曹根涛[1]2004年在《人类基因CREB4和4.10的克隆和功能研究》文中指出从我们的大规模cDNA克隆和测序计划中,利用表达谱基因芯片筛选的结果并通过生物信息学分析,我们选取了2条基因进行进一步的研究,以探讨这些基因的功能。外界刺激通过细胞内的蛋白激酶反应链,将信号从细胞膜传导到核,导致相关转录因子的磷酸化和被激活,从而引起基因表达的变化。cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-responsive element binding protein,CREB)也许是其中最具特点的刺激诱导转录因子我们实验室克隆了一个人类CREB的新基因(CREB4),该基因编码一个395个氨基酸的蛋白,并与小鼠的CREB3高度同源。RT-PCR显示CREB4在胰腺、前列腺、脑和骨骼肌组织中表达,在小肠、外周血白细胞、睾丸和胸腺组织中低表达,而在成人胎盘、心脏、脾脏、卵巢、肾脏、肝脏、肺和结肠组织中未检测到特异性条带,在检测的各肿瘤组织中显示CREB4基因只在结肠癌 (CX-1和GI-112)、肺癌(LX-1)、前列腺癌(PC-3)和胰腺癌(GI-103)有表达,而在乳腺癌(GI-101)、卵巢癌组织(GI-102)和肺癌组织(GI-117)中未测到特异性条带。通过生物信息学将CREB4定位于人染色体1q21.3。表达谱芯片结果显示CREB4基因在肝癌组织上调。GFP荧光定位显示全长CREB4定位与细胞质内,而去C端的突变体定位与细胞核。采用酵母双杂交系统以寻找与CREB4相互作用的蛋白。我们发现CREB4可以与核孔复合物相关蛋白TPR及kayopherinα2相互作用,而这两个蛋白都与蛋白质的核转运有关,推测CREB4可能通过它们进入细胞核。蛋白4.1是红细胞中以血影蛋白(spectrin)为基础的细胞膜骨架的一个基本成分,在维持红细胞质膜的形态和机械性能方面起着至关重要的作用。我们克隆了一个新的蛋白4.1基因(4.1O)。该基因全长2312bp,编码一个553氨基酸的蛋白。RT-PCR显示4.1O只在 卵巢组织中检测到特异性条带,在胎胸腺组织和胎脑组织中低表达。生物信息学分析显示4.1O含有14个外显子和13个内含子,定位于人染色体9q21-9q22区段上。表达谱芯片结果提示4.1O基因在肝癌组织和胃癌组织中表达上调。
王鑫[2]2007年在《人类CRBN基因的克隆及功能初步研究》文中研究说明从我们的大规模cDNA克隆和测序计划中，利用表达谱基因芯片筛选的结果并通过生物信息学分析，我们选取了与疾病相关的人类CRBN基因(cereblon)进行进一步的研究，以探讨该基因的功能。精神发育迟缓(MR)疾病严重影响我国国民素质。MR的研究目前仍然较少。发病率最高的轻型MR研究更少。MR的发生与遗传有密切关系。CRBN是第一个被发现的常染色体隐性遗传非综合征精神发育迟缓(ARNSMR)致病基因，它还可能和一些显性MR相关，但它的功能研究几乎是空白。在我们分离到CRBN基因之后，对该基因进行了基础生物信息学分析，显示了CRBN包含N端一半的LON蛋白酶结构域，可能属于线粒体ATP依赖性蛋白酶家族，在染色体上全长29692bp，定位于染色体3p36.2区段。RT-PCR结果显示CRBN在脾、前列腺、肝、胰腺、胎盘、肾中高表达，在肺、骨胳肌、卵巢、小肠、外周血白细胞、结肠和脑中低表达，但在心、胸腺组织中没有表达。它在睾丸中的高表达显示了其在生殖细胞中可能有重要作用。有报道称鼠源CRBN与大电导Ca~(2+)激活K~+通道的胞质C端a亚基有直接相互作用，而大电导Ca~(2+)激活K~+通道的表达可降低细胞蛋白酪氨酸磷酸化，由于人源CRBN与鼠源CRBN氨基酸有93％相似度，因而CRBN也可能因此影响到信号转导途径，而不仅仅与学习记忆有关。将CRBN及其致病突变体分别构建于真核表达载体pEGFP-C1，GFP荧光定位结果显示正常CRBN及突变型的CRBN均定位于AD293全细胞中，由于CRBN在定位于线粒体的同时也定位于细胞核及细胞质，这提示了CRBN可能参与能量代谢以外的生命活动。在原核表达系统中，通过与pGEX4T1质粒构建融合质粒，IPTG诱导表达得到了正常CRBN及突变型CRBN蛋白，并对正常CRBN蛋白进行了亲和纯化，通过SDS-PAGE结果显示，纯化结果并非单一蛋白，这可能是由于非目标蛋白与CRBN蛋白相互作用而被间接纯化，也有可能是在纯化过程中发生了蛋白降解现象，具体未知蛋白尚待研究。
