研究提供了新的思路和技术。2、建立了限制性内切酶切割产物的超灵敏检测方法。利用分子信标作为限制性内切酶切割产物的连接模板和检测探针,在DNA/DNA核酸杂合体连接过程中,将切割产物的信息实时转换为荧光信号,实现了在不标记限制性内切酶底物的情况下,高灵敏高特异地检测限制性内切酶切割产物。其线性响应范围为0.2 nmol/L到30nmol/L,检测下限可达0.05 nmol/L。该方法不仅可用于限制性内切酶切割产物的检测,还可用于其它水解酶切割产物的检测。3、建立了DNA连接酶连接机理研究的新方法。核酸连接是生命科学中倍受关注的生命活动。其机理研究有助于进一步拓展核酸连接反应在疾病检测、基因载体及核酸修饰与分析等方面的应用。利用分子信标作为核酸连接的模板和信号产生分子,研究了T4 DNA连接酶的连接机理。为连接酶连接机理及其连接动力学过程研究提供了一种简便快捷的方法。该方法不仅可用于T4 DNA连接酶机理研究,还可用于其它DNA连接酶及RNA连接酶的研究。4、建立了体外监测DNA复制过程中聚合反应的荧光方法。DNA复制是最基本的生命活动之一,其研究对于探讨生命繁衍、生存与进化问题有重要意义。目前DNA复制的研究,一般采用放射性标记与凝胶电泳相结合的方法,操作复杂,不利于方便快捷地捕获生命活动过程中的重要信息。利用分子信标监测DNA的体外连续复制和不连续复制过程,以荧光信号的方式直接方便地表征出复制过程中聚合反应的有关重要信息,避免了传统的DNA复制分析方法中的放射性同位素标记、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等复杂操作。并利用该体系,建立了叁种聚合酶的定量分析方法。5、建立了简便快速的聚合酶活性实时分析新方法。聚合酶作为生命活动过程中的一种重要的酶,目前已广泛应用于基因测序,载体制备及基因克隆等方面。利用染料探针技术,建立了一种简便快捷地实时监测聚合酶活性的方法,探讨了叁种抗肿瘤药物对聚合酶活性的影响,为以聚合酶为作用靶标的抗肿瘤新药的开发及筛选提供了一种新的思路。6、建立了地中海贫血遗传病点突变检测的简便方法。地中海贫血是一种常见的点突变性遗传病,发展一种操作简便、成本低廉的检测方法对该遗传病的普查及产前诊断有重要意义。基于染料探针技术,结合聚合酶特异性延伸反应,发展了一种简单、快速、成本低的单核苷酸多态性基因分型方法,并用于地中海贫血遗传病点突变的基因分型。第二部分新型核酸探针的设计及其在疾病检测中的应用7、核酶分子探针的设计及其对丙肝病毒核酶切割过程的实时监测。核酶切割反应的研究,一直使用传统的放射性同位素标记与变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合的方法,操作繁琐复杂,并且不能实时、动态地提供核酶切割过程的信息。通过将核酶底物修饰,在其两端分别加上6个碱基形成互补臂,构建了一种新的核酶分子探标,它将核酶切割反应的信息实时同步转换为荧光信号,实现了丙肝病毒核酶切割过程的实时监测。与已有研究方法比较,该方法是一种非同位素标记、高灵敏高特异的核酶切割反应实时监测方法。为核酶活性分析、核酶动力学研究提供新型有效的手段,也为核酶基因药物的深入研究提供了新的方法和思路。8、熔点扩大核酸探针的设计及其在点突变检测中的应用。许多遗传性疾病的发生发展与点突变密切相关,点突变的准确检测对这些疾病的预防、临床检测和分子诊断有重大意义。目前基于熔点分析的方法对于基因型之间有显着差异的点突变,能快速准确的检测,但是对于一些基因型之间熔点差异较小的点突变,不能进行有效判断。