论文摘要
“温室效应”导致全球变暖,严重影响植物生长发育,导致作物产量降低。研究植物高温应答分子机制是目前国际上的热点问题之一。菠菜（Spinicia oleracea L.）是我国重要的绿叶蔬菜,研究其热应答分子调控机制,对利用分子标记辅助育种技术培育耐热抗病菠菜新品种具有重要意义。Pto-interacting 1（PTI1）基因编码丝氨酸/苏氨酸激酶,参与调控ROS平衡和MAPK信号通路,以及脂类代谢等多种过程,研究PTI1对高温应答调控作用将为深入解析植物高温应答分子机制提供重要信息。我们在菠菜基因组中发现4个编码PTI1蛋白的基因,其蛋白同源相似性达68.38%。我们克隆到Spo PTI1-3基因,其最大开放阅读框为1224bp,共编码407个氨基酸,理论分子质量为45.19k Da。Spo PTI1-3蛋白与多种植物的PTI1蛋白同源性都较高,且在多个不同物种间,PTI1蛋白的激酶结构域、磷酸化功能位点、半胱氨酸位点都较为保守。烟草瞬时表达结果表明Spo PTI1-3蛋白定位于细胞质和细胞核中。在菠菜六叶期不同组织器官中Spo PTI1-3基因在须根中的基因表达量最高,在第一对真叶中的基因表达量最低。在菠菜抽薹期不同组织器官中Spo PTI1-3基因在新茎中表达量最高,在老叶中表达量最低。荧光定量PCR分析表明,经37℃高温处理后,菠菜耐热材料Sp75叶片中Spo PTI1-3基因的表达量与对照组菠菜热敏感材料Sp73相比一直为下降趋势,这表明高温胁迫下Spo PTI1-3基因的表达受到抑制。但在200m M Na Cl、100m M Na2CO3,200m M Na HCO3以及200μM Cd Cl2处理下,Spo PTI1-3基因表达量均上升,这说明Spo PTI1-3响应盐胁迫及重金属胁迫。Spo PTI1-3基因的高温应答表达模式实验结果显示,37℃高温处理下,野生型酵母菌株与Spo PTI1-3过表达酵母菌株的生长皆受到抑制,但过表达酵母菌株与野生型相比对高温更加敏感,这说明高温胁迫下Spo PTI1-3基因起负调控作用。但在Spo PTI1-3基因在不同盐处理下的应答表达模式实验结果显示,在不同盐胁迫下,随着处理浓度的增加,酵母的生长状况也随之减慢,野生型与过表达酵母菌株相比对盐更加敏感。这表明Spo PTI1-3蛋白能够响应盐胁迫。酵母双杂交试验分析表明,Spo PTI1-3蛋白与Spo OXI1-1蛋白之间并无互作关系。过表达Spo PTI1-3基因后,拟南芥根长被抑制,但根毛数量明显增多,特别在突变体基因回补拟南芥表型中,此特征更为明显。并且过表达Spo PTI1-3拟南芥和基因回补拟南芥同对照组相比,抽薹期更早。这表明Spo PTI1-3蛋白与At PTI1-3蛋白相比,其功能可能更强。
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摘要Abstract第1章 文献综述 1.1 引言 1.2 PTI1 概述 1.2.1 植物蛋白激酶的结构和分类 1.2.2 PTI1 蛋白激酶家族 1.2.3 PTI1 分子生物学研究进展 1.3 植物高温胁迫应答分子机制研究进展 1.4 菠菜的研究进展 1.5 研究目的及意义 1.6 本试验技术路线第2章 材料与方法 2.1 试验材料 2.1.1 植物材料 2.1.2 菌株及质粒载体 2.1.3 试剂及试剂盒 2.1.4 试验所需试剂及培养基的配制 2.1.5 实验所需引物 2.2 试验方法 2.2.1 实验材料培养与处理 2.2.2 菠菜Sp75 PTI1-3 基因全长的获得 2.2.2.1 RNA的提取与反转录 2.2.2.2 