滕达１王婷２（１．江苏师范大学化学化工学院江苏徐州２２１１１６）（２．徐州医学院医学技术学院江苏徐州２２１００２）
【中图分类号】Ｒ３９２．９【文献标识码】Ａ【文章编号】１５５０－１８６８（２０１４）１０
【摘要】目的探讨姜黄素提高γδＴ细胞对胃癌细胞ＳＧＣ７９０１杀伤作用的机理。方法用１０名健康人外周血单核细胞（ＰＢＭＣ）在体外经多种细胞因子培养γδＴ细胞；收集培养至第７天的γδＴ细胞，用不同浓度（０，１．２５，２．５，５，１０，２０μｍｏｌ／Ｌ）的姜黄素共培养，同时设无水乙醇组。用ＦＡＣＳ法测γδＴ细胞表型、穿孔素、颗粒酶Ｂ、细胞凋亡率；用ＬＤＨ法测定γδＴ细胞对Ｕ２５１细胞杀伤活性。结果γδＴ细胞经２．５～１０μｍｏｌ／Ｌ姜黄素作用后能增加γδＴ细胞增殖，增加穿孔素、颗粒酶Ｂ的表达，杀伤Ｕ２５１活性明显增强，均显著显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）。当姜黄素浓度达２０μｍｏｌ／Ｌ时，各组检测数据均低于对照组。结论一定浓度的姜黄素能增强γδＴ细胞对ＳＧＣ７９０１的杀伤活性。γδＴ细胞杀伤活性增强与细胞内穿孔素和颗粒酶含量相关。
【关键词】姜黄素；γδＴ细胞；穿孔素；颗粒酶Ｂ；ＳＧＣ７９０１姜黄素是一种从中药姜黄根茎中提取的天然化合物。姜黄素有许多分子靶标如：酶、激酶、炎性细胞因子、生长因子、转录因子和一些受体等［１］，因而，姜黄素已成为国内外临床和基础研究的一个热点。γδＴ细胞是广泛分布于消化系统、呼吸系统等黏膜和上皮组织内的固有免疫Ｔ细胞，具有抗原提呈、杀伤肿瘤和免疫调节作用已被应用于肿瘤的过继性细胞免疫治疗［２－３］。有研究表明，高浓度的姜黄素对ＤＣ、ＣＩＫ细胞有抑制作用［４－５］。由于姜黄素具有对机体免疫系统的双向作用，为此，我们用不同浓度的姜黄素在体外与人γδＴ细胞作用，观察其对γδＴ细胞的穿孔素、粒酶Ｂ和杀伤活性的影响，同时研究姜黄素对胃癌细胞ＳＧＣ７９０１的直接作用，以探讨姜黄素对胃癌细胞的影响。
１材料姜黄素，Ｓｉｇｍａ公司；胃癌细胞ＳＧＣ７９０１，中科院上海细胞所；胰蛋白酶、ＲＰＭＩ１６４０，Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清和淋巴细胞分离液，中国科学院血液病研究所；ＩＬ－２，厦门特宝生物公司；ＦＩＴＣ标记的抗人ＴＣＲ－γδ和ＰＥ标记的ｐｅｒｆｅｒｉｎ（穿孔素）、ＧｒａｎＢ（粒酶Ｂ）和ＮＫＧ２Ｄ抗体，杭州联科生物公司；乳酸脱氢酶试剂盒，日本世诺临床诊断制品株式会社。
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ流式细胞仪，美国ＢＤ公司；ＡＵ１０００全自动生化分析仪，Ｏｌｙｍｐｕｓ公司；ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ流式细胞仪分析软件，每个标本分析细胞数≥１×１０４。
２方法２．１姜黄素诱导γδＴ细胞抽取１０名健康人外周血各１０ｍＬ，用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞（ＰＢＭＣ），用无菌生理盐水洗涤３次，将细胞按２×１０６／Ｌ悬浮于ＲＰＭＩ１６４０培养基中，ＰＢＭＣ经生理盐水洗涤３遍后，用含１００ｍｌ／Ｌ小牛血清、５０ｍｌ／Ｌ人ＡＢ血清、２×１０５Ｕ／ＬＩＬ－２和３μｇ／ＬＩＰＰ的ＲＰＭＩ１６４０培养液调整细胞数为５×１０８／Ｌ，置７５4２细胞培养瓶中，于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养，根据细胞生长情况添加培养液。收集培养９ｄ的细胞分别加入０，１．２５，２．５，５，１０，２０μｍｏｌ／Ｌ的姜黄素，同时设无水乙醇对照组（无水乙醇含量为０．１％），每组设５个复管，置３７℃、５％ＣＯ２培养箱中继续培养７２ｈ收集细胞用于试验。