基于荧光共振能量转移和连接酶技术,设计了一种新的核酸探针,用于显着提高点突变不同基因型之间的熔点差异,实现了点突变准确快速的基因分型研究。利用该方法,成功实现了地中海贫血遗传病两种普遍存在的点突变CD17 (A→T)和Ivs-2-654 (C→T)的基因分型。该方法能对各种点突变类型进行检测,具有良好的保真性,而且操作简便,不需要离心、电泳、分离等复杂繁琐的步骤,有望在临床检测和应用上发挥重要作用。9、信号扩增核酸探针的设计及其在点突变检测中的应用。高灵敏的点突变检测方法,目前一般是基于单分子检测系统进行,昂贵的检测装置使其在临床应用受到一定限制。基于微球富集技术与连接酶链式反应扩增技术,发展了一种新的核酸探针来高灵敏、方便快捷的进行点突变检测。样品的基因型通过检测微球上捕获的荧光连接产物方便快速的获得。该方法具有很高的灵敏度,能检测到600个拷贝的靶序列。这种方法,不仅能对PCR扩增产物的点突变进行检测,而且能直接以抽提的总DNA进行点突变检测,再加上其操作简便、成本较低、而且能用于芯片实现高通量检测,该方法在基因突变性疾病的检测中有重要应用前景。
唐红星[6]2008年在《核酸探针技术用于mRNA检测的研究》文中提出实时获取RNA合成、转运、表达、定位的信息对分子生物学、病理生理学、药物的开发及疾病的诊断等研究都具有重要的推动作用。核酸荧光分子探针为RNA研究提供了一种强有力的工具,已为我们提供了大量有关RNA的基本信息。但是,如何进一步拓展已有核酸分子探针在生命科学与医学中的应用范围,如何进一步改进或研制新的核酸分子探针来解决生命研究过程中遇到的新问题,如何实时、动态、灵敏、准确地获取生命活动相关信息,仍然是分析化学工作者所面临的重大挑战。本论文瞄准上述挑战进行研究,结合分子信标和相邻探针技术建立了一系列检测mRNA的新方法,主要内容包括:1.建立了一种直接以mRNA为模板,基于Reverse分子信标检测单碱基突变的新方法。本文以重要的肿瘤相关基因p53为检测对象,利用T4 DNA连接酶的高特异性、以及RNase H对RNA/DNA杂交体中RNA链的降解作用,结合Reverse分子信标技术,发展了一种快速检测靶基因mRNA单碱基突变的新方法。该方法通过比较分析RNase H作用前后样品中荧光信号的变化,确定是否存在单碱基突变。这种方法探针设计简单,避免了反转录、PCR扩增、电泳分离等步骤,检测结果准确,已应用于细胞总RNA提取物中目标基因的单碱基错配检测。2.设计合成了超猝灭分子信标。提高分子信标的猝灭效率是优化分子信标检测性能,提高其检测灵敏度的有效途径之一。本文设计、合成、纯化了常规分子信标和超淬灭分子信标,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对产物进行解析,证明其为目标产物。与相同序列的常规分子信标相比,超淬灭分子信标的信背比可达到112,比常规分子信标大约高5倍,信背比的提高主要是通过降低背景信号达到的。研究还表明,与荧光基团相邻的末端为C碱基,或者在探针末端引入与目标互补的序列,也可以提高超猝灭分子信标的检测灵敏度。3.建立了基于硫代修饰相邻探针直接检测细胞裂解液中mRNA的新方法。常规相邻探针用于生物样品中核酸检测时,有可能被核酸酶降解而产生假阴性信号。本文设计了一种硫代修饰的相邻探针,并用于细胞裂解液中相关mRNA的检测。结果表明,硫代修饰探针可以有效抵御核酸酶的降解作用,降低假阳性信号及假阴性信号。探针设计简单、灵敏度高、与靶分子作用速度快;检测过程中信号呈逐渐增强模式、可免除洗脱及分离等步骤。