孙婧[3]2013年在《牛初级卵泡体外培养体系的建立和miR-27a在小鼠颗粒细胞中的功能的研究》文中认为体外培养145-170gm牛腔前卵泡能够形成卵泡腔已有人报道,但体外培养50-70μm的牛初级卵泡能否发育成腔仍没有报道。为了建立适合牛初级卵泡体外生长发育的培养体系,同时进一步揭示牛腔前卵泡体外发育的相关机制,本实验以屠宰场获取的牛卵巢为材料,以机械分离法获取直径50-70μm的牛初级卵泡,以α-MEM为基础培养基,调整不同浓度促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)和雌二醇(E2)激素配比以及优化碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)添加量等试验,使用胶原包被的叁维培养方法对牛初级卵泡进行体外培养13或21天(d),观察卵泡直径以及成腔的变化,并用Real-Time PCR检测卵泡发育及成熟相关基因：芳香化酶(CYP19A1)、抗缪勒激素(AMH)、生长分化因子9(GDF-9)、骨形成蛋白15(BMP-15)以及m型转化生长因子p受体(TGFβR3)的表达。结果发现,以α-MEM为基础培养基,0.25μg/mL FSH+5IU/mL LH+0.1μg/mL E2+50ng/mL bFGF组以及FSH+LH+E2+bFGF和25ng/mL EGF联合处理组卵泡直径在体外培养21d时显着高于其他组(p<0.05),并且在培养第19d和17d形成小的卵泡腔,成腔率分别为16.7%和33.3%。卵泡发育、成熟相关基因CYP19A1,AMH, GDF-9,BMP-15和TGFβR3的表达也有显着变化。综上,我们建立了一套有效的体外促进牛初级卵泡生长和成熟的培养体系,即α-MEM+FSH(0.25μg/mL)+LH(5IU/mL)+E2(0.1μg/mL)+bFGF(50ng/mL)+EGF(25ng/mL);MicroRNA(miRNA)是近年来发现的一类长度为20-25nt的小干扰RNA,它通过对基因的转录后调控,在细胞的增殖、分化、凋亡等方面发挥重要作用。本实验在之前牛初级卵泡培养的基础上,发现miR-27a在牛卵巢中表达较高,但由于条件限制,我们利用小鼠模型来探讨miR-27a对颗粒细胞功能的影响。我们发现,miR-27a在小鼠腔前卵泡颗粒细胞中表达较高,但在有腔卵泡颗粒细胞中表达明显下降。因此,本实验通过体外高效转染技术,将miR-27a模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor)转入小鼠颗粒细胞中,利用Real-Time PCR、流式细胞术等实验方法检测miR-27a和相关基因的表达以及观察其对颗粒细胞增殖和激素分泌的影响。结果发现：miR-27a有促进颗粒细胞凋亡、抑制颗粒细胞增殖、抑制颗粒细胞分泌雌激素的功能,它可能是通过下游的靶基因CREB1来影响颗粒细胞的凋亡和雌激素分泌,但具体机理还需进一步验证。
李晓[4]2016年在《内质网应激调节蛋白LRF在小鼠子宫内膜蜕膜化中的作用》文中研究表明Luman recruiting factor(LRF)又叫做CREB3 regulate factor(CREBRF),它是一个内质网应激相关的亮氨酸拉链蛋白转录因子。LRF是CREB家族成员Luman的负反馈调节因子,它一方面通过募集Luman进入核小体而抑制Luman的活化,另一方面与Luman结合而加速Luman蛋白的降解。在小鼠分娩与产后期,LRF通过抑制糖皮质激素压力信号进而抑制HPA轴的活性。LRF基因敲除鼠中糖皮质激素受体表达异常升高,PRL的表达下降,导致产后母鼠母性行为缺失。LRF在发情周期和早期胚胎植入过程中的小鼠子宫中呈规律性表达,在妊娠小鼠第6-7 d子宫的初级蜕膜区及次级蜕膜区的表达量很高。提示LRF在小鼠子宫中的表达可能受甾类激素的调节,而且,LRF可能在胚胎植入或蜕膜化过程中有一定的作用。