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非洲猪瘟病毒无标签重组p54、B602L抗原的制备与应用

2020-12-02阅读(627)

非洲猪瘟病毒无标签重组p54、B602L抗原的制备与应用

论文摘要

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）血清学诊断方法主要有免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫转印试验,其中ELISA抗体检测方法有世界动物卫生组织（OIE）推荐的ELISA方法和商品化ELISA试剂盒,前者以病毒感染细胞提取抗原为检测抗原,只能在ASF参考实验室进行;后者供应量和检测敏感性均不能满足实际需要。非洲猪瘟病毒（ASFV）p54和B602L编码蛋白是强免疫原性抗原,尽管重组p54和B602L抗原国内已有报道,但均带组氨酸标签,不仅需用价格较贵镍亲和柱纯化,而且与带组氨酸标签重组亚单位疫苗免疫猪血清有交叉反应。本研究分别将ASFV p54和B602L与类弹性蛋白多肽（ELP）进行融合表达,用烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,旨在简化重组抗原制备工艺和避免融合标签引起的交叉反应。首先以不同融合方向分别将ASFV p54和B602L基因克隆入ELP融合表达载体,将重组载体 pELP-P54、pP54-ELP、pELP-B602L 和 pB602L-ELP 转化大肠杆菌,用 IPTG 诱导融合蛋白表达,结果显示P54-ELP和B602L-ELP融合蛋白不能表达,ELP-P54和ELP-B602L融合蛋白能有效表达。ELP-P54和ELP-B602L融合蛋白的相变温度分别为28℃和26℃。在0.5%Triton X-100和2mol/L氯化钠存在条件下,相变循环纯化的ELP-P54融合蛋白纯度大于90%,ELP-B602L融合蛋白纯度大于85%。用TEV蛋白酶活性包涵体切除融合蛋白的ELP标签,结果显示切割效率均大于95%,回收的无标签重组p54和B602L蛋白纯度大于90%。免疫转印试验显示无标签重组p54和B602L蛋白能被ASFV抗体阳性血清识别。分别以不同浓度重组p54和B602L蛋白为包被抗原,与不同稀释倍数ASFV抗体阳性和阴性血清进行ELISA反应,结果显示与抗体阴性血清反应阴性,与抗体阳性血清反应阳性,OD450值与血清稀释倍数呈良好的线性关系。用重组p54、B602L抗原与本课题组制备的无标签重组K205R抗原建立混合抗原ELISA方法,对47份ASFV感染存活猪血清进行检测,结果显示45份为ASFV抗体检测阳性,与p54抗原胶体金试纸条检测结果一致,检测敏感性为96%。用Ingenasa公司ELISA试剂盒对47份猪血清进行检测,结果显示23份血清为ASFV抗体检测阳性,4份为可疑,检测敏感性为49%。这些研究资料表明ASFV无标签重组p54和B602L抗原可以用于ASFV抗体检测。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词
  • 文献综述: 非洲猪瘟研究进展
  •   1. 非洲猪瘟病毒
  •     1.1 基因组与复制
  •     1.2 病毒粒子
  •     1.3 感染机制
  •     1.4 入胞途径
  •     1.5 基因表达与DNA复制
  •     1.6 病毒工厂形成
  •     1.7 内质网应激
  •     1.8 ASFV与细胞凋亡
  •     1.9 ASFV与细胞自噬
  •     1.10 子代病毒释放
  •     1.11 疫苗和抗病毒药物
  •   2. 非洲猪瘟诊断
  •     2.1 临床症状
  •     2.2 病理变化
  •     2.3 实验室诊断
  •       2.3.1 病毒学诊断
  •       2.3.2 血清学诊断
  •   参考文献
  • 研究目的与意义
  • 实验研究一: 非洲猪瘟病毒无标签重组p54和B602L抗原的制备
  •   1. 材料与方法
  •     1.1. 材料
  •       1.1.1. 试剂
  •       1.1.2. 主要仪器
  •       1.1.3. 生物材料
  •     1.2. 方法
  •       1.2.1. 表达载体的构建
  •       1.2.2. 融合蛋白表达与分析
  •       1.2.3. 融合蛋白纯化
  •       1.2.4. 融合蛋白纯化
  •       1.2.5. 标签切除与目的蛋白回收
  •       1.2.6. 免疫转印鉴定
  •       1.2.7. ELISA鉴定
  •   2. 结果
  •     2.1. 表达载体鉴定
  •     2.2. 融合蛋白表达
  •     2.3. 融合蛋白纯化
  •       2.3.1. 相变温度确定
  •       2.3.2. 氯化钠浓度确定
  •     2.4. 融合蛋白纯化
  •       2.4.1. ELP-P54融合蛋白
  •       2.4.2. ELP-B602L融合蛋白
  •     2.5. 蛋白酶切割时间优化
  •     2.6. 目的蛋白回收
  •     2.7. 免疫转印鉴定
  •     2.8. ELISA鉴定
  •   3. 讨论
  •   参考文献
  • 实验研究二: 非洲猪瘟病毒无标签重组p54和B602L抗原的应用
  •   1. 材料与方法
  •     1.1. 材料
  •       1.1.1. 试剂
  •       1.1.2. 主要仪器
  •       1.1.3. 生物材料
  •     1.2. 方法
  •       1.2.1. 表达载体的构建
  •       1.2.2. 融合蛋白的表达与分析
  •       1.2.3. 融合蛋白的分离纯化
  •       1.2.4. 标签切除与目的蛋白回收
  •       1.2.5. 胶体金试纸条检测
  •       1.2.6. Ingenasa ELISA试剂盒检测
  •       1.2.7 无标签混合抗原ELISA抗体检测
  •   2. 结果
  •     2.1 胶体金试纸条检测
  •     2.2 Ingenasa ELISA检测
  •     2.3 混合抗原ELISA检测
  •   3. 讨论
  •   参考文献
  • 全文总结
  • 附录
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的学术论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张晓凯

    导师: 孙怀昌,杜元钊

    关键词: 非洲猪瘟病毒,无标签重组抗原,制备,应用

    来源: 扬州大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 扬州大学

    基金: 国家重点研发计划项目(2017YFNC0201303,2018YFC08404004),江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)

    分类号: S852.651

    DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000326

    总页数: 65

    文件大小: 3522K

    下载量: 250

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