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固氮酶基因在Synechocystis sp.PCC6803中的表达以及固氮菌的分离和鉴定

2020-12-02阅读(340)

固氮酶基因在Synechocystis sp.PCC6803中的表达以及固氮菌的分离和鉴定

论文摘要

本研究通过高效表达载体pfq20将单细胞固氮蓝藻Cyanothecesp.PCC 8801的nifHDK基因和绿螺旋杆菌(Heliobacterium chlorum)nifH)基因分别整合至单细胞非固氮蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803中,并进行转录和表达水平的检测,结果显示两种固氮微生物的nifHDK基因在Synechocystis sp.PCC 6803中均有转录,并且通过western blot检测到绿螺旋杆菌的NifH蛋白表达;同时,本研究将Synechocystis sp.PCC 6803中PmgR1基因的启动子以及Cyoanothece sp.PCC 8801nifB和nifH前的启动子序列与Cyanothece sp.PCC 8801nifH基因连接并整合至Synechocystis sp.PCC 6803基因组中,对转录和表达水平进行检测发现三种启动子作用下的nifH在Synechocystis sp.PCC 6803中均有表达,且表达量具有一定差异,在转录水平上,PmgR1基因启动子作用下的nifH转录水平明显受到光照条件的影响,在黑暗条件下转录水平持续增强,这些结果对在Synechocystis sp.PCC 6803中表达活性固氮酶蛋白具有一定参考意义。另一方面,本研究采用Doberener固体无氮培养基从具有发达根系的骆驼刺根际分离得到两株具有固氮潜力的新菌T3和T22,并分别从生理生化、化学成分以及遗传和进化分析方面进行鉴定,其中,T3属于假单胞菌属,将其命名为Pseudomonas urumqiensis sp.nov.,模式种为T3T(=ACCC 60124T=JCM 32830T),T22属于Chitinophaga属,将其命名为Chitinophaga alhagiae sp.nov.,模式种为T22T(=ACCC 60125T=KCTC 62518T)。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 引言
  •   1.1 固氮酶结构
  •   1.2 nif基因在非固氮宿主中的外源表达
  •   1.3 固氮单细胞蓝藻Cyanothece sp. PCC 8801
  •   1.4 绿螺旋杆菌Heliobacterium chlorum
  •   1.5 本研究的目的、意义和主要内容
  • 第二章 nifHDK基因在Synechocystis sp. PCC 6803中的表达
  •   2.1 材料与方法
  •     2.1.1 菌株和藻株的培养
  •     2.1.2 集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803的转化
  •     2.1.3 蓝藻基因组总DNA的提取
  •     2.1.4 聚合酶链式反应PCR（Polymerase Chain Reaction）
  •     2.1.5 DNA的重组转化
  •     2.1.6 蓝藻蛋白的提取
  •     2.1.7 蛋白质的免疫印迹（Western blot）
  •     2.1.8 固氮酶活性检测
  •     2.1.9 RNA的提取和反转录
  •     2.1.10 实时荧光定量PCR
  •   2.2 实验结果与分析
  •     2.2.1 质粒的构建
  •     2.2.2 nifHDK重组载体构建
  •     2.2.3 表达检测
  •   2.3 本章小结
  • 第三章 不同启动子作用下8801nifH的表达研究
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 菌株和藻株的培养
  •     3.1.2 蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803的转化
  •     3.1.3 蓝藻基因组总DNA的提取
  •     3.1.4 聚合酶链式反应PCR
  •     3.1.5 DNA的重组转化
  •     3.1.6 蓝藻蛋白的提取
  •     3.1.7 蛋白质的免疫印迹
  •     3.1.8 RNA的提取和反转录以及实时荧光定量PCR
  •     3.1.9 lacZ前启动子活性检测
  •   3.2 实验结果与分析
  •     3.2.1 质粒的构建
  •     3.2.2 载体构建
  •     3.2.3 启动子活性检测
  •     3.2.4 NifH表达检测
  •   3.3 本章小结
  • T的菌种分离和鉴定'>第四章 无氮培养基分离菌株T3T的菌种分离和鉴定
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 样品采集和处理
  •     4.1.2 细菌分离和培养
  •     4.1.3 基因组提取
  •     4.1.4 基因扩增和克隆测序
  •   4.2 菌种鉴定
  •     4.2.1 形态学研究
  •     4.2.2 生理生化特征
  •     4.2.3 化学成分分析
  •     4.2.4 DNA分析
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 形态学和培养特征
  •     4.3.2 遗传与进化分析
  •     4.3.3 极性脂、脂肪酸及呼吸醌的组成
  •     4.3.4 生理生化特征
  •     4.3.5 新种Pseudomonas urumqiensis sp. nov.的描述
  • T的菌种分离和鉴定'>第五章 无氮培养基分离菌株T22T的菌种分离和鉴定
  •   5.1 材料与方法
  •     5.1.1 样品采集和处理
  •     5.1.2 细菌分离和培养
  •     5.1.3 基因组提取
  •     5.1.4 16S rRNA基因扩增和克隆测序
  •   5.2 菌种鉴定
  •   5.3 结果与分析
  •     5.3.1 形态学和培养特征
  •     5.3.2 遗传与进化分析
  •     5.3.3 极性脂、脂肪酸及呼吸醌的组成
  •     5.3.4 生理生化特征
  •     5.3.5 新种Chitinophaga alhagiae sp. nov.的描述
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 邹媛媛

    导师: 张志芳

    关键词: 固氮,蓝细菌,假单胞菌

    来源: 中国农业科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 中国农业科学院

    分类号: Q936;Q78

    总页数: 95

    文件大小: 8840K

    下载量: 169

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