栅藻Desmodesmus armatus B38扩大培养工艺及其生物活性物质研究

论文摘要

微藻营养价值丰富,含有多种高附加值的生物活性化合物。本文以生物量、蛋白质和多糖含量为指标进行优势微藻的筛选;对筛选出的栅藻（Desmodesmus armatus B38）进行培养条件优化和全营养素分析,评价其作为食品或饵料的潜在利用价值;对蛋白质和多糖进行分离纯化,研究其活性及结构鉴定;对微藻进行饵料的研制与开发,主要结果如下:以15株热带微藻为研究对象,对其生物量、多糖含量和蛋白质含量进行分析比较。其中藻株B38蛋白质和多糖含量分别为49.00±1.35%和5.37±0.03,在15株热带微藻中最具开发潜力,且适合高密度培养。经形态和分子生物学鉴定,其为栅藻（Desmodesmus armatus B38）。通过全营养素分析确定了栅藻（Desmodesmus armatus B38）的营养价值,发现栅藻中含有丰富的营养成分,碳水化合物、油脂、灰分、粗纤维、蛋白质分别占藻粉干重的 13.86%、14.00%、4.28%、3.52%、49.00%,能量为 377.44 kcal。可作为动物体营养物质的来源。栅藻中含有多种脂肪酸,且含有生物体生长所需要的C18:2（n-6）（亚油酸）和C18:3（n-6）（亚麻酸）,但含量较低;栅藻含有18种氨基酸,包括8种必须氨基酸和两种鲜味氨基酸,其中必须氨基酸的SRCAA值为100,表明具有较多的游离氨基酸。栅藻中维生素除VB3和VE外,其他维生素种类欠缺,含量较低。栅藻富含多种矿物质元素,其中钠、钾、钙、镁、铁、锌含量较为丰富,可作为动物体必须微量元素的来源,且重金属铅、镉、汞、砷、锡、镍、铬的含量均低于限定标准。对栅藻（Desmodes armatus B38）培养条件进行优化,通过单因素实验确定了最佳的氮源（硝酸盐）、碳源（碳酸氢盐）和光照强度（108μmol m-2 s-1）。采用Plackett-Burman实验设计,初步筛选了对栅藻生物量有显著影响的变量。这些变量通过中心组合设计（CCD）-响应面法（RSM）进一步优化,以获得高生物量和营养成分,并对BG11培养基进行了重组,重组后的培养基为:0.93gL-1硝酸钠,0.04gL-1磷酸氢二钾,0.15 gL-1硫酸镁,0.07 g L-1碳酸氢钠,且最优的生长条件为:温度27℃,光照强度108μmol m-2 s-1,pH 7.00和通气量0.50 L min-1。在上述条件下,培养12天后,生物量,蛋白质含量和多糖含量分别从原来的0.96±0.11gL-1,49±2.37%和5.37±0.25%提高到 1.65±0.15g L’ 53.61±1.25%和 6.15±0.43%,生物量增加 1.7 倍。最后,将优化条件运用到室外800 L光生物反应器中大规模培养。为探索蛋白质和多糖的利用价值,首先对蛋白质和多糖进行优化提取,并对提取的蛋白质和多糖进行结构和性质分析。采用Box-Behnken响应面设计,对蛋白质提取条件进行优化,最佳的提取条件为:pH 11.0;超声功率600 W;提取时间24 min;提取温度20℃;料液比1:15,通过实验验证,最佳提取条件有效,最终,栅藻蛋白质的提取率从53.55±0.98%提高到63.24±0.83%。通过测定,栅藻蛋白质等电点pI=4.3。在pH 12.0时,其溶解度可达89.74%,且一级结构较稳定,分子量主要集中在75 kDa;栅藻蛋白质的热稳定性较高,其热变性温度为109.17℃,和螺旋藻蛋白质、木瓜蛋白质和花生蛋白质相似,超过绿豆和红豆蛋白质;栅藻蛋白质的乳化性和乳化稳定性分别为61.11%和84.55%,和大豆蛋白质具有相似的乳化性,且乳化稳定性较高,可以作为不同食品的粘合剂。选用微波辅助恒温浸提结合法提取栅藻多糖,通过正交试验确定栅藻多糖的最佳提取工艺为:提取温度70℃,微波功率700 W,料液比1:35、微波提取时间20min,恒温浸提2h,用DEAE-52对粗多糖进行分离纯化,共得四种多糖DAP1、DAP2、DAP3和DAP4,分别分离自去离子水段,0.2molL-1、0.5mol L-1和1.0 molL-1 NaCl段。对四种多糖进行分析,四种多糖均由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖和甘露糖组成。高效凝胶色谱（GPC）分析表明,四种多糖分子量分布均匀,DAP1、DAP2、DAP3 和 DAP4 的分子量分别为:3.4kDa、33.4kDa、53.4kDa 和 59.1 kDa。扫描电镜显示DAP1表面结构光滑,结构致密,但不平整;DAP2、DAP3和DAP4是一种非晶态固体,呈薄片状。体外抗氧化结果显示,DAP2、DAP3有较强的抗氧化活性。通过投喂栅藻（Desmodesmus armatus B38）作为方斑东风螺开口饵料和鲤鱼幼鱼饵料,研究栅藻对方斑东风螺和鲤鱼生长及存活的影响,发现在人工配合饲料的基础上添加栅藻作为方斑东风螺的开口饵料不利于方斑东风螺的生长和存活,但栅藻对鲤鱼幼鱼的生长有促进作用,复合饵料组的特定生长率、增重率和肥满度均是最高,分别为0.48%、43.75%和7.65%,且栅藻饵料组的肥满度高于配合饵料组,为7.28%,差异显著。