4.建立了基于分子信标荧光增强速率检测活细胞内mRNA表达的新方法。常规分子信标在活细胞内mRNA表达水平的研究中,由于细胞内核酸酶对分子信标骨架的降解和破坏作用,常导致假阳性信号的产生,对检测结果的准确性影响较大。本文根据肿瘤抑制基因p21序列设计合成分子信标,通过显微操作将其注入p21表达水平存在差异的两种鼻咽癌细胞内,以活细胞成像方式动态检测了分子信标进入鼻咽癌细胞后荧光信号的变化。p21分子信标注入两种细胞后,荧光信号均逐渐增强,约15 min后达到最大值;注入细胞后4 min内,两种细胞间荧光增强速率存在明显差异,该差异反映了p21 mRNA表达水平的变化趋势,与常规逆转录PCR (RT-PCR)结果相符。在使用分子信标进行活细胞内mRNA表达水平的研究中,通过分析荧光增强速率的变化,可有效降低细胞内的酶的影响,提高检测结果的准确性。5.建立了基于硫代修饰分子信标检测活细胞内mRNA表达的新方法。本文针对分子信标在活细胞检测中所面临的生物稳定性的关键问题,用可抵御核酸酶切的硫代修饰的DNA设计合成分子信标探针,提高了细胞内检测结果的准确性,同时还可保持常规分子信标高选择性、高灵敏度以及无需对多余探针洗脱的优点。该分子信标已应用于转染GFP基因前后活细胞内靶GFP mRNA的实时检测。
刘全俊[7]2006年在《叁类新型集成化的基因芯片及其相关仪器的研制》文中研究表明基因芯片技术是一种高通量的现代生物检测技术,在功能基因研究、新药筛选、疾病的基因诊断等领域具有广泛的应用。基因芯片检测是一个复杂的过程,包括:靶基因的扩增、扩增产物的标记、芯片杂交与清洗、杂交信号检测及分析等。在这样的一个复杂检测流程中,容易产生由于操作过程的复杂性而带来的检测结果不稳定,从而影响了基因芯片的推广应用。我们研制基因扩增杂交一体化检测仪的目的是为了实现从基因扩增、荧光标记、杂交与清洗、芯片信号检测的一系列流程的自动化操作,以减少检测结果的人为因素的干扰,提高基因芯片在基因多态性分析及疾病诊断等方面的应用水平。为了进一步简化基因扩增杂交检测一体化芯片结构及其仪器的复杂性,我们又提出了管盖基因芯片。为能够对多个靶基因实现定量检测,我们在本实验室提出的TaqMan微阵列芯片的基础上,设计和研制了定量基因芯片检测系统,并设计了一种新的FRET定量检测基因芯片,可用于同一样品中不同基因的高通量定量检测。1.基因扩增杂交一体化芯片及检测系统针对基因芯片检测过程的复杂性,我们设计了集成化的操作平台—基因扩增杂交检测一体化芯片,用于实现基因扩增、杂交、清洗、检测的自动化以减少复杂操作过程中的人为因素影响。基因扩增杂交检测一体化芯片的结构包括二个功能区域:十四个通道的玻璃毛细管作为基因扩增区域和由十四个在玻片上固定了核酸探针阵列的基因芯片组成的杂交检测区。使用了硅胶作为密封件,分别将二个区域相连。该芯片可实现十四个通道的基因扩增与基因芯片检测一体化,检测样品流程所需要的时间为3~4小时。基于上述生物芯片,我们设计和研制了基因扩增杂交一体化检测仪,能够进行PCR、生物芯片杂交和荧光检测的一体化操作。基因扩增杂交一体化检测仪主要由温度精确控制系统、样品自动注入系统和荧光检测几部分组成,包括:计算机、加热炉、荧光显微镜、温度控制器、试样装夹及送进机构、运动控制箱、清洗机构等。与南京依科机电有限公司合作开发出相应的产品,通过了江苏省医疗器械检测所的检验,建立了医疗器械注册产品标准。该仪器有如下的结构特点:(1)利用蠕动泵,电磁开关等进行液体的控制。