本试验应用qRT-PCR、western blot、免疫组化、慢病毒干扰等技术检测了(1)甾类激素对LRF在小鼠子宫中表达的调控作用;(2)LRF干扰后对小鼠胚胎植入以及蜕膜化的影响;此外,研究了LRF干扰后对基质细胞体外诱导蜕膜化的影响。1.扩增了LRF基因的CDS区的全长序列,选取叁个LRF的干扰靶点,并用T4连接酶将上述碱基序列重组入慢病毒载体。转化入E.coli DH5α感受态细菌后,挑取单克隆进行PCR鉴定与测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒与包装质粒用转染试剂TuboFect共转入HEK 293T细胞进行病毒包装。将得到的慢病毒感染HEK 293T细胞进行慢病毒滴度测定。运用qRT-PCR和Western blot技术检测LRF过表达和干扰慢病毒在NIH 3T3细胞中的过表达与干扰效果。包装的LRF过表达慢病毒能显着升高外源的LRF蛋白的表达。包装的shLRF干扰慢病毒中pCD513B-U6-shLRF-2205片段可以显着干扰LRF蛋白的表达。LRF干扰与过表达慢病毒的运用,对进一步研究LRF在小鼠中的生理学功能具有重要意义。2.运用western blot、免疫组化等技术检测了在甾类激素E2和P4的作用下,LRF蛋白在卵巢摘除小鼠子宫和基质细胞中的表达。结果显示,P4能显着上调LRF蛋白在卵巢摘除的小鼠子宫和原代基质细胞中的表达,并且以时间依赖的方式上升。而且,孕酮受体拮抗剂米非司酮(RU486)能显着的下调LRF的表达。尽管E2处理卵巢摘除小鼠与原代基质细胞后LRF蛋白的表达没有明显的变化,但是,与孕酮处理组相比,E2与P4联合处理组中LRF蛋白的表达显着下调。而且,与E2组、对照组相比,在雌激素受体拮抗剂氟维司(ICI 182780)群处理组,LRF蛋白的表达显着上调。这些结果表明,LRF在小鼠子宫与基质细胞中的表达经由P4-PGR通路调节,而且雌激素能够部分地抑制P4上调的LRF表达。3.运用shLRF干扰慢病毒感染怀孕第3天的小鼠子宫,可以显着减少妊娠第7-8 d胚胎植入位点的大小与重量。在体外诱导蜕膜化的基质细胞模型中,LRF蛋白和mRNA表达随着人工诱导蜕膜化进程而显着升高。shLRF干扰慢病毒感染基质细胞并诱导蜕膜化,蜕膜化标记因子dPRP、IGFBP-1和PGR的表达下调,蜕膜化进程也受到抑制。运用流式细胞术检测体外蜕膜化基质细胞的细胞周期与细胞凋亡发现,shLRF干扰慢病毒感染基质细胞后对细胞凋亡没有明显的影响。但是,蜕膜化基质细胞的细胞周期在LRF干扰以后被阻滞在了S期。qRT-PCR检测与S期细胞周期相关的或者与蜕膜化相关的细胞周期调节因子发现,shLRF慢病毒干扰蜕膜细胞后,cyclin A与cyclin B1的mRNA表达显着降低,而cyclin D3与cyclin E的mRNA表达没有变化。因此,本试验说明了LRF参与小鼠子宫基质蜕膜化的调节,并通过调节细胞周期因子cyclin A与cyclin B1进而调节蜕膜化进程。本研究证实了内质网应激的相关蛋白-LRF在小鼠子宫中的表达受甾类激素的调控;而且,LRF通过调节细胞周期相关基因cyclin A和cyclin B1的表达参与基质细胞蜕膜化的调节。揭示了LRF参与雌性小鼠生殖系统的生理调节,并为进一步研究LRF在哺乳动物生殖过程中的作用提供了一个起点,也为对内质网应激与哺乳动物生殖之间的关系理解添加了一个新的方向。
洪毅[5]2009年在《自噬体形成和UPR信号通路激活在心肌慢性缺氧适应中意义的研究》文中指出背景与目的:紫绀型先心病是临床常见的先天性畸形,心肌慢性缺氧是此类患者共同的病理生理过程。心肌慢性缺氧适应是促进心肌细胞存活和生长的关键,但是心肌慢性缺氧适应的确切机制尚不清楚。低氧时,内质网中蛋白质正确折迭发生障碍,导致未折迭蛋白和异常折迭蛋白质的堆积,引起内质网应激(ER stress)。未折迭蛋白反应(UPR)是内质网应激时适应性代偿的重要信号通路之一。内质网应激同时能够增强细胞自噬能力。细胞自噬和UPR被认为可能是缓解内质网应激的重要途径。深入研究慢性缺氧对心肌细胞中细胞自噬和UPR的活化及可能作用,将有助于深化对心肌慢性缺氧适应的认识。