CRISPR/Cas13b系统对猪流行性腹泻病毒增殖的抑制作用

论文摘要

【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利用CRISPR/Cas13b的RNA干扰功能对PEDV的基因组RNA进行切割,以探索一种新型的PEDV病毒抑制策略。【方法】设计了4对靶向PEDV基因组不同区域的CRISPR RNA（crRNA）位点,构建了CRISPR/Cas13b打靶载体,以打靶载体转染Vero细胞,并利用PEDV感染转染细胞,检测PEDV在CRISPR/Cas13b转染细胞内的增殖情况。【结果】CRISPR/Cas13b系统对PEDV在Vero细胞的增殖具有明显的抑制作用。打靶载体U6-crRNA3和U6-crRNA4转染组相较于正常细胞组,病毒免疫荧光试验中荧光团明显减少;定量PCR结果显示,打靶载体转染组在细胞水平抑制50%以上病毒增殖量。【结论】本研究构建的CRISPR/Cas13b系统能有效抑制PEDV增殖,为开发有效的RNA病毒防控手段、建立抗病动物模型提供了新的研究策略。

论文目录

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 试验方法

1.2.1 crRNA的设计与合成

1.2.2 CRISPR/Cas13b系统打靶质粒的制备

1.2.3 PEDV病毒培养和TCID50测定病毒滴度

1.2.4 CRISPR/Cas13b转染

1.2.5 病毒感染

1.2.6 免疫荧光试验

1.2.7 荧光定量PCR检测细胞上清病毒含量

1.2.8 数据分析

2 结果与分析

2.1 U6-crRNA载体构建

2.2 U6-crRNA和Cas13b质粒共转染Vero细胞抑制PEDV的增殖

2.2.1 IFA检测细胞中PEDV增殖情况

2.2.2 定量PCR检测细胞上清中病毒增殖情况

3 讨论与结论

3.1 CRISPR/Cas13b系统

3.2 影响CRISPR/Cas13b切割效率的原因

3.3 CRISPR/Cas13b系统的应用

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 梅彦,杨化强,吴珍芳

关键词: 猪流行性腹泻病毒,系统,打靶质粒,病毒,基因编辑

来源: 华南农业大学学报 2019年06期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华南农业大学动物科学学院,温氏研究院

基金: 广东省科技计划项目(2017B020201009)

分类号: S852.651

页码: 1-7

总页数: 7

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CRISPR/Cas13b系统对猪流行性腹泻病毒增殖的抑制作用

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