通过软件控制,实现了反应体系在基因扩增区域与杂交区域的密封与流动。通过液体的输送,实现了基因扩增产物与杂交液的混合及与芯片的杂交反应。(2)杂交过程的温度控制通过空气介导的温控体系来实现。具有变温快、温度场均匀等优点。此仪器能够对PCR反应区的温度进行精确控制,其温度上升的速率可达到20 oC/s,下降的速率可达到10oC/s。(3)芯片的荧光杂交信号检测是通过荧光显微镜与CCD的图像采集技术实现的。芯片被固定在二维移动平台上在显微镜下进行荧光信号的扫描阅读,在PC机上显示,存入计算机。基于上述芯片和仪器,我们发展了用于乙型肝炎基因突变检测的试剂,可以对乙型肝炎YMDD突变基因进行检测,并在南京市第二医院进行了临床检测,检测准确率达到100%。通过与在普通
李军[8]2002年在《分子信标荧光探针用于遗传物质的超灵敏检测及超微型DNA、pH传感器的研究》文中进行了进一步梳理人们对生命现象的观察和研究已经深入到纳米尺度和单细胞，单分子的水平，如何在这样一个尺度范围内获取有用的生物化学信息对分析化学的各个研究领域均提出了新的要求。单分子、单细胞检测、生物芯片的开发以及纳米技术的应用渐渐成为现代分析化学研究的主流领域之一。可进行实时、在线、原位、活体检测的分子探针和超微型生物传感器成为人们研究的热点和重点。 本论文紧跟上述前沿方向开展了两方面的研究。第一部分主要是发展能特异性识别生物分子的分子信标荧光探针，建立准确、快速、定量检测遗传物质的新方法。如抑癌基因ING1在活体细胞内的转录产物的测定，以及病毒遗传物质的快速检测；同时发展了分子探针的固定化方法，并用于基因芯片的研究。第二部分在发展了sol-gel、光聚合法固定生物分子或荧光染料的基础上，成功地在超微型的光导纤维表面固定生物素化的分子信标以及氨基荧光素等荧光染料，制备了能用于单细胞测定的DNA、pH传感器，并成功地用于活体细胞中pH的测定，同时发展了能测定蛋白质、葡萄糖等物质的生物传感器。本论文各章内容可归纳如下： 第一章，根据抑癌基因ING1基因的序列设计并合成了检测ING1转录产物的分子信标(5'--TAMRA-C6-NH-CGTTGA TGG TTC CAC TTC TCG TGC GT TCAACG-DABCYL-3')，其中TAMRA代表四甲基罗丹明，为荧光基团，DABCYL代表4-(对二甲氨基偶氮苯)苯甲酸，为荧光熄灭基团。基于该分子信标，发展了一种快速测量从正常细胞系和鼻咽癌肿瘤细胞系提取的ING1转录产物的方法，所得结果与用逆转录结合PCR法(RT-PCR)得到的结果相吻合，使得原来需要2-3天才能完成的工作在1-2个小时内就能完成，并首次提出了将基因转录产物进行定量测定的方法。 第二章，通过细胞转导实验证明，针对ING1转录产物设计的分子信标荧光探针能通过脂质体转导的方法转入活体细胞中，在细胞核和一些细胞器的周围发出荧光显示ING1转录产物的存在；实现在单细胞水平上观察ING1转录产物在细胞质中的表达和分布。并且，将能表达ING1基因的质粒转入肿瘤细胞进行培养后，再将分子信标转入肿瘤细胞，发现转导了质粒的肿瘤细胞比没转导质粒的肿瘤细胞内的荧光明显增强，其增强程度可用光谱扫描的方式将其量化。 第叁章，根据一种常见的病毒烟草花叶病毒(TMV)的核酸序列设计了分子信 标荧光探针，由于TMV的遗传物质是RNA，分子信标又具有很高的特异性和灵敏 度，因此感染了病毒粒子的植物叶片在经过简单处理后，可用分子信标检测叶片上。 感染病毒的程度。这样既避免了病毒粒子复杂的提取过程，又节省了PT－PCR扩增过。 程和琼脂糖凝胶电泳所需要的大量时间。 