本实验分别在紫绀型先天性心脏病患儿心肌组织标本中观察细胞自噬变化;在心肌组织标本和体外培养的心肌细胞慢性缺氧模型上,研究慢性缺氧对心肌细胞中UPR活性变化的影响,并探讨细胞自噬和UPR在心肌慢性缺氧适应中的意义。研究方法:本研究分叁部分:第一部分:统计分析2008年在我科行先心病手术治疗患儿的临床特征和恢复、预后的关系;第二部分:选取紫绀型和非紫绀型先天性心脏病患儿,收集手术中切除的肥厚右室流出道心肌组织。透射电镜观察心肌细胞中自噬体的形成;western blotting检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的变化,检测细胞自噬的变化;免疫组化观察GRP78/Bip在心肌组织中的表达;提取心肌组织的总RNA,采用RT-PCR检测GRP78/Bip和XBP-1s mRNA表达水平;提取心肌组织的总蛋白,应用Western blot检测XBP-1s蛋白表达水平,PERK、eEF2α磷酸化水平以及ATF6f的表达水平;第叁部分:体外培养H9c2大鼠心肌细胞株,将细胞暴露于1% O2、5% CO2的环境中建立缺氧细胞模型,培养不同时间段后,提取心肌细胞的总RNA,应用RT-PCR检测GRP78/Bip和XBP-1s mRNA表达水平的变化;提取心肌细胞的总蛋白,应用Western blot检测第二部分实验指标的变化。研究结果:主要结果如下:1、紫绀型先心病患者在术前心肌酶谱、术中转流时间、术后ICU监护时间和心包引流量方面显着高于非紫绀型先心病患者。说明紫绀型先心病患者虽然在术前与非紫绀型先心病患者差异不大,但实际病情更重,预后差,恢复时间长;2、紫绀型先天性心脏病患儿心肌组织中可观察到自噬体的存在,且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显着升高,提示细胞自噬作用增强;3、与非紫绀组相比,紫绀型先天性心脏病患儿心肌组织中GRP78/Bip蛋白表达明显增强(p < 0.001)。免疫组化检测表明GRP78/Bip在胞浆中有较强的表达。相似的,GRP78/Bip mRNA表达水平显着升高(p < 0.01);4、紫绀型先心病患儿心肌组织中PERK活性和ATF6活性均显着增强(p < 0.001),但是IRE1活性无显着变化(p > 0.05);5、体外细胞实验研究发现:在缺氧条件下UPR活性表现出缺氧时间依赖性的变化。其中,IRE1在缺氧的最初6小时内升高最快,6小时左右达到高峰,此后逐渐降至正常对照水平;PERK活性在12小时左右达到高峰,此后维持在较低但高于对照水平; ATF6活性在24小时内逐渐升高,在12小时左右达到高峰,此后维持在较低但高于对照水平;结论:1.紫绀型先心病患者术前存在一定程度的心肌损害,表现为术前心肌酶谱升高。2.首次观察到紫绀型先心病患儿心肌组织中细胞自噬体形成,UPR叁条信号通路激活,尤其ATF6和PERK信号通路活性增加明显。3.建立H9c2心肌细胞株慢性缺氧细胞模型;慢性缺氧时IRE-1信号通路早期活性升高,随后逐渐降低至正常水平,ATF6和PERK信号通路活性水平均出现先逐渐升高后稳定在高水平的趋势。综上所述,自噬体形成和UPR信号通路激活对慢性缺氧条件下,心肌细胞的存活和功能调节可能有重要意义。
王滨[6]2014年在《肝癌细胞抵抗Bcl-2抑制剂的分子机制及相关增敏措施研究》文中研究表明研究背景及目的：肝细胞癌是目前严重危害人类健康的肿瘤之一，目前在所有肿瘤中发病率居第五位，死亡率排在第叁位，尤其在中国，乙肝相关的肝硬化导致肝癌发病率极高。目前对于肝细胞癌的治疗方法，以手术切除为主，辅助以放疗、化疗治疗，但是，很多病人在临床诊断时已经失去了手术指征，因此治疗效果不佳、五年生存率不高，亟需找到安全、有效的治疗方法。有报道表明抗凋亡Bcl-2家族成员的过表达与肝癌病人的分级、预后以及治疗抵抗密切相关，是治疗肝细胞癌的重要靶点。Bcl-2家族是一类调控细胞存活与程序性死亡的蛋白家族，家族成员主要分为叁个亚类，抗凋亡的Bcl-2家族成员(Bcl-2，Bcl-xL，Mcl-1，Bcl-w，A1等)、促凋亡的BH3样蛋白(Bim，Noxa，Puma，Bid，Bad等)和凋亡过程的执行者(Bak，Bax)，叁类蛋白之间相互作用的平衡对于维持细胞的的稳态以及存活状态十分重要。