论文目录

摘要

Abstract

1 引言

1.1 微藻主要营养成分

1.1.1 蛋白质

1.1.2 多糖

1.1.3 不饱和脂肪酸

1.1.4 色素

1.1.5 其他

1.2 微藻生物饵料

1.2.1 微藻饵料应用现状

1.2.2 微藻饵料应用前景

1.2.3 饵料微藻选择

1.3 论文研究方案

1.3.1 研究目的与意义

1.3.2 研究内容

1.3.3 技术路线

2 优势藻株的筛选与鉴定

2.1 实验材料与仪器

2.1.1 实验材料

2.1.2 主要实验试剂与仪器

2.1.3 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 藻种的分离纯化与培养

2.2.2 藻种鉴定

2.2.3 微藻培养

2.2.4 营养物质分析方法

2.3 实验结果与分析

2.3.1 微藻分离、纯化及初步鉴定

2.3.2 微藻生长曲线及生物量分析

2.3.3 15株热带微藻蛋白质和多糖含量分析

2.3.4 目标微藻DNA序列比对及系统发育树建立

2.4 本章小结

3 栅藻Desmodesmus armatus B38营养成分分析

3.1 实验材料与仪器

3.1.1 主要实验试剂与仪器

3.2 实验方法

3.2.1 一般营养成分测定

3.2.2 脂肪酸分析

3.2.3 氨基酸分析

3.2.4 维生素的测定

3.2.5 微量元素及重金属测定

3.3 实验结果与分析

3.3.1 栅藻的一般营养成分及评价

3.3.2 栅藻脂肪酸组成及含量

3.3.3 栅藻氨基酸组成

3.3.4 栅藻中的维生素

3.3.5 栅藻中矿物质元素

3.4 本章小结

4 栅藻Desmodesmus armatus B38培养工艺优化及扩大培养

4.1 实验材料与仪器

4.1.1 主要实验试剂与仪器

4.2 实验方法

4.2.1 藻株和微藻培养

4.2.2 生长和生物量计算

4.2.3 营养素分析

4.2.4 单因素设计

4.2.5 Plackett-Burman实验设计

4.2.6 中心组合设计

4.2.7 优化条件的实验验证

4.2.8 室外光生物反应器培养

4.2.9 统计分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 不同光照强度对生物量的影响

4.3.2 不同氮源对生物量的影响

4.3.3 不同碳源对生物量的影响

4.3.4 变量筛选

4.3.5 中心组合设计和响应面方法

4.3.6 模型合理性论证

4.3.7 室外光生物反应器培养及差异分析

4.4 本章小结

5 栅藻Desmodesmus armatus B38蛋白质分离提取及性质分析

5.1 实验材料与仪器

5.1.1 主要实验试剂与仪器

5.2 实验方法

5.2.1 栅藻蛋白质溶出率测定

5.2.2 不同蛋白质提取方法

5.2.3 超声破碎法提取栅藻蛋白质单因素实验

5.2.4 响应面优化蛋白质提取工艺

5.2.5 模型合理性论证

5.2.6 栅藻蛋白质等电点的测定

