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里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ在不同碳源诱导下的糖基化

2020-12-08阅读(826)

里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ在不同碳源诱导下的糖基化

论文摘要

当前,石油等不可再生能源日益匮乏,化石燃料燃烧所带来的环境问题也日益严重,开发清洁的可再生能源已成为当下最紧迫的任务之一。木质纤维素的储存量十分庞大,而且价格低廉。将木质纤维素转化为液体燃料纤维素乙醇,既可以有效地缓解能源危机,又能保护生态环境,还能使潜在的资源被充分挖掘利用。在这一生物炼制过程中,纤维素酶的作用尤为突出。纤维素酶是高度糖基化的,通过改造纤维素酶的糖基化修饰来提高酶的活性,进而提高纤维素的水解效率是一个新的突破口。而如果想对纤维素酶的糖基化进行改造,需要首先对纤维素酶糖基化的位点和糖链的结构进行系统的了解。本文以纤维素酶高产菌株Trichodermareesei RutC-30和纤维素酶低产菌株Trichodermareesei QM9414为研究对象,系统的研究了里氏木霉纤维二糖水解酶I（以下简称TrCBHI）在乳糖、纤维二糖和丰富培养基诱导下的糖基化修饰情况。将六种目的蛋白分离纯化,然后通过混合酶解（gluC+trypsin和chymotrypsin）的方法分别处理目的蛋白,将获得的肽段用ZIC-HILIC色谱柱进行分离,收集糖肽后分别采用碰撞诱导裂解（CID）和电子转移裂解（ETD）这两种破碎方式使糖肽解离,最后用LC-MS/MS进行分析。质谱数据分析结果显示（1）发现N64上有高甘露糖型的N-糖链修饰。在T.reesei RutC-30和T.reesei QM9414的TrCBH I中均鉴定到了N64上有糖基化修饰,且糖链形式为高甘露糖型。（2）N45上除了有杂合型的糖链,还有高甘露糖型的糖链修饰。（3）TrCBH I的CD区普遍存在O-糖基化修饰。以前对TrCBH I的CD区的O-糖基化的研究很少,只有近期的一篇文献中报道其S20、S21和T24上各有一个HexNAc修饰。而在本研究中,鉴定出11个新的O-糖基化位点,如S8、T10、T232、S396等。在这些O-糖基化位点上,通常有1～4个Hex或者1～2个HexNAc修饰。（4）TrCBH I的CBM区有新的O-糖基化位点T484。以前只有一篇文献报道CBM的Thr462和Ser464上有1～3个Man修饰。本研究中,将T.reesei RutC-30在乳糖诱导下,发现其TrCBH I中484位置上的苏氨酸上有单个的Hex修饰。（5）TrCBH I的CD区的糖基化位点趋于形成糖基化簇。在TrCBH I的CD区,发现5个糖基化簇,它们分别是N270/T271/S272/S396,T232/T255,T383/N384/T389,S8/T10 和 N45/S46。其中,N45/S46和S8/T10位于催化活性位点隧道入口附近,而T383/N384/T389位于与纤维素晶体最接近的肽环上,从而暗示了这三个糖基化簇可能与底物识别或者对底物的催化活性有关。通过横向分析来看,不同菌株在同一碳源诱导下TrCBH I的糖基化修饰情况不同,不仅如此,同一菌株在不同碳源诱导下TrCBH I的糖基化修饰情况也不同。从菌株上来看,与T.reesei QM9414相比,纤维素酶高产菌株T.reesei RutC-30的糖基化更为多样化和复杂化,且同一位点上糖链的异质性较严重。而从诱导方式上来看,乳糖诱导下的TrCBH I的糖基化位点更丰富,糖链的形式更为多样。通过对纤维素酶高产菌株T.reese/RutC-30和纤维素酶低产菌株T.reesei QM9414在不同碳源诱导下的糖基化进行系统的研究,深入挖掘出更多糖基化修饰的位点和糖链,使人们对TrCBH I的糖基化了解的更全面,为后续对糖基化进行改造进而提高纤维素酶的水解活性奠定了坚实的理论基础。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略符号说明
  • 第一章 绪论
  •   1.1 纤维素酶的分类及协同作用机制
  •   1.2 纤维素酶的糖基化
  •     1.2.1 纤维素酶的N-糖基化
  •     1.2.2 纤维素酶的O-糖基化
  •   1.3 纤维素酶糖基化的功能
  •     1.3.1 TrCBHI的N-糖基化的作用
  •     1.3.2 TrCBHI的O-糖基化的作用
  •   1.4 糖肽富集方法简介
  •   1.5 糖基化的鉴定方法
  •     1.5.1 碰撞诱导解离（CID）及其在糖肽鉴定中的作用
  •     1.5.2 电子转移解离（ETD）及其在糖肽鉴定中的作用
  •   1.6 课题意义及立题依据
  • 第二章 TrCBH I的制备
  •   2.1 实验材料与实验试剂的配制
  •     2.1.1 实验菌株
  •     2.1.2 实验所用的培养基及溶液的配方
  •     2.1.3 实验所用的仪器和材料
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 粗酶液的制备及前处理
  •     2.2.2 TrCBH I的分离纯化
  •     2.2.3 SDS-PAGE检测
  •     2.2.4 染色
  •     2.2.5 脱色
  •   2.3 结果和讨论
  •     2.3.1 六种粗酶液中蛋白的定性检测
  •     2.3.2 六种条件下TrCBHI的纯化结果
  •   2.4 本章小结
  • 第三章 TrCBHI的质谱分析与糖基化形式
  •   3.1 实验所用材料和试剂
  •     3.1.1 实验所用的溶液及试剂
  •     3.1.2 常用的仪器和材料
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 溶液内消化
  •     3.2.2 胶内消化
  •     3.2.3 用ZIC-HILIC色谱柱分离糖肽
  •     3.2.4 糖肽的浓缩冻干
  •     3.2.5 质谱分析流程
  •   3.3 结果和讨论
  •     3.3.1 T.reesei RutC-30在乳糖诱导下TrCBHI的糖基化修饰情况
  •     3.3.2 T.reesei RutC-30在纤维二糖诱导下TrCBHI的糖基化修饰情况
  •     3.3.3 T.reesei RutC-30在丰富培养基诱导下TrCBHI的糖基化修饰情况
  •     3.3.4 T.reesei QM9414在乳糖诱导下TrCBHI的糖基化修饰情况
  •     3.3.5 T.reesei QM9414在纤维二糖诱导下TrCBHI的糖基化修饰情况
  •     3.3.6 T.reesei QM9414在丰富培养基诱导下TrCBHI的糖基化修饰情况
  •   3.4 本章小结
  • 第四章 基于TrCBHI糖基化位点的三维结构分析
  •   4.1 用Pymol作TrCBHI的三维结构图
  •     4.1.1 “Surface”形式的蛋白三维结构图的制作
  •     4.1.2 “Cartoon”形式的蛋白质三维结构图的制作
  •   4.2 分析和讨论
  •     4.2.1 CD结构域糖基化位点的三维结构分析
  •     4.2.2 CBM结构域糖基化位点的三维结构分析
  •   4.3 本章小结
  • 全文总结与展望
  • 附录
  • 参考文献
  • 致谢
  • 硕士期间发表的论文
  • 学位论文评卸及答辩情况表

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 马亚楠

    导师: 王明钰

    关键词: 里氏木霉,纤维二糖水解酶,碳源诱导,糖基化

    来源: 山东大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,环境科学与资源利用

    单位: 山东大学

    分类号: X705;Q936

    总页数: 116

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