针对Bcl-2抗凋亡家族成员的功能和结构特点，目前已开发出一系列天然或人工合成的小分子化合物抑制剂，它们通过与促凋亡成员竞争性结合抗凋亡家族成员，释放促凋亡的Bak、Bax或BH3样蛋白，诱导凋亡的发生。多种Bcl-2靶向抑制剂相继进入了临床I~III期实验，在多种肿瘤尤其是白血病和非小细胞肺癌的单药治疗以及联合用药中都显示出了良好的治疗前景。有研究表明，一些类型的肿瘤对Bcl-2抑制剂并不敏感，易发生耐药，肝细胞癌便是其中的代表之一。但目前对导致肝细胞癌中Bcl-2抑制剂抵抗的原因及机制尚不清楚，可能的原因为Mcl-1的上调、保护性自噬的诱导以及凋亡相关基因的缺失等。本研究以肝细胞癌细胞株为模型，主要目的是探究Bcl-2抑制剂在肝癌细胞中发生抵抗的分子机制，并通过阐明相关的抵抗机制来制定有效的增敏策略，从而使得Bcl-2抑制剂能够有效地杀伤肝癌细胞以达到较好的临床疗效。主要研究内容：第一部分Bcl-2/xL抑制剂ABT-263在肝癌细胞中上调Mcl-1的分子机制研究1.验证Mcl-1上调是否是导致肝癌细胞对ABT-263抵抗的机制；2.检测ABT-263处理肝癌细胞后Mcl-1分子的mRNA和蛋白水平；3.通过荧光素酶报告基因实验验证ABT-263是否活化了Mcl-1的基因转录，通过RNA稳定性实验验证ABT-263是否增加了Mcl-1mRNA的稳定性；4.利用Western blot检测Mcl-1相关磷酸化位点的磷酸化水平，结合激酶相关通路的抑制剂探究其是否能够影响Mcl-1的表达水平；5.通过CCK-8、台盼蓝染色、流式细胞仪计数等功能学实验验证相关通路的抑制剂能否增敏ABT-263杀伤肝癌细胞的作用。第二部分Bcl-2/xL抑制剂ABT-737在肝癌细胞中诱导保护性自噬的分子机制研究1. ABT-737在处理肝癌细胞时，Bcl-2表达水平的不同是否会导致肝癌细胞对ABT-737敏感性的差异；2.探究ABT-737在高表达Bcl-2的肝癌细胞中诱导保护性自噬的分子机制。第叁部分Bcl-2抑制剂左旋棉酚杀伤肝癌细胞的增敏措施及相关分子机制研究1.验证Hsp90抑制剂17-AAG是否能够增敏左旋棉酚杀伤肝癌细胞的作用；2.17-AAG增敏左旋棉酚的分子机制探究，是否通过抑制保护性细胞自噬；3.17-AAG抑制保护性自噬的机制是否通过影响自噬关键蛋白的稳定性；4.17-AAG抑制保护性自噬和部分逆转Mcl-1表达上调的机制是否是通过抑制ERK的活化；5. PI3K/mTOR双抑制剂BEZ-235增敏左旋棉酚杀伤肝癌细胞的分子机制研究。主要研究方法：1.肝癌细胞系PLC/PRF/5, Hep3B, HepG2和Huh7的体外培养及传代；2. qPCR和Western blot检测相关分子mRNA和蛋白的表达水平；3.通过瞬时转染siRNA或者过表达质粒的方法可以实现基因的敲低或过表达；4.荧光素酶报告基因实验和RNA稳定性实验探究ABT-263上调Mcl-1mRNA的分子机制；5.蛋白合成抑制实验和Western blot来探究ABT-263上调Mcl-1蛋白水平的分子机制；6. CCK-8，台盼蓝计数以及流式细胞计数检测细胞的生长抑制、细胞死亡以及凋亡情况；7.通过荧光显微镜观察不同处理因素后胞内GFP-LC3小点的聚集情况，进而反映细胞内的自噬水平；8.免疫共沉淀实验检测蛋白之间是否存在可能的相互作用。主要研究结果：1. ABT-263诱导Mcl-1表达上调是肝癌细胞对其抵抗的重要机制；2. ABT-263可以通过增加Mcl-1的mRNA稳定性来使其表达上调，同时ABT-263还可以通过以下两个主要通路增加Mcl-1蛋白的稳定性：通过活化ERK和JNK促进Mcl-1Thr163磷酸化水平增加蛋白的稳定性，通过活化Akt进而抑制GSK-3β的活性来减少Mcl-1蛋白的降解；3. ERK、JNK以及Akt相关通路的抑制剂可以增敏ABT-263对于肝癌细胞的杀伤作用；4. ABT-737在高表达Bcl-2的肝癌细胞系中可以通过ROS的产生进而诱导保护性的细胞自噬，导致耐药的发生；5.17-AAG和BEZ-235能够增加左旋棉酚对于肝癌细胞的杀伤作用；6.17-AAG通过抑制ERK的活化，而不是影响自噬关键蛋白的稳定性来部分逆转左旋棉酚介导的保护性自噬；7.17-AAG和BEZ-235分别通过抑制ERK以及mTOR的活化进而部分逆转左旋棉酚介导的Mcl-1表达上调。结论：肝癌细胞通过上调Mcl-1的表达水平以及诱导保护性细胞自噬来抵抗Bcl-2抑制剂，ERK、JNK、Akt等通路抑制剂及17-AAG可通过抑制相关的抵抗机制而增敏Bcl-2抑制剂的抗肿瘤作用。
