复方鳖甲软肝方药物血清干预TGF-β1影响大鼠离体肝星形细胞活化的研究

戴敏^[1]2004年在《复方鳖甲软肝方药物血清干预TGF-β_1影响大鼠离体肝星形细胞活化的研究》文中认为肝纤维化是机体对于慢性肝损伤的一种修复性应答,也是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,在多种细胞及细胞因子参与下,引起细胞外基质(extracelluarmatrix, ECM)的合成与降解失衡,导致 ECM 过度沉积被普遍认为是肝纤维化发生的主要机制. 现已证实,肝星形细胞 (hepatic stellate cell, HSC)是肝脏产生 ECM 的主要细胞,HSC 的激活是肝纤维化发生的中心环节,各种损肝因素导致肝损伤,继而引起肝细胞坏死及炎症刺激,相关细胞分泌各种细胞因子激活 HSC,产生大量的ECM,导致 ECM 生成大于降解,以致 ECM 过度沉积引起肝纤维化,HSC 的激活受多种细胞因子( cytokine,CK) 的调控,已知血小板衍生生长因子( platelet derivedgrowth factor,PDGF),胰岛素样生长因子-I( insulin-like growth factor,IGF-I), 转化生长因子(transforming growth factor ,TGF-β) 等均属关键的 CK. 脊椎动物中的 TGF-βS可分 TGF-β_(1-5)五种亚型, 而人和哺乳动物现已确认的是 TGF-β_(1-3).TGF-β是促使 HSC 转化为肌样成纤维母细胞( Myofibroblasts,MFB)并促进分泌胶原纤维的主要细胞因子,其中 TGF-β_1在体细胞内所占比例最高(>90%),活性最强.TGF-β_1对 HSC 有双重作用;促凋亡(apoptosis )和促活化作用,TGF-β_1可通过 C.elegans Sma and mothers against decapentaplegic(Smads)信号途径作用于激动蛋白-1( activating protein 1 ,AP1)转录因子诱导 HSC 凋亡,也可通过稳定核转录因子 kappa B 抑制物(inhibitor of nuclear factor-kappa B,IκB 及降低核转录因子 kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB) 活性介导 HSC 凋亡,从而抑制肝纤维化的发展; TGF-β_1还可通过Smads通路对α1(I)胶原基因(col1α1).组织金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP) 基因,生长因子基因如血小板衍生生长因子( platelet derived growth factor,PDGF) 等基因,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)基因,胶原酶/基质金属蛋白酶-1(matrix-matalloproteinase-1,MMP-1)基因(下调)等与纤维化相关的基因进行正调节或负调节,促使HSC转化为MFB,或诱导 Kupffer 细胞等产生PDGF 等其他细胞因子,并诱导 HSC 表达这些细胞因子受体,从而促进 HSC增殖,产生胶原,同时抑制细胞外基质的降解,加速肝纤维化的发展.TGF-β_1对HSC的促活化和促凋亡主次作用的体现取决于两作用相对效应强度差. 目前认为促 HSC 活化作用的效应强度大于促HSC凋亡的作用强度, 故综合效应表现为促进肝纤维化. 近十多年的研究显示, 中医药抗肝纤维化临床效果较好, 加之毒副作用较低而前景广阔. 本实验采取的复方鳖甲软肝方由鳖甲, 党参等十一味中药组成, 可扶正祛邪, 活血化瘀. 其临床有效率达 81.67%, 治愈率达 55.23%, 系国家级中药新药(批准文号:国药准字 1999, 2-102 号), 已上市 .实验在细胞培养体系中添加TGF-β_1以刺激 HSC 充分活化, 观察 TGF-β_1所导致的HSC生物学行为的改变,以及复方鳖甲软肝方药物血清的干预作用. 