第四章，根据人体肌动蛋白p－actin基因的序列合成了分子信标并将其生物素化，。 发展了桥式结构固定分子信标的方法，结果表明这种方法可以有效地分子信标，以此构 造了DNA生物传感器。传感器对cDNA的响应时间为15分钟，并对单碱基突变的DNA Z 具有很高的选择性。采用激光激发和荧光显微镜收集信号后，传感器的检测限可达10－’。 moMi的水平。这种方法可用来建立基于分子信标的单基因DNA芯片检测技术。选取。 了乙型肝炎病毒啊w为检测对象，根据其高度保守的基因序列设计相应的分子信标。4 这种探针对乙肝病毒阳性和阴性病人血清的检测有显着性差异，生物素化的分子信标可￥ 以用桥式结构固定在玻璃片表面，制成DNA芯片，根据芯片的荧光可以快速检测到靶g ＃ DNA的存在。＼ 第五章，研究了溶胶－凝胶法固定生物分子的新方法，使用了一种新的制备和保存g 方法使得溶胶．．凝胶敏感膜透明且无破裂。利用透射电子显微镜分析了酶分子在溶胶．凝g 胶中的存在状态，发现酶分子在溶胶－凝胶中象在水溶液中一样均匀分布，且不影响活k 性。辣根过氧化物酶（HRP）和葡萄糖氧化酶（GOD）都能成功地包埋于其中。利用此i 方法，我们构造了一种基于鲁米诺－HZO。－HRP体系的化学发光信号型过氧化氢传感器，；l｛ 化学发光的强度与过氧化氢的浓度在0．of－2 InM之间有线性响应，检测下限达 8 PM，t：； 与共价交联的固定方法相比，此传感器具有较长的寿命和较好的稳定性。此传感器可用《 于分析葡萄糖和酚类物质的含量，并发现对酚类物质的响应是通过竞争反应实现的。j（ 第六章，研究了基于溶胶－凝胶固定化方法的DNA生物传感器，建立了溶胶－凝胶法n 固定分子信标的模型，提出了利用桥式结构固定分子信标的最佳方案，然后将分子信标g 固定在光导纤维和亚微米光纤（
潘美[9]2016年在《DNA等温扩增检测副溶血性弧菌的新技术研究》文中研究说明近年来,新发展起来的核酸扩增技术已广泛应用于生命科学及其相关的各个领域,对生命科学的发展发挥着重要的作用。由于聚合酶链式反应需要反复的热变性,依赖于特定的热循环仪,从而使其应用范围受到了一定的限制。因此,建立简便快速、灵敏、准确的等温核酸扩增技术对核酸的体外扩增检测具有非常重要的意义,并在临床和现场快速诊断中具有良好的应用前景。本论文构建了两种简单、快速、灵敏检测DNA的等温核酸扩增新方法。在第二章中,本论文基于邻近效应原理在等温条件下构建了DNA检测的新方法。首先,设计了两种实验方案,并对方案进行了优化。以副溶血性弧菌的特征序列为检测靶标,对实验方案进行了优化设计,并对引物的长度和浓度等条件进行优化。在最优条件下对不同浓度的靶标DNA进行检测,最低可以检测到0.1fmol,且靶标含量在100 fmol-0.1 fmol的范围内,荧光信号的POI值与靶标浓度呈良好的线性关系。该检测方法操作简单,反应迅速、对仪器的依赖性低。在第叁章中,本论文构建了一种基于荧光探针检测双链DNA的新方法。该方法首先借助切刻内切酶与聚合酶的联合作用,在靶标双链DNA上引发线性链置换扩增,将双链DNA转化为单链。然后利用设计的双链荧光探针作为引物在单链DNA上引发后续反应,最终实现信号的级联放大。该方法以大肠杆菌pBluescript II KS(+)(PBS)质粒作为检测对象,最低可以检测到2.3 amol的PBS质粒;且该方法具有较强的特异性,即使双链荧光探针中只含有一个碱基错配也能将其有效的区分;为了检验该方法在实际样品中的应用,在复杂体系下对靶标进行检测,结果表明该方法具有较强的抗干扰能力。基于该方法具有简单快速、特异性高、抗干扰能力强等优点,可为海产养殖中致病微生物,如副溶血性弧菌、霍乱弧菌等致病菌的检测提供一个新的平台。