张琳[7]2013年在《腺苷A2a受体在甲状腺细胞的表达及其在Graves病患者血清lgG诱导VEGF表达中作用的研究》文中提出研究背景：Graves病(Graves Disease, GD)是一种常见的危害人类健康的自身免疫性内分泌疾病。GD患者的特征性表现为甲状腺肿伴明显的毒性症状,肿大的甲状腺产生过量的甲状腺激素,作用于全身组织和器官,引起甲状腺毒症,同时甲状腺内血流速度的加快并有丰富的血管形成。大部分患者甲状腺肿越明显,甲状腺内血管越丰富,病情越难控制,药物治疗疗程越长,探讨甲状腺肿及血管化形成的机制对GD的治疗十分重要。传统观点认为,GD患者的血清中针对甲状腺细胞TSH受体的特异性自身抗体,即TSH受体抗体(TSH receptor antibodies, TRAb),与TSH受体结合后激活腺苷酸环化酶信号系统,导致甲状腺细胞增生和甲状腺激素合成、分泌增加。因此早期研究中,TRAb被认为是GD的主要致病因素,也是引起甲状腺细胞增生从而引起甲状腺肿的主要致病因子。除长期持续的TRAb激活引起的甲状腺细胞的增生外,生长因子表达的增加也被认为是甲状腺肿发生的重要原因,其中以血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的作用较为突出。生长因子以内分泌、旁分泌和自分泌等方式,广泛而精细的地调节甲状腺细胞及其周边细胞的生长、分化和功能,参与甲状腺疾病的发生发展过程。但甲状腺自身抗体如何影响生长因子表达进而在甲状腺肿形成中发挥作用的机制仍不清楚。腺苷是ATP及cAMP的代谢产物,其本身也能够与细胞膜上的腺苷受体结合,通过细胞内的第二信使进一步发挥作用。1992年Ledent等通过将腺苷A2a受体(Adenosine A2a Receptor, A2aR)与甲状腺球蛋白(Thyroglobulin, TG)启动子相连接而建立了甲状腺肿大合并功能亢进的小鼠模型,病理切片显示该小鼠的甲状腺增生明显并有大量的血管形成。因此我们假设,A2aR可能在GD甲状腺肿发生的过程中起到一定作用。此前腺苷A2a受体作为VEGF转录表达的上游调节受体已在其他组织细胞被广泛研究,目前甲状腺上尚未有A2aR与VEGF关系的相关报道。腺苷A2a受体的激活促进血管形成机制的研究大部分集中在肿瘤组织血管新生及缺氧环境诱发血管生成上。缺氧和应激引起腺苷生成增加,A2aR被激活后促进细胞内低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factors-1alpha, HIF-1alpha)进入细胞核,与VEGF启动子上HIF-1alpha结合位点HIF反应原件(HIF-responsive elements, HRE)相结合,直接促进VEGF的转录。近期报道显示,过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1alpha (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Co-activator Protein1alpha, PGC-1alpha)及Ser133磷酸化的cAMP反应原件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, p-CREB)均能够在不依赖于HIF-1alpha的情况下独立促进VEGF的转录。既往研究表明,p-CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha的表达均与细胞内cAMP的升高有关,而A2aR作为Gs蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors, GPCR),其激活可引起细胞内cAMP的水平明显增高。