RNA反转录 2.2.2.3 目的基因的扩增 2.2.2.4 目的片段的克隆及测序 2.2.3 菠菜Sp75 PTI1-3 基因生物信息学分析 2.2.4 RT-qPCR 2.2.5 载体构建 2.2.6 植物表达载体的农杆菌转化 2.2.6.1 液氮法转化农杆菌 2.2.6.2 农杆菌介导的拟南芥转化 2.2.6.3 纯合过表达拟南芥的筛选 2.2.6.4 CTAB法提取植物DNA 2.2.6.5 三引物法鉴定AtPTI1-3 拟南芥突变体 2.2.6.6 纯合拟南芥植株的耐热性鉴定 2.2.7 SpoPTI1-3 转基因酵母耐性分析 2.2.7.1 酵母的转化与鉴定 2.2.7.2 SpoPTI1-3 转基因酵母耐性鉴定 2.2.8 酵母双杂的实验步骤 2.2.8.1 制备感受态酵母菌 2.2.8.2 质粒共转酵母菌感受态 2.2.9 农杆菌介导的烟草瞬时表达第3章 结果 3.1 菠菜SpoPTI1-3 基因全长的克隆 3.1.1 菠菜叶片总RNA的提取 3.1.2 菠菜SpoPTI1-3 基因全长的获得 3.2 菠菜SpoPTI1-3 基因家族分析 3.2.1 SpoPTI1-3 基因全长的序列分析 3.2.2 PTI1 蛋白家族多重序列比对 3.2.3 PTI1 蛋白家族的系统发育分析 3.2.4 SpoPTI1-3 蛋白3D模型构建分析 3.3 SpoPTI1-3 蛋白的亚细胞定位 3.3.1 植物表达载体pBI121-GFP-PTI1-3 的构建 3.3.1.1 目的基因片段的获得及质粒载体的提取 3.3.1.2 pBI121-GFP-PTI1-3 重组质粒载体的验证 3.3.1.3 植物表达载体pBI121-GFP-PTI1-3 转化农杆菌 3.3.2 农杆菌介导的烟草瞬时表达 3.4 菠菜SpoPTI1-3 基因不同发育时期表达特性分析 3.4.1 菠菜不同发育时期下的生长表型 3.4.2 菠菜不同组织器官中SpoPTI1-3 基因表达水平 3.4.2.1 菠菜六叶期不同组织器官中SpoPTI1-3 基因的表达水平 3.4.2.2 菠菜抽薹期不同组织器官中SpoPTI1-3 基因的表达水平 3.5 菠菜高温处理下SpoPTI1-3 的表达水平 3.5.1 菠菜Sp75 高温处理不同时间下生长表型 3.5.2 菠菜Sp73和Sp75 高温处理下PTI1-3 的表达水平 3.5.3 菠菜Sp75 高温处理下SpoOXI1-1和SpoOXI1-2 基因表达水平 3.6 菠菜应答非生物胁迫条件下生长表型和SpoPTI1-3 基因表达水平 3.6.1 菠菜NaCl处理下的生长表型和SpoPTI1-3 基因的表达水平 3.6.1.1 菠菜在200mM NaCl处理下的生长表型 3.6.1.2 菠菜经200mM NaCl处理下SpoPTI1-3 基因表达水平 3.6.2 菠菜NaHCO3 处理下的生长表型和SpoPTI1-3 基因的表达水平 3.6.2.1 菠菜在200mM NaHCO3 处理下的生长表型 3.6.2.2 菠菜在200mM NaHCO3 处理下SpoPTI1-3 基因表达水平2CO3 处理下的生长表型和SpoPTI1-3 基因的表达水平'> 3.6.3 菠菜Na2CO3 处理下的生长表型和SpoPTI1-3 基因的表达水平2CO3 处理下的生长表型'> 3.6.3.1 菠菜在100mM Na2CO3处理下的生长表型2CO3 处理下SpoPTI1-3 基因表达水平'> 3.6.3.2 菠菜在100mM Na2CO3 处理下SpoPTI1-3 基因表达水平2 处理下的生长表型和SpoPTI1-3 基因的表达水平'> 3.6.4 