２．２姜黄素诱导的γδＴ细胞对ＳＧＣ７９０１细胞杀伤活性的检测用乳酸脱氢酶释放法［６］测定γδＴ细胞杀伤活性。取经姜黄素作用的γδＴ细胞（效应细胞）和靶细胞（胃癌细胞ＳＧＣ７９０１）分别配成２×１０９／Ｌ和２×１０８／Ｌ。将效靶细胞数按１０：１比例混合，５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，置３７℃、５％ＣＯ２培养箱中孵育６ｈ后，轻轻混匀细胞，再以１５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。收集上清液用全自动生化分—３２９—析仪测定３４０ｎｍ波长处的的吸光度（Ａ）值。杀伤活性＝（Ａ实验组－Ａ效应细胞自然释放组）／（Ａ靶细胞最大释放组－Ａ靶细胞自然释放组）×１００％２．３姜黄素对γδＴ细胞的穿孔素、粒酶Ｂ的影响收集培养９ｄ的γδＴ细胞，用无血清培养基洗涤３次后配成２×１０８／Ｌ，加入６孔细胞培养板，５ｍＬ／孔。
然后分别加入０，１．２５，２．５，５，１０，２０μｍｏｌ／Ｌ的姜黄素，３７℃孵育２４ｈ收集细胞用流式细胞测定其穿孔素、粒酶Ｂ；每个实验项目均设未经姜黄素作用的γδＴ细胞对照组。
２．４姜黄素对胃癌细胞ＳＧＣ７９０１凋亡的影响取培养８ｄ的γδＴ细胞和对数生长期的ＳＧＣ７９０１细胞，以２×１Ｏ５／孔接种于２４孔板，加入０，１．２５，２．５，５，１０，２０μｍｏｌ／Ｌ的姜黄素，每组设３个复孔。细胞经药物作用２４ｈ后弃上清，用０．２５％胰蛋白酶消化后收集ＳＧＣ－７９０１细胞，γδＴ细胞直接收集，用ＲＰＭＩ１６４０培养基洗涤３遍，加入７０％冷乙醇固定，４℃过夜。ＰＢＳ洗涤３次，加入ＰＩ染液，４℃避光染色３０ｍｉｎ，用ＦＡＣＳ检测，记录激发波长４８８ｎｍ处的红色荧光。
２．５统计学分析用ＳＰＳＳ１３．０统计软件包对数据分析，采用Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ进行比较，Ｐ＜０．０５为有统计学意义。
３结果３．１姜黄素诱导的γδＴ细胞对胃癌细胞ＳＧＣ７９０１杀伤活性的影响经５μｍｏｌ／Ｌ姜黄素诱导的γδＴ细胞对ＳＧＣ７９０１杀伤活性最高（６２％），明显高于对照组（３７％），两者比较有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；当姜黄素浓度过高（２０μｍｏｌ／Ｌ时），γδＴ细胞杀伤活性明显降低。
３．２姜黄素对γδＴ细胞穿孔素、颗粒酶Ｂ水平的影响经５～１０μｍｏｌ／Ｌ姜黄素诱导的γδＴ细胞穿孔素和颗粒酶Ｂ均较对照组高，浓度在１０μｍｏｌ／Ｌ时穿孔素和粒酶Ｂ显著高于对照组；无水乙醇组较对照组无显著差异。当姜黄素浓度高至２０μｍｏｌ／Ｌ时两者结果均明显降低。结果见表１。
３姜黄素对ＳＧＣ７９０１凋亡率的影响不同浓度姜黄素诱导的ＳＧＣ７９０１对其凋亡率的影响有明显的不同，低浓度的姜黄素能减低凋亡率，浓度为５μｍｏｌ／Ｌ时最明显（分别为７．８３％和３７．５９％），显著低于对照组（分别为１２．５４％和４４．６７％）。姜黄素浓度高于１０μｍｏｌ／Ｌ时，ＳＧＣ７９０１凋亡率逐渐增高。
４讨论早期研究证明姜黄素具有抗炎、抗氧化、清除自由基及抗癌等作用，有研究表明，高浓度的姜黄素能通过将乳腺癌等肿瘤细胞周期阻滞于Ｓ、Ｇ２／Ｍ期，从而抑制肿瘤细胞增殖、通过下调ｂｃｌ－２水平和上调ｂａｘ水平促进其凋亡。有报道姜黄素具有人原髓细胞白血病ＨＬ－６０细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用。也有报道，高浓度的姜黄素能抑制ＤＣ、αβＴ细胞等免疫细胞增殖及功能。与此结果相似，本研究发现姜黄素浓度在２０μｍｏｌ／Ｌ时能明显减低对γδＴ细胞杀伤ＳＧＣ７９０１活性。