因此我们认为,A2aR可能通过cAMP/p-CREB/PGC-1alpha/HIF-1alpha引起VEGF表达增加。本项目证实腺苷A2a受体存在于甲状腺细胞膜,且有功能活性；A2aR参与Graves病患者自身抗体调节甲状腺细胞VEGF表达,其可能机制是：GD IgG作用于甲状腺细胞,引起cAMP的产生增加,一方面直接通过cAMP/p-CREB/PGC-1alpha/HIF-1alpha引起VEGF表达增加；另一方面,cAMP降解使得细胞外腺苷水平升高,从而激活A2aR,进一步引起细胞内cAMP的增多。目的：1、确定A2aR在大鼠甲状腺细胞(Fisher rat thyroid cell line-5, FRTL-5)、人甲状腺原代细胞、大鼠甲状腺、小鼠甲状腺及人甲状腺中的mRNA和蛋白表达。2、通过A2aR激动剂或粗提甲亢患者血清IgG (GD IgG)刺激甲状腺细胞,观察VEGF mRNA和蛋白表达的变化,初步探讨GD IgG及A2aR与VEGF表达的关系。3、通过A2aR激动剂或粗提甲亢患者血清IgG刺激甲状腺细胞,检测CREB、p-CREB、PGC-1alpha, HIF-1alpha的蛋白水平,探讨GDIgG及A2aR引起VEGF分泌增加的可能机制。4、通过注射特异性表达人TSH受体的腺病毒建立GD小鼠模型,检测p-CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha、VEGF的蛋白水平,进一步探讨GDIgG引起VEGF分泌增加的可能机制。5、利用A2aR特异性阻断剂及A2aR特异性小干扰RNA (Small Interfering RNA, siRNA)处理细胞,检测‘VEGF、p-CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha的表达,探讨A2aR在GDIgG所引起的VEGF表达增加中所起的作用。6、分别使用GD IgG、A2aR特异性激动剂、A2aR特异性阻滞剂处理后获得的甲状腺细胞上清,刺激人脐静脉内皮原代细胞(Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC),检测其增殖情况,探讨GDIgG及A2aR处理后甲状腺细胞对内皮细胞增殖的影响。研究方法：1、细胞培养：1) FRTL-5细胞根据相应参考文献及ATCC细胞培养标准使用Coon's改良的Ham's F12培养液中加入6种激素进行培养。2)人甲状腺原代细胞人甲状腺组织剪碎,Ⅰ型胶原酶与胰酶混合液中37℃消化40-60min,过滤后洗涤沉淀并种板,使用含新生牛血清及TSH的DMEM/F12培养基培养。3)人脐静脉内皮细胞以0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA注入脐静脉,细胞分散后洗涤并种板,以含有胎牛血清及成纤维细胞生长因子的M199培养基培养。4)大鼠神经元原代细胞新生大鼠脑组织剪碎,0.25%胰蛋白酶消化后过滤洗涤并种板,以含有胎牛血清、葡萄糖、胰岛素和P-氨基苯酸的DMEM培养液培养。2、动物模型：通过肌肉注射表达人TSH受体的腺病毒建立GD小鼠模型。3、临床病例收集和粗制IgG的提取：收集初发GD患者,取空腹静脉血,采用电化学发光法检测血清TRAb浓度,采用甲状腺B超测量甲状腺体积,并用PEG沉淀法提取血清IgG。4、采用RT-PCR检测A2aR mRNA的表达和VEGF各剪接体mRNA水平变化。5、采用Western Blotting检测A2aR、p-CREB、CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha, VEGF及beta-actin蛋白水平变化。6、采用免疫荧光及免疫组化方法检测A2aR、p-CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha、VEGF在甲状腺组织及细胞中的表达,H&E染色了解组织结构。7、A2aR基因沉默：采用电转法以A2aR特异性siRNA转染FRTL-5细胞以沉默A2aR表达。8、采用酶联免疫分析检测甲状腺细胞内外VEGF蛋白水平。