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永生化猪口腔黏膜上皮细胞系的建立及猪圆环病毒2型和口蹄疫病毒增殖特性的研究

2020-12-02阅读(806)

永生化猪口腔黏膜上皮细胞系的建立及猪圆环病毒2型和口蹄疫病毒增殖特性的研究

论文摘要

口腔黏膜上皮细胞是机体重要的屏障,但也是许多病毒和细菌入侵机体的主要靶标途径。正常组织细胞寿命有限。原代猪口腔黏膜上皮细胞（porcine oral mucosal epithelial cells,POMECs）通常在经过12次传代之后衰老死亡。永生化细胞系可为病毒相关疾病的研究提供良好的体外细胞模型。猪圆环病毒2（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus-associated diseases,PCADs）的主要病原,给国内外养猪业造成了巨大的经济损失。然而,目前还没有合适的细胞模型用于体外研究PCV2的致细胞病变效应（cytopathic effects,CPE）,这严重制约了对PCV2致病机制的研究。口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）侵袭易感动物（特别是猪、牛、羊等偶蹄家畜）,以发热、黏膜或者皮肤（尤其是口腔和蹄叉部位）出现水疱为主要特征,但是因缺乏合适的动物细胞系,其致病机理的研究也受到了严重限制。本研究分离培养了原代POMECs,通过导入人端粒酶逆转录酶基因（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）和G418抗性筛选获得了hTERT介导的永生化猪口腔黏膜上皮细胞系（hTERT-POMECs）,同时在连续传代的过程中获得了一株自发永生化的猪口腔黏膜上皮细胞系（Spontaneous immortalized POMECs,Sp-POMECs）,初步研究了PCV2或FMDV感染猪的口腔黏膜上皮细胞的基本特性,获得了以下研究结果。1.分离培养了仔猪口腔黏膜上皮细胞。比较组织块法、胰酶消化法、DispaseⅡ处理联合组织块法和DispaseⅡ处理联合胰酶消化法,发现DispaseⅡ处理联合组织块法是获得纯净POMECs的最优方法。形态学和间接免疫荧光试验表明所得到的POMECs具备典型的铺路石状上皮样细胞特征,表达角蛋白Pan-CK,不表达Vimentin。细胞增殖实验和细胞周期分析表明所得到的早期原代POMECs具有良好的增殖能力,但会随传代次数的增加迅速衰老。2.获得了永生化猪口腔黏膜上皮细胞系（hTERT-POMECs）,已传代150代。用脂质体转染法将真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代POMECs中,通过G418抗性筛选获得了hTERT介导的永生化猪口腔黏膜上皮细胞系（hTERT-POMECs）。端粒酶活性检测及Western blot表明hTERT基因成功导入了原代POMECs。细胞增殖实验和细胞周期分析表明hTERT使得POMECs细胞具有了连续良好分裂增殖的能力。间接免疫荧光试验表明hTERT-POMECs具有复层鳞状上皮细胞的分子特征,表达角蛋白Pan-CK、CK14和CK13,不表达CK18和Vimentin。核型分析表明第100代hTERT-POMECs的核型为2n=38,由一对性染色体（X,Y）和18对常染色体组成,符合家猪染色体核型分类标准,无染色体异常。裸鼠致瘤试验表明第80代hTERT-POMECs不具有致瘤性。3.获得一株自发永生化的猪口腔黏膜上皮细胞系（Sp-POMECs）,已传代150代。连续传代的原代POMECs突破了Hayflick界限,发生了自发永生化。形态学、细胞增殖实验、细胞周期分析、间接免疫荧光、核型分析和裸鼠致瘤试验表明,Sp-POMECs形态呈现典型铺路石样,具有良好的连续分裂增殖性能,表达角蛋白Pan-CK、CK14和CK13,不表达CK18和Vimentin,基本保持了原代POMECs的形态学和生物学特征,无染色体异常和肿瘤转化。4.PCV2和FMDV均能感染hTERT-POMECs和Sp-POMECs,致细胞发生病变,具有良好的复制增殖能力。免疫荧光或PCR表明,PCV2和FMDV均能感染hTERT-POMECs和Sp-POMECs;实时荧光定量PCR和TCID50试验表明,PCV2或FMDV在hTERT-POMECs和Sp-POMECs中的复制增殖能力都高于在PK-15细胞中的复制增殖能力。综上所述,本研究分离培养了原代POMECs,通过转入hTERT和G418抗性筛选获得了永生化细胞系hTERT-POMECs,同时在传代的过程中获得了自发永生化的细胞系Sp-POMECs。PCV2和FMDV均能有效感染hTERT-POMECs和Sp-POMECs,引起细胞病变,具有良好的复制增殖能力。表明猪口腔黏膜上皮细胞是研究猪病毒性疾病的良好细胞模型,建立的永生化细胞系hTERT-POMECs和Sp-POMECs为PCV2和FMDV致病机制的研究提供了重要的实验材料。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 文献综述
