论文摘要
近年来,国际上关于非O157大肠杆菌,尤其是“big six”暴发流行的报道逐渐增多,已成为重要的食源性致病菌之一。食品加工及贮藏过程中,各种栅栏因子联合应用可对有害菌产生抑制甚至杀灭效应,但越来越多的研究发现它们有可能产生交叉保护作用,提高细菌的存活率,反而增大了食品风险。非O157大肠杆菌与O157相似,也具有较强耐酸性,目前关于热休克-酸应激对非O157大肠杆菌存活的影响,尤其是应激过程中应激基因、毒力基因表达的动态变化方面的研究少见报道。因此,本文首先调查牛粪和牛肉样本中非O157大肠杆菌的污染情况,并以最主要的血清型O26为对象进行盐酸乳酸耐受性比较;进一步选取乳酸耐受性不同的有毒菌株和无毒菌株,研究热休克-酸应激下菌株的存活、毒力基因表达的变化,以探讨热休克/酸适应与酸应激的联合效应;进而从细菌膜脂肪酸组成和应激基因的变化来研究热休克-酸应激时大肠杆菌O26的应激响应机制。1、牛源性大肠杆菌非O157的分离鉴定参考USDA检测方法,对样品进行选择性增菌,用多重PCR方法进行初步筛选,检测O抗原（O157、O121、O111、O103、O26）,阳性样本用选择性显色培养基Rainbow Agar分离纯化,可疑菌株用多重PCR方法鉴定O抗原,PCR-限制性片段长度多态性鉴定H抗原,并采用血清凝集实验进行验证,确认的阳性菌株采用多重PCR方法进行毒力基因（stx1、stx2、eae、hly）检测。结果显示,在153份牛粪和49份牛肉样本中,共40份样品检出一个或多个O血清型阳性,牛粪检出率高于牛肉,非O157阳性率为19.3%,0157的阳性率为0.50%;经分离纯化后,共鉴定出阳性菌株30株,其中O26最多（占73.3%）,O121、O103、O157分别占16.7%、6.7%、3.3%。毒力基因检测结果显示,分离自牛粪的一株O26:H11携带hly基因,分离自牛肉的两株O26:H11,一株stx1、hly阳性,另一株hly 阳性,这提示零售牛肉市场存在一定安全风险,应加强市场监督管理。2、热休克-酸应激对大肠杆菌O26存活及其毒力基因表达的影响在以上实验基础上,以分离到的最多的大肠杆菌血清型O26为实验对象,首先进行酸耐受试验,进一步选取乳酸耐受不同的有毒菌株和无毒菌株进行热休克-酸应激试验,以揭示热休克、酸适应处理对大肠杆菌O26乳酸应激后的存活及其毒力基因表达的影响。（1）大肠杆菌O26乳酸和盐酸耐受实验,分别在盐酸酸化的TSB（pH=2.0）、乳酸酸化的TSB（pH=3.5）中,37 ℃应激2 h,酸耐受结果表明,23株大肠杆菌026应激后菌数均显著下降（P<0.05）,但菌株之间存在差异,盐酸处理后,菌株133Z（hly+）存活率最高（92.92%）,而菌株G13Z1（stx1+、hly+）存活率最低（57.98%）,乳酸处理后,菌株43SZ存活率最高（91.08%）,菌株83Z3存活率最低（62.54%）。（2）根据乳酸耐受试验选取7株大肠杆菌O26菌株进行热休克-酸应激试验,实验组包括酸应激组、热休克酸应激组、酸适应酸应激组和热休克酸适应酸应激组。48℃水浴15 min制备热休克细胞,以乳酸酸化的TSB（pH=5.0）,37 ℃酸适应3h制备酸适应细胞,以未酸化TSB为对照,所有处理组在乳酸酸化的TSB（pH=3.0）中37℃分别应激2、4、6和8h,研究热休克-酸应激对大肠杆菌O26存活的影响。结果显示,各处理组均对细菌产生了抑制作用,其中5株菌受到乳酸抑制作用较强,热休克、酸适应提高它们在酸性条件下的存活能力,热休克-酸适应联合则可产生更强的交叉保护效应。还有2株菌热休克亦提高了它们的抗酸能力,但酸适应、热休克-酸适应并未对酸应激菌体产生交叉保护。热休克-酸应激对细菌存活的影响与菌株是否携带毒力基因并不存在相关性。