向蕾[10]2014年在《多重实时荧光RT-PCR快速检测四种呼吸道病毒的研究》文中研究说明研究背景急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infections，ARTIs)是世界范围内人群健康的主要问题，是导致5岁以下儿童死亡的第二大原因。引起呼吸道感染的主要病原体主要包括病毒、细菌、支原体、衣原体等，而病毒感染是导致呼吸道感染的非常重要的一种病因。据统计，大约90%的病例为呼吸道病毒所致。建立起快速、准确的鉴别诊断技术，可对呼吸道病毒的疫情进行实时监测，在流行早期及时调整和完善相应的防治措施，防止疾病的进一步蔓延，为防控措施的效果评价提供科学依据；可在发病初期快速进行临床病因学确诊与治疗处理，降低病人并发症发生率及死亡率，减轻国家及个人的疾病负担与经济负担，具有重要的社会意义；能够用于疾病预防控制系统、出入境检验检疫系统和临床医学检验系统，具有重要的实用价值和现实推广意义。呼吸道病毒鉴别诊断技术主要可以分为传统方法以及分子生物学方法这两大类。而传统的实验室检测方法存在较多的缺陷及不足，无法满足对呼吸道病毒进行快速准确鉴别的要求。随着分子生物学的快速发展，越来越多的新型检测手段被用于呼吸道病毒的鉴别领域之中，近年来，实时荧光定量PCR技术及实时荧光定量RT-PCR技术由于具有灵敏度高，特异性强，能实现多重反应，具有自动化程度高、无污染性、实时性和准确性的优势，在分子诊断领域发展最快，应用最成熟也最常被采用。呼吸道病毒种类繁多，其中既有DNA病毒，又有RNA病毒，为了同时检测两种类型的病毒，可采用实时荧光定量RT-PCR方法。多重实时荧光定量RT-PCR技术是在实时荧光定量RT-PCR技术上发展起来的一种技术，通过选定多重荧光通道，通过在1个反应体系之中加入多对引物与多条探针（分别标记不同的荧光基团），可实现对多种核酸模板的检测，即可进行多种呼吸道病毒的分子鉴别诊断。目前，由于荧光RT-PCR仪检测通道的限制，多色荧光体系检测最多只能实现4个或5个目标序列的同时检测，除了依靠科技进步不断增加检测通道数量，想要提高检测核酸样本数量必须另辟蹊径。在这个基础上，多色组合探针编码（Multicolor Recombination Probe Coding, MCPC）技术被提出。同时，同源加尾（Homo-Tag Assisted Non-Dimer, HAND）系统通过在上游引物和下游引物的5’端分别加上相同的标签，可以大大减少引物二聚体的形成，降低引物二聚体对荧光RT-PCR反应的干扰。国内外的实验研究表明，利用目前应用广泛的多通道实时荧光定量RT-PCR仪，同时检测3种荧光因素完全可行。通过采用MCPC技术和HAND系统，可在目前所广泛使用的多通道实时荧光定量RT-PCR仪上实现同时检测7种核酸模板的分子诊断，可以突破实时荧光定量RT-PCR仪自身荧光信号检测通道的限制，减少引物二聚体的形成，降低引物二聚体对荧光RT-PCR反应的干扰。本研究基于多重实时荧光定量RT-PCR技术、MCPC技术及HAND系统，以期能够建立人腺病毒（human adenovirus, HADV）、人博卡病毒(human bocavirus,HBoV)、人偏肺病毒（human metapneumovirus, HMPV）、人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus, HRSV）等四种呼吸道病毒的实时荧光定量RT-PCR体系，建立这4种呼吸道病毒的鉴别诊断体系标准，也为所有呼吸道病毒的快速、准确的多重鉴别诊断技术提供一种可能的方法。