5.2.7 栅藻蛋白理化性质分析

5.2.8 栅藻蛋白质功能性质分析

5.3 结果与讨论

5.3.1 不同提取方法对蛋白质溶出率的影响

5.3.2 单因素实验

5.3.3 响应面设计

5.3.4 模型合理性验证

5.3.5 栅藻蛋白质等电点

5.3.6 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析

5.3.7 蛋白质的紫外光谱分析

5.3.8 红外光谱分析

5.3.9 蛋白质的差示量热扫描（DSC）分析

5.3.10 栅藻蛋白质溶解度

5.3.11 栅藻蛋白乳化性和乳化稳定性

5.4 本章小结

6 栅藻Desmodesmus armatus B38多糖分离提取及活性分析

6.1 实验材料与仪器

6.1.1 主要实验试剂与仪器

6.2 实验方法

6.2.1 栅藻预处理

6.2.2 粗多糖的含量的测定

6.2.3 不同提取方法提取栅藻粗多糖

6.2.4 单因素试验

6.2.5 正交试验

6.2.6 栅藻粗多糖的制备

6.2.7 栅藻粗多糖分离纯化

6.2.8 栅藻多糖的化学表征

6.2.9 栅藻多糖的结构表征

6.2.10 栅藻多糖热稳定性分析

6.2.11 栅藻多糖扫描电镜

6.2.12 体外抗氧化活性

6.3 结果与讨论

6.3.1 不同提取方法对栅藻多糖提取率的影响

6.3.2 单因素试验

6.3.3 正交试验

6.3.4 验证试验

6.3.5 栅藻多糖纯化组分及化学成分

6.3.6 纯化多糖的紫外可见光谱扫描

6.3.7 单糖组成和分子量的测定

6.3.8 栅藻多糖红外光谱分析

6.3.9 栅藻多糖热稳定性分析

6.3.10 藻多糖扫描电镜分析

6.3.11 体外抗氧化活性分析

6.4 本章小结

7 栅藻Desmodesmus armatus B38水产饵饲料开发价值研究

7.1 实验方法

7.1.1 栅藻对东风螺生长的影响

7.1.2 不同饵料对鲤鱼幼鱼生长的影响

7.2 结果与分析

7.2.1 栅藻对东风螺生长的影响

7.2.2 不同饵料对鲤鱼生长的影响

7.2.3 不同饵料对鲤鱼存活率的影响

7.2.4 不同饵料对鲤鱼肥满度的影响

7.3 结果分析

7.3.1 栅藻对东风螺生长的影响

7.3.2 栅藻对鲤鱼生长的影响

7.3.3 栅藻饵料应用途径

7.4 本章小结

8 结论与展望

8.1 结论

8.2 展望

参考文献

附录

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王盛林

导师: 刘平怀

关键词: 栅藻,生物量,蛋白质,多糖,水产饵料

来源: 海南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 海南大学

分类号: Q946

DOI: 10.27073/d.cnki.ghadu.2019.000244

总页数: 99

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