菠菜CdCl2 处理下的生长表型和SpoPTI1-3 基因的表达水平2处理下的生长表型'> 3.6.4.1 菠菜在200μM CdCl2处理下的生长表型2处理下SpoPTI1-3 基因表达水平'> 3.6.4.2 菠菜在200μM CdCl2处理下SpoPTI1-3 基因表达水平 3.7 过表达SpoPTI1-3 基因酵母非生物胁迫应答表达模式 3.7.1 酵母表达载体pYES2-SpoPTI1-3 的构建 3.7.1.1 目的基因片段的获得及载体pYES2 的提取 3.7.1.2 pYES2-PTI1-3 重组质粒载体的验证 3.7.2 pYES2-SpoPTI1-3 酵母表达载体转酵母 3.7.3 过表达SpoPTI1-3 基因酵母高温应答表达模式 3.7.4 过表达SpoPTI1-3 基因酵母NaCl胁迫应答表达模式2CO3 胁迫应答表达模式'> 3.7.5 过表达SpoPTI1-3 基因酵母Na2CO3胁迫应答表达模式 3.7.6 过表达SpoPTI1-3 基因酵母NaHCO3 胁迫应答表达模式 3.8 酵母双杂技术检测SpoPTI1-3与SpoOXI1-1 的互作 3.8.1 酵母双杂载体构建 3.8.1.1 目的基因片段的获得及质粒载体的提取 3.8.1.2 pGADT7-SpoPTI1-3 重组质粒载体的验证 3.8.1.3 pGBKT7-SpoOXI1-1 重组质粒载体的验证 3.8.2 SpoPTI1-3与SpoOXI1-1 的互作关系 3.9 SpoPTI1-3 基因过表达植株构建与功能缺失突变体筛选 3.9.1 植物表达载体pBI121-SpoPTI1-3 的构建 3.9.1.1 目的基因片段的获得及质粒载体的提取 3.9.1.2 pBI121-SpoPTI1-3 重组质粒载体的验证 3.9.2 植物表达载体pBI121-SpoPTI1-3 转化农杆菌 3.9.3 利用花序侵染法获得T0 代拟南芥阳性转基因植株1 代过表达植株的筛选'> 3.9.4 T1代过表达植株的筛选2 代过表达植株的筛选'> 3.9.5 T2代过表达植株的筛选 3.9.6 AtPTI1-3 突变体分子检测0 代突变体拟南芥阳性转基因植株'> 3.9.7 利用花序侵染法获得T0代突变体拟南芥阳性转基因植株 3.9.8 SpoPTI1-3 回补拟南芥AtPTI1-3 突变体1代回补拟南芥植株的筛选'> 3.9.8.1 T1代回补拟南芥植株的筛选 3.9.9 菠菜SpoPTI1-3 基因对拟南芥表型的影响第4章 讨论 4.1 SpoPTI1-3 基因定位细胞质和细胞核中并参与根毛生长 4.2 在高温胁迫下SpoPTI1-3 基因起负调控作用 4.3 SpoPTI1-3 蛋白能够响应盐及重金属胁迫 4.4 SpoPTI1-3 信号通路第5章 结论参考文献攻读学位期间取得的研究成果致谢
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 董美辰
导师: 戴绍军
关键词: 菠菜,酵母双杂,基因表达
来源: 上海师范大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,生物学,园艺
单位: 上海师范大学
分类号: Q943.2;S636.1
总页数: 82
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标签：菠菜论文; 酵母双杂论文; 基因表达论文;
菠菜SpoPTI1-3基因克隆及其高温应答功能分析
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