研究方法1、特异性结合引物、加尾引物与探针设计与合成：从Genebank分别下载若干条HADV、HBoV、HMPV、HRSV的基因序列，选择高保守区域进行特异性结合引物和TaqMan探针的设计。在特异性结合引物序列的基础上，在5’端添加一段通用引物序列，得到加尾引物。合成特异性结合引物、加尾引物与探针。2、目的序列阳性克隆菌和体外RNA转录：分别选出4种呼吸道病毒的两引物目标位点之间的基因片段，将其作为研究中的目的序列。委托大连宝生物公司制造阳性克隆菌。摇菌，离心，弃上清，提取质粒DNA，委托大连宝生物公司体外转录RNA。3、临床样本核酸模板的制备：以HADV、HBoV、HMPV、HRSV四种呼吸道病毒，以及引起相似临床症状的其他类型呼吸道病毒的咽拭子临床样本提取核酸作为模板，使用Roche公司的High Pure Viral Nucleic Acid Kit试剂盒提取病毒核酸模板。4、单重实时荧光定量RT-PCR体系的建立：确定初步的反应体系和反应条件，完成单重荧光RT-PCR实验；通过设置温度梯度，确定反应的退火延伸温度；使用106-101copies/μl各个稀释度的体外转录RNA探索单重荧光RT-PCR体系的灵敏度；绘制反应体系的标准曲线，计算单重荧光RT-PCR反应的扩增效率；每孔设置3个平行样，计算CT值均数及标准差，得到3个CT值的变异系数，检验反应体系的重复性；以临床样本提取核酸作为模板，检验反应体系的特异性。5、多重实时荧光定量RT-PCR体系的建立：确定反应体系和反应条件，完成多重荧光RT-PCR实验；使用106-101copies/μl各个稀释度的体外转录RNA探索多重荧光RT-PCR体系的灵敏度；绘制反应体系标准曲线，计算多重荧光RT-PCR反应的扩增效率；每孔设置3个平行样，计算CT值均数及标准差，得到3个CT值的变异系数，检验反应体系的重复性；以临床样本提取核酸作为模板，检验反应体系的特异性。6、 HAND多重实时荧光定量RT-PCR体系的建立：探索加尾引物的浓度，在此实验结果基础上，完成探针的浓度探索实验；使用106-101copies/μl各个稀释度的体外转录RNA探索HAND多重荧光RT-PCR体系的灵敏度；绘制反应体系的标准曲线，计算HAND多重荧光RT-PCR反应的扩增效率；每孔设置3个平行样，计算CT值均数及标准差，得到3个CT值的变异系数，检验反应体系的重复性；以临床样本提取核酸作为模板，检验反应体系的特异性。研究结果1、单重荧光RT-PCR体系的建立与检验：HADV、HBoV、HMPV、HRSV这4种呼吸道病毒的单重荧光RT-PCR体系均成功建立，而反应退火延伸温度在达到60℃时仍然能够准确检出体外转录RNA，所建立的单重荧光RT-PCR反应体系对4种病毒的检出灵敏度均达到10copies/μl，标准曲线的决定系数分别为：HADV的R2=0.9998, HBoV的R2=0.9981, HMPV的R2=0.9981,HRSV的R2=0.9947和0.9965，扩增效率分别为：HADV105.08%，HBoV107.81%，HMPV102.08%，HRSV FAM荧光106.38%及CY5荧光107.95%，单重荧光RT-PCR反应体系检测体外转录RNA的各个拷贝数浓度的变异系数均较低，对临床样本检验的特异性为100%。