  •   第一章 口腔黏膜上皮细胞研究进展
  •     1.1 口腔黏膜的结构和功能
  •     1.2 口腔黏膜上皮细胞和免疫
  •     1.3 口腔黏膜上皮细胞和疾病
  •     1.4 口腔黏膜上皮细胞的角蛋白表达特异性
  •       1.4.1 角蛋白的分子生物学
  •       1.4.2 角蛋白表达具有组织和细胞特异性
  •       1.4.3 口腔黏膜上皮细胞中角蛋白的表达
  •     1.5 口腔黏膜上皮细胞的分离
  •     1.6 口腔黏膜上皮细胞的培养
  •       1.6.1 口腔黏膜上皮细胞的原代培养方法
  •       1.6.2 口腔黏膜上皮细胞的培养条件
  •       1.6.3 口腔黏膜上皮细胞体外培养中的污染问题
  •       1.6.4 口腔黏膜上皮细胞培养环境
  •     1.7 口腔黏膜上皮细胞的生物学特性
  •       1.7.1 细胞鉴定
  •       1.7.2 克隆形成率
  •       1.7.3 细胞生长曲线的测定
  •     1.8 口腔黏膜上皮细胞的组织工程应用
  •     1.9 展望
  •   第二章 端粒及端粒酶与细胞永生化研究进展
  •     2.1 端粒的结构和功能
  •       2.1.1 端粒结构
  •       2.1.2 端粒功能
  •     2.2 端粒酶的结构和功能
  •     2.3 细胞的永生化
  •       2.3.1 端粒酶使细胞永生化机制
  •       2.3.2 端粒酶永生化细胞研究进展
  •     2.4 衰老和癌症的端粒-端粒酶理论
  •     2.5 展望
  • 试验研究
  •   第三章 新生仔猪口腔黏膜上皮细胞的分离与培养
  •     3.1 材料
  •       3.1.1 试验用动物
  •       3.1.2 主要试剂
  •       3.1.3 主要仪器设备
  •     3.2 方法
  •       3.2.1 组织采集
  •       3.2.2 主要细胞培养液的配置
  •       3.2.3 仔猪口腔黏膜上皮细胞的原代培养
  •       3.2.4 仔猪口腔黏膜上皮细胞传代培养
  •       3.2.5 仔猪口腔黏膜上皮细胞的纯化
  •       3.2.6 仔猪口腔黏膜上皮细胞的观察与鉴定
  •     3.3 结果
  •       3.3.1 原代细胞的培养
  •       3.3.2 POMECs分离培养方法的比较
  •       3.3.3 仔猪口腔黏膜上皮细胞的传代培养
  •       3.3.4 仔猪口腔黏膜上皮细胞的形态学特征
  •       3.3.5 仔猪口腔黏膜上皮细胞鉴定
  •       3.3.6 仔猪口腔黏膜上皮细胞生长曲线
  •       3.3.7 仔猪口腔黏膜上皮细胞周期
  •     3.4 讨论
  •     3.5 小结
  •   第四章 hTERT介导的永生化猪口腔黏膜上皮细胞系的建立
  •     4.1 材料
  •       4.1.1 细胞、质粒和主要试剂
  •       4.1.2 主要仪器设备
  •     4.2 方法
  •       4.2.1 细菌培养液的配置
  •       4.2.2 pCI-neo-hTERT质粒的转染
  •       4.2.3 端粒酶活性检测
  •       4.2.4 Western blot检测转染细胞中外源性hTERT基因的表达
  •       4.2.5 hTERT-POMECs的细胞生长曲线
  •       4.2.6 细胞生长周期检测
  •       4.2.7 hTERT-POMECs细胞标志分子的间接免疫荧光鉴定