（3）进一步采用Rea1-time PCR方法检测热休克-酸应激处理下各有毒株的毒力基因的表达,结果显示,菌株S433与110Z4乳酸应激后stx1基因表达上调,酸适应导致酸应激菌体表达下调,但热休克导致酸适应酸应激的菌体表达上调。hly基因,菌株S433和G13Z1经乳酸应激处理后表达均下调,热休克处理后导致酸适应酸应激的3株菌表达基本上调。综上,热休克和/或酸适应提高了大多数菌株抗酸能力,存活增强,表现出交叉保护作用,且热休克和/或酸适应导致一些菌株酸应激后stx1、hly基因表达上调,毒性增强,结果表明热休克和/或酸适应可增加酸应激细菌的危害。3、热休克-酸应激对大肠杆菌O26膜脂肪酸成分的影响根据上述存活情况,选取3株大肠杆菌O26,利用气相色谱技术检测热休克-酸应激4 h时细菌膜脂肪酸组成的变化,结果显示3株大肠杆菌O26热休克-酸应激后膜脂肪酸组成发生了变化。经酸应激处理后,3株菌除菌株S433酸应激组与热休克酸应激组外,其他各应激组均表现为USFA含量下降,SFA含量上升,U/S显著下降。热休克酸适应酸应激组的3株菌U/S下降最明显,降低了细胞膜的流动性,抑制了质子流入细胞。结果显示热休克酸适应对乳酸应激的大肠杆菌O26产生交叉保护作用,提高其存活的机制与细菌膜脂肪酸组成的改变、U/s 比值的降低有关。4、热休克-酸应激对大肠杆菌O26相关基因表达的影响采用Real-time PCR方法分析热休克-酸应激对大肠杆菌026一般应激基因（rpoS）、酸应激相关基因（asr、ycfR和gadA）和热应激基因（rpoH、DnaK、clpB和groEL）的表达差异,进一步揭示大肠杆菌026热休克-酸应激的响应机制。结果显示,热休克处理使得酸应激细菌rpoS基因表达上调,热休克酸适应与酸适应处理使得酸应激细菌rpoS基因表达发生了改变,rpoS基因的表达菌株间存在差异。除了菌株S433与G13Z1 2 h时gadA基因表达上调外,乳酸应激导致3株菌的酸应激相关基因表达显著下调。经热休克、酸适应处理后三株酸应激菌株asr、ycfR基因表达均上调;而热休克处理可使3株酸应激4 h菌株gadA基因表达均下调。酸适应导致3株菌热休克酸应激菌体asr基因表达基本下调。热休克致酸适应酸应激的3株菌gadA基因表达均下调、导致酸适应酸应激4 h的3株菌ycfR基因表达均上调。经单独乳酸应激后,3株菌的rpoH、groEL、clpB基因表达均显著下调,dnaK基因表达菌株间存在差异。经热休克、酸适应和热休克酸适应处理后3株酸应激菌株rpoH和groEL基因表达均显著上调,而clpB和dnaK基因表达菌株间存在差异;酸酸适应导致三株菌热休克酸应激的热应激基因表达菌株间存在差异;热休克导致三株菌酸适应酸应激的rpoH基因表达4 h均上调,导致菌株S433和G13Z1的clpB和dnaK基因表达均显著上调,其他基因表达菌株间存在差异。综上,结果表明,热休克和/或酸适应对酸应激菌体产生交叉保护作用的原因与rpoS、asr、ycfR、rpoH和groEL等基因的表达有关。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 禹金龙
导师: 江芸
关键词: 大肠杆菌,热休克酸应激,存活,膜脂肪酸,基因表达
来源: 南京师范大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,轻工业手工业
单位: 南京师范大学
分类号: TS201.3
DOI: 10.27245/d.cnki.gnjsu.2019.001781
总页数: 85
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