2、多重荧光RT-PCR体系的建立与检验：HADV、HBoV、HMPV、HRSV这4种呼吸道病毒的多重荧光RT-PCR体系成功建立，所建立的多重荧光RT-PCR反应体系对4种病毒的检出灵敏度均达到10copies/μl，标准曲线的决定系数分别为：HADV的R2=0.9985, HBoV的R2=0.9998, HMPV的R2=0.9965,HRSV的R2=0.9966和0.9954，扩增效率分别为：HADV103.63%，HBoV102.65%，HMPV100.37%，HRSV FAM荧光105.54%及CY5荧光104.07%，多重荧光RT-PCR反应体系检测体外转录RNA的各个拷贝数浓度的变异系数均较低，对临床样本检验的特异性为100%。3、 HAND多重荧光RT-PCR体系的建立与检验：HADV、HBoV、HMPV、HRSV这4种呼吸道病毒的最适上下游加尾引物的加入量分别为：HADV上下游加尾引物0.15μl，HBoV上下游加尾引物0.10μl，HMPV上下游加尾引物0.10μl，HRSV上下游加尾引物0.10μl。4种呼吸道病毒的最适探针的加入量分别为：HADV探针0.30μl，HBoV探针0.25μl，HMPV探针0.30μl，HRSV的两条探针各0.15μl共0.30μl。所建立的HAND多重荧光RT-PCR反应体系对4种病毒的检出灵敏度均达到102copies/μl，标准曲线的决定系数分别为：HADV的R2=0.9977, HBoV的R2=0.9969, HMPV的R2=0.9985,HRSV的R2=0.9969和0.9979，扩增效率分别为：HADV99.58%，HBoV96.45%，HMPV98.64%，HRSV FAM荧光93.32%及CY5荧光94.62%，HAND多重荧光RT-PCR反应体系检测体外转录RNA的106-102copies/μl各个拷贝数浓度的变异系数均较低，对临床样本检验的特异性为100%。研究结论1、成功建立了HADV、HBoV、HMPV、HRSV这4种呼吸道病毒的单重实时荧光定量RT-PCR体系，经过检验，体系的灵敏度均达到10copies/μl，扩增效率高，重复性及特异性好。2、成功建立了HADV、HBoV、HMPV、HRSV这4种呼吸道病毒的多重实时荧光定量RT-PCR体系，经过检验，体系的灵敏度均达到10copies/μl，扩增效率高，重复性及特异性好。3、成功建立了HADV、HBoV、HMPV、HRSV这4种呼吸道病毒的HAND多重实时荧光定量RT-PCR体系，体系的灵敏度均达到102copies/μl，整体降低了1个数量级，但仍具有较高的灵敏度。体系的扩增效率高，重复性及特异性好。后续研究需对反应体系进行进一步的优化，希望能够提高反应的灵敏度与扩增效率。4、本实验所建立的多重实时荧光定量RT-PCR体系，可快速、准确地检测人腺病毒、人博卡病毒、人偏肺病毒、人呼吸道合胞病毒等四种呼吸道病毒，从模板的制备到结果的获得仅需要2个小时，有望为所有呼吸道病毒的快速、准确的多重鉴别诊断提供一种可能的方法。
参考文献：
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[9]. DNA等温扩增检测副溶血性弧菌的新技术研究[D]. 潘美. 青岛科技大学. 2016
[10]. 多重实时荧光RT-PCR快速检测四种呼吸道病毒的研究[D]. 向蕾. 中山大学. 2014
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