论文摘要
种子成熟是一个特异、复杂的发育过程,不仅是决定种子质量和产量的关键时期,也是影响种子贮藏质量的重要环节。然而目前人们对种子成熟调控机制的认识还相对薄弱。LncRNA是一类长度大于200nt、无编码蛋白能力的RNA,近些年的研究表明它们在真核生物中种类丰富且分布广泛,能够在表观遗传、转录及转录后水平调控基因的表达或直接影响蛋白功能。目前人们对植物lncRNAs的功能及作用机理有了一定的认识,它们在许多生物过程中均发挥着重要的作用,然而尚未见到lncRNA在种子成熟中的功能及其作用机制方面的报道。本研究利用实验室建立的种子成熟调控因子鉴定体系,从种子贮藏蛋白的角度鉴定了介导种子成熟调控的lncRNAs并对其作用机理进行了初步探索,主要研究结果如下:1.收集拟南芥4个发育时期（4、7、12、17 DAP）的种子,经高通量检测及生物信息学分析共得到64个响应种子成熟的lncRNAs候选基因,其中24个为上调基因,40个为下调基因;24个lncRNAs位于基因转录模块区域,35个为基因间lncRNAs,5个为反义lncRNAs。2.挑选了9个lncRNAs进行了基因克隆并构建到表达载体中,利用蘸花侵染将6个上调表达的lncRNAs转化入gus23（种子成熟报告基因体系）,3个下调表达的lncRNAs转化入野生型拟南芥,获得转基因纯合体后用于随后研究。3.通过GUS染色方法对6个转入gus23的基因是否参与种子成熟调控进行了初步分析,结果表明lncRNA-Seed9和lncRNA-Seed53可以导致gus23幼苗真叶出现GUS表型,暗示种子贮藏蛋白基因SSPs在这2个lncRNA过表达幼苗中异位表达。随后qPCR结果表明种子成熟调控因子LEC2与贮藏蛋白2S2基因在lncRNA-Seed53过表达幼苗中的表达量显著高于野生型。进一步对种子成熟主要调控因子在lncRNA-Seed53过表达植株种子中的表达情况进行了检测,结果表明在lncRNA-Seed53过表达植株7 DAP的果荚中LEC2基因有着较小幅度的上调表达;而在12 DAP的果荚中LEC1基因的表达量显著提高。这些结果表明lncRNA-Seed53是一个种子成熟的调控因子。4.对转基因植株种子及其它方面的表型进行了分析,结果表明lncRNA-Seed53过表达植株果荚短且饱满、果荚生长缓慢、种子大等表型,此外在幼苗期具有叶柄短、莲座叶圆且较小、早花、花苞紧凑且花瓣变短等表型。同时,我们也观察到lncRNA-Seed26过表达的种子萌芽受到抑制,并且植株具有萌芽晚,幼苗植株小的表型。5.为阐释lncRNA-Seed26和lncRNA-Seed53的调控机制进行了准备和初步探索。1)利用qPCR对2个lncRNAs的相邻基因表达情况进行了分析,结果表明lncRNA-Seed53可以抑制KIP1基因的表达;在lncRNA-Seed26过表达幼苗中TPPI基因的表达量提高,LRR基因的表达降低。2)为了深入研究这些lncRNAs的功能,我们针对lncRNA-Seed26和lncRNA-Seed53分别设计了两个gRNA靶点,构建了双gRNA靶点saCas9/gRNA载体,并进行了拟南芥转化。经筛选鉴定得到7株lncRNA-Seed26-CRISPR突变体植株,saCas9/gRNA载体编辑效率为2.083%;及3株lncRNA-Seed53-CRISPR突变体植株,saCas9/gRNA载体编辑效率为0.704%。3)我们通过生物信息学分析及重叠延伸PCR构建了35S:S1streptavidin-tagged lncRNA-Seed26载体,并筛选鉴定出T1代S1-lncRNA-Seed26转基因植株,这为了鉴定该lncRNA的靶标基因奠定了基础。这些研究结果拓展了人们对种子成熟调控网络的认识及对植物lncRNA生物学功能的理解,为深入展开这些lncRNAs的调控机制研究奠定了基础。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 谢鑫
导师: 边少敏
关键词: 拟南芥,种子成熟,基因表达,调控机理
来源: 吉林大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学,生物学
单位: 吉林大学
分类号: Q943.2
总页数: 91
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