本研究表明，姜黄素在低浓度（１．２５μｍｏｌ／Ｌ）时对γδＴ细胞杀伤活性影响不明显，２．５～１０μｍｏｌ／Ｌ时，杀伤活性随剂量的增加逐渐增强，但当药物浓度过高时反而会抑制其作用。这与报道的低浓度姜黄素能增强单核巨噬细胞吞噬功能，高浓度抑制其吞噬功能的结果类似。因此，姜黄素作用ＳＧＣ７９０１的用量上有个最适浓度窗现象，这一点在设计实验时要注意药的时效和量效问题。
参考文献［１］ＧａｎｅｓｈＣＪ，ＢｈａｒａｔＢＡ．“Ｓｏｉｃｉｎｇｕｐ”ｏｆｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｉｍｂｙｃｕｒｃｕｍｉｎ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎｉｍｍｕｎ，２００７，２７（１）：１９－３５．［２］ＤｉｅｔｅｒＫａｂｅｌｉｔｚ，ＤａｎｉｅｌａＷｅｓｃｈ，ａｎｄＷｅｉＨｅ．ＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｏｆγδＴｃｅｌｌｓｉｎｔｕｍｏｒｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００７，６７（１）：５－８［３］ＫｏｂａｙａｓｈｉＨ，ＴａｎａｋａＹ，ＹａｇｉＪ，ｅｔａｌ．Ｓａｆｅｔｙｐｒｏｆｉｌｅａｎｄａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｄｏｐｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｕｓｉｎｇｇａｍｍａ－ｄｅｌｔａＴｃｅｌｌｓａｇａｉｎｓｔａｄｖａｎｃｅｄｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａｐｉｌｏｔｓｔｕｄｙ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２００７，５６（４）：４６９－４７６．［４］ＫｉｍＧＹ，ＫｉｍＫＨ，ＬｅｅＳＨ，ｅｔａｌ．Ｃｕｒｃｕｍｉｎｉｎｈｉｂｉｔｓｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ：ＭＡＰＫｓａｎｄｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆＮＦ－ｋａｐｐａＢａｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｔａｒｇｅｔｓ［Ｊ］．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，２００５１７４（１２）：８１１６－８１２４．［５］ＳｈｉｒｌｅｙＳＡ，ＭｏｎｔｐｅｔｉｔＡＪ，ＬｏｃｋｅｙＲＦ，ｅｔａｌ．Ｃｕｒｃｕｍｉｎｐｒｅｖｅｎｔｓｈｕｍａｎｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｉｍｍｕｎｅｓｔｉｍｕｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，２００８，３７４（３）：４３１－４３６．［６］刘军权，韩慧敏，陈复兴．用乳酸脱氢酶试剂盒检测ＬＡＫ细胞活性［Ｊ］．临床医学检验，１９９５，２：８３．