9、采用直接免疫分析方法检测细胞内外cAMP的含量。10、采用MTT及EdU方法检测内皮细胞增殖情况。结果：1、A2aR甲状腺细胞中的表达：在FRTL-5细胞、人甲状腺原代细胞、大鼠甲状腺中均扩增出与阳性对照相同的mRNA片段；Western Blotting证实FRTL-5细胞及人甲状腺原代细胞均有与阳性对照相同的蛋白表达；免疫荧光及免疫组化染色证实A2aR蛋白在FRTL-5细胞、人甲状腺原代细胞、大鼠甲状腺、小鼠甲状腺、人甲状腺细胞细胞膜上均有表达。A2aR的特异性激动剂可引起FRTL-5细胞内cAMP剂量依赖性的升高(P<0.05)。2、正常培养FRTL-5细胞中可以扩增出4个VEGF亚型：VEGF188, VEGF164, VEGF144和VEGF120,其中,VEGF120和VEGF164是主要成分；人甲状腺原代细胞中则可以扩增出以下4个VEGF亚型：VEGF189, VEGF165, VEGF145和VEGF121,其中,VEGF121和VEGF165是主要成分。与对照组相比,A2aR特异性激动剂CGS21680和粗提GD患者血清IgG均可剂量依赖性增加I FRTL-5细胞和人甲状腺原代细胞VEGF mRNA各剪接体的表达(P<0.05)。FRTL-5细胞内外的VEGF蛋白也随着CGS21680的作用剂量依赖性地增加(P<0.05)。3、磷酸化CREB、PGC-1alpha及HIF-1alpha均是能够与VEGF启动子结合并促进其转录的转录因子。GD IgG及CGS21680均能增加FRTL-5细胞中p-CREB、 PGC-1alpha及HIF-1alpha的表达。与对照组相比,腺苷酸环化酶(Adenylyl cyclase, AC)的特异性激活剂Forskolin可增加FRTL-5细胞中PGC-1alpha、HIF-1alpha及VEGF的表达。而PKA的特异性抑制剂H89可阻断GD IgG及CGS21680对PGC-1alpha和p-CREB表达的促进作用。4、免疫组化证实,在通过注射表达TSH受体腺病毒建立的GD小鼠模型中,甲状腺VEGF、p-CREB、PGC-1alpha表达均较对照组增加,HIF-1alpha变化不明显。5、A2aR特异性阻滞剂可阻断GD IgG对VEGF mRNA及p-CREB和PGC-1alpha表达的促进作用。在FRTL-5细胞中沉默A2aR后,GD IgG对VEGF、p-CREB、 PGC-1alpha和HIF-1alpha表达的促进作用均减弱。6、取处理后的FRTL-5细胞上清培养内皮细胞,GD IgG及CGS21680处理后的细胞上清可促进内皮细胞的增殖；提前加入ZM241385预处理的FRTL-5细胞上清促进内皮细胞增殖的能力较仅有GD IgG处理的细胞上清减弱。结论：1、A2aR在FRTL-5细胞、人甲状腺原代细胞、大鼠甲状腺、小鼠甲状腺及人甲状腺中均有表达,且该受体蛋白表达于细胞膜。激活A2aR增加细胞内cAMP的含量。2、GD IgG刺激甲状腺细胞可经A2aR激活cAMP/p-CREB/PGC-1alpha/HIF-1alpha通路,增加VEGF表达。3、GD IgG通过增加甲状腺细胞的VEGF分泌促进血管内皮细胞的增殖。
参考文献：
[1]. 人类基因CREB4和4.10的克隆和功能研究[D]. 曹根涛. 复旦大学. 2004
[2]. 人类CRBN基因的克隆及功能初步研究[D]. 王鑫. 华东师范大学. 2007
[3]. 牛初级卵泡体外培养体系的建立和miR-27a在小鼠颗粒细胞中的功能的研究[D]. 孙婧. 中国农业大学. 2013
[4]. 内质网应激调节蛋白LRF在小鼠子宫内膜蜕膜化中的作用[D]. 李晓. 西北农林科技大学. 2016
[5]. 自噬体形成和UPR信号通路激活在心肌慢性缺氧适应中意义的研究[D]. 洪毅. 第叁军医大学. 2009
[6]. 肝癌细胞抵抗Bcl-2抑制剂的分子机制及相关增敏措施研究[D]. 王滨. 第叁军医大学. 2014
[7]. 腺苷A2a受体在甲状腺细胞的表达及其在Graves病患者血清lgG诱导VEGF表达中作用的研究[D]. 张琳. 山东大学. 2013
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