  •       4.2.8 PCR检测hTERT-POMECs中免疫相关基因的表达
  •       4.2.9 POMECs非显带染色体核型分析
  •       4.2.10 裸鼠致瘤性试验
  •     4.3 结果
  •       4.3.1 pCI-neo-hTERT质粒浓度和纯度测定
  •       4.3.2 pCI-neo-hTERT质粒鉴定
  •       4.3.3 POMECs G418最佳筛选浓度的确定
  •       4.3.4 pCI-neo-hTERT转染后筛选永生化细胞系
  •       4.3.5 hTERT基因成功表达于hTERT-POMECs中
  •       4.3.6 hTERT-POMECs的细胞生长曲线
  •       4.3.7 hTERT-POMECs的细胞生长周期
  •       4.3.8 hTERT-POMECs的免疫荧光鉴定
  •       4.3.9 hTERT-POMECs具有原代POMECs的基本生物学功能
  •       4.3.10 hTERT-POMECs细胞核型分析
  •       4.3.11 hTERT-POMECs的致瘤性试验
  •     4.4 讨论
  •     4.5 小结
  •   第五章 自发永生化猪口腔黏膜上皮细胞系的筛选与鉴定
  •     5.1 材料
  •     5.2 方法
  •       5.2.1 Sp-POMECs的获得
  •       5.2.2 Sp-POMECs的细胞生长曲线
  •       5.2.3 Sp-POMECs细胞标志分子的间接免疫荧光鉴定
  •       5.2.4 Sp-POMECs的核型分析和致瘤性分析
  •     5.3 结果
  •       5.3.1 Sp-POMECs的生长及其细胞形态
  •       5.3.2 Sp-POMECs的细胞生长曲线
  •       5.3.3 Sp-POMECs的鉴定
  •       5.3.5 Sp-POMECs的核型分析
  •       5.3.6 Sp-POMECs的致瘤性分析
  •     5.4 讨论
  •     5.5 小结
  •   第六章 猪圆环病毒2型和口蹄疫病毒在POMECs中的增殖特性
  •     6.1 材料
  •       6.1.1 毒株和细胞
  •       6.1.2 主要试剂
  •       6.1.3 主要仪器设备
  •     6.2 方法
  •       6.2.1 细胞准备和病毒接种
  •       6.2.2 免疫荧光
  •       6.2.3 PCR检测PCV2
  •       6.2.4 实时荧光定量PCR
  •       6.2.5 TCID50滴定病毒滴度
  •       6.2.6 病毒的复制曲线
  •     6.3 结果
  •       6.3.1 PCV2感染致POMECs细胞病变
  •       6.3.2 免疫荧光和PCR鉴定PCV2感染POMECs
  •       6.3.3 PCV2感染POMECs的增殖特性
  •       6.3.4 FMDV感染致POMECs发生病变
  •       6.3.5 FMDV感染POMECs的免疫荧光鉴定
  •       6.3.6 FMDV感染POMECs的增殖特性
  •     6.4 讨论
  •     6.5 小结
  • 结论
  • 本论文的创新点
  • 参考文献
  • 附录
  • 主要缩略词和中英文对照表（Abbreviation Index）
  • 致谢
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 崔红杰

    导师: 张彦明

    关键词: 猪口腔黏膜上皮细胞,细胞永生化,猪圆环病毒型,口蹄疫病毒,增殖特性

    来源: 西北农林科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 西北农林科技大学

    基金: 陕西省科技统筹创新工程计划项目(No. 2014KTCQ02-02),重点科技创新团队项目(No.2013KCT-28)

    分类号: S852.651

    总页数: 100

    文件大小: 7118K

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