论文摘要
Atrogin-1是一种保守的E3泛素连接酶,在饥饿和炎症性疾病后骨骼肌和心肌的萎缩和退化的早期阶段中起重要作用,是调节哺乳动物和鱼类骨骼肌质量的一种主要蛋白质。本实验克隆了黄鳝的atrogin-1基因的cDNA全长序列,得到了两种可变剪切体。黄鳝的atrogin-1 x1的mRNA序列为2361bp,包括1074bp的编码序列,编码357个氨基酸,预测质量为41.8kD,等电点（PI）为8.77。另一个可变剪切体atrogin-1x2的mRNA序列有2353bp,包括894bp的编码序列,编码298个氨基酸,预测质量为34.8kD,等电点（PI）为9.26。atrogin-1 x1与atrogin-1 x2只有5’端不同,表明调控他们表达的转录因子有可能不同;3’端非编码序列相同。预测的蛋白质序列都有40个氨基酸左右的F-box保守区域。对健康、喂食的黄鳝的心、肝胰腺（简称肝）、脾、头肾、体肾、前肠、后肠8个组织的组织表达进行了相对定量分析,以在各组织都能稳定表达的RPL17基因作为内参基因对表达量进行分析。结果显示与哺乳动物不同,atrogin-1 x1和atrogin-1 x2在所有被检查的黄鳝组织中普遍表达,在心、脾、骨骼肌相对表达量高。对黄鳝进行短期（7天）、中期（3个月）、长期（7个月）禁食处理,研究禁食对atrogin-1基因的表达影响,以及对上游转录因子FoxO基因、Akt基因表达影响。饥饿7天后atrogin-1 x1表达量上升但是不显著,饥饿3个月atrogin-1 x1表达量显著上升,饥饿7个月的黄鳝atrogin-1 x1的表达量反而下降了,可能由于长期饥饿,黄鳝进入休眠的应激状态。atrogin-1 x2表达变化不显著,趋势与atrogin-1 x1一致。Akt基因在短期、中期、长期饥饿状态下均显著表达。FoxO1/3基因在饥饿后7天表达量上升但是不显著,饥饿3个月后FoxO3表达量上升,7个月后回落。MYOD1基因受atrogin-1基因表达调控,趋势与其一致。LPS刺激组,对30±5g黄鳝腹腔进行10mg/kg的LPS注射。注射PBS组作为对照组,LPS联合使用细胞因子抑制剂AX024或酪氨酸激酶抑制剂AG490,确定了LPS可以由FoxO/atrogin-1信号通路引起黄鳝的肌肉萎缩,并受细胞因子和生长因子调控。
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摘要Abstract第一章 文献综述 1.1 黄鳝简介 1.1.1 黄鳝的生活习性和养殖现状 1.1.2 黄鳝的研究进展 1.2 骨骼肌萎缩的相关研究 1.2.1 骨骼肌萎缩的诱因 1.2.2 骨骼肌萎缩关键基因的研究进展 1.2.3 骨骼肌萎缩相关信号通路与调控机制 1.2.4 鱼类骨骼肌萎缩 1.3 饥饿对鱼类的肌肉萎缩的影响 1.4 LPS对鱼类的肌肉萎缩的影响 1.4.1 LPS的毒性 1.4.2 对鱼类的毒性 1.4.3 在鱼类免疫中的作用 1.4.4 LPS对骨骼肌萎缩的影响 1.5 研究目的与意义第二章 Atrogin-1基因克隆和序列分析 2.1 实验材料与方法 2.1.1 实验材料 2.1.2 主要试剂 2.2 实验方法 2.2.1 黄鳝组织取材 2.2.2 黄鳝组织RNA的提取（试剂盒法） 2.2.3 黄鳝组织cDNA第一链的合成 2.2.4 RACE法扩增atrogin-1的5’和3’末端 2.2.5 atrogin-1中间片段的扩增和测序 2.2.6 atrogin-1的序列全长拼接及分析 2.3 结果与分析 2.3.1 PCR结果 2.3.2 黄鳝atrogin-1基因序列分析 2.3.3 黄鳝atrogin-1氨基酸理化分析 2.3.4 黄鳝atrogin-1二级结构预测 2.3.5 atrogin-1 氨基酸序列同源性比对及系统进化树构建 2.4 讨论第三章 黄鳝atrogin-1 基因的表达分析 3.1 实验材料 3.2 实验步骤 3.2.1 RNA的提取 3.2.2 cDNA的合成 3.2.2.1 基因组DNA的去除反应 3.2.2.2 逆转录 3.2.3 Real Time PCR反应 3.2.3.1 引物合成 3.2.3.2 定量实验 3.2.4 数据处理 3.3 结果与分析 3.3.1 RNA的提取结果 3.3.2 用荧光定量PCR法检验黄鳝atrogin-1两种可变剪切体的组织表达特性 3.4 讨论第四章 禁食和LPS对萎缩相关基因的表达的影响 4.1 实验材料 4.2 实验方法 4.2.1 实验动物处理 4.2.2 荧光定量PCR反应 4.2.2.1 定量引物 4.2.2.2 定量实验 4.2.3 数据处理 4.3 实验结果与分析 4.3.1 饥饿对黄鳝萎缩通路相关基因表达的影响 4.3.2 脂多糖对黄鳝萎缩相关基因表达的影响 4.4 讨论 4.4.1 饥饿对骨骼肌萎缩的影响 4.4.2 脂多糖对骨骼肌萎缩的影响第五章 总结与展望 5.1 总结 5.1.1 黄鳝atrogin-1基因的克隆和组织表达 5.1.2 饥饿对黄鳝atrogin-1基因表达的影响 5.1.3 LPS刺激对黄鳝atrogin-1基因表达的影响 5.2 展望参考文献致谢
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 徐敏
导师: 钟其旺
关键词: 骨骼肌萎缩,基因克隆,信号通路
来源: 江西农业大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 江西农业大学
分类号: Q78
DOI: 10.27177/d.cnki.gjxnu.2019.000315
总页数: 55
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标签：骨骼肌萎缩论文; 基因克隆论文; 信号通路论文;
黄鳝肌萎缩基因atrogin-1的克隆及禁食和LPS刺激对FoxO/atrogin-1信号通路的表达调控
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