目的在于进一步深入探讨复方鳖甲软肝方药物血清影响 HSC 活化的作用机制.1. 复方鳖甲软肝方药物血清对活化的 HSC 自分泌 TGF-β_1 的实验研究 本实验运用免疫组化和图像分析技术方法,对离体活化的 HSC 自分泌 TGF-β_1进行半定量分析,观察复方鳖甲软肝方药物血清对HSC自分泌TGF-β_1的影响,以探讨复方鳖甲软肝方药物血清抗肝纤维化的作用机制 .结果显示, IFN-γ和复方鳖甲软肝方药物血清均有显著抑制 HSC 自分泌 TGF-β_1的作用,从而抑制 HSC活化及胶原蛋白, 纤连蛋白的合成, 起到抗肝纤维化的作用 .其中, IFN-γ的作用强度与低剂量药物血清相当.2. 复方鳖甲软肝方药物血清干预 TGF-β_1影响HSC增殖作用的实验研究 HSC 活化的主要特征之一是 HSC 增殖. 本实验从 HSC 增殖角度 ,运用 MTT法及流式细胞仪技术观察复方鳖甲软肝方药物血清对离体大鼠 HSC 活化的影响.结果显示 TGF-β_1 IFN-γ .复方鳖甲软肝方药物血清能不同程度地阻滞 HSC于 G0, G1 期 ,从而抑制了 HSC 增殖 ;同时 TGF-β_1还可显着促进 HSC 凋亡,进一步减少存活的 HSC 的数量. 有文献表明,TGF-β_1可通过 Smads 信号途径促进细胞增殖,而本实验结果显示至少在培养 72h内,TGF-β_1可抑制 HSC 细胞周期的增殖并促进 HSC 凋亡,提示培养 72h 内 TGF-β_1 可能通过其他信号途径(如NF-κB途径等),可拮抗或阻断 Smads 信号途径,使其综合效应表现为抑制 HSC细胞周期并促进 HSC 凋亡;而 IFN-γ,复方鳖甲软肝方药物血清促 HSC 凋亡作用不明显.由此可知,TGF-β_1兼具抑制 HSC 增殖和促进 HSC 凋亡的作用,而 IFN-γ和复方鳖甲软肝方药物血清主要是抑制 HSC 增殖,促进 HSC 凋亡的作用不明显.3. 复方鳖甲软肝方药物血清干预 TGF-β_1影响 HSC 中 NF-κB 表达的实验研究 本实验目的是观察外源性 TGF-β_1对 HSC 中 NF-κB 活性的影响,以及复方鳖甲软肝方药物血清的干预作用,以探讨复方鳖甲软肝方防治肝纤维化作用机制与 TGF-β_1NF-κB 之间的相互关系.

张玮^[2]2003年在《复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠离体肝星形细胞作用机理研究》文中研究指明肝纤维化是诸多慢性肝病的基础病理改变。肝纤维化的机制为细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)的合成与降解失衡，导致ECM过度沉积所致。肝纤维化进一步发展即肝硬化。此时，肝的正常组织结构已被破坏，进一步发展，肝中央静脉周围和汇管区出现小叶间隔，形成假小叶，即可出现肝功能障碍。因此，积极防治肝纤维化的发生，无论从延缓或阻断肝硬化的形成，还是逆转肝纤维化病理进程，均具有十分重要的意义。近年来，大量资料表明，肝星形细胞(hepatocyte stellate cells ，HSC)是肝脏主要产生ECM的细胞，也是各种病因导致肝纤维化发生的共同中心环节。HSC活化是产生胶原的关键环节。HSC活化后，可出现细胞性状和细胞功能的改变。最突出的表现为ECM的合成与降解的失衡。HSC的活化可分为活化启动和活化持续两个阶段。HSC的活化依靠于细胞内信号转导的同时，还与核转录因子的调节密切相关。目前以HSC为靶向治疗肝纤维化的主要措施包括：①去除病因，减轻肝脏炎症，间接抑制HSC的活化；②选择性阻止HSC合成ECM；③促进HSC对ECM的降解④促进过剩的HSC凋亡，减少其数量。目前，西医对肝纤维化的治疗主要集中在防止肝损伤、抗炎、干预细胞内信号转导通路、拮抗促纤维化细胞因子作用、抑制胶原合成(转录水平或翻译水平)、促进胶原降解和促进HSC凋亡等多个方面。中医药对肝纤维化的治疗通常采用是活血化瘀、益气养阴、软肝散结、清热利湿和调理肝脾等治则。本实验采取的复方鳖甲软肝方由鳖甲、党参等十一味中药组成。其功能为：扶正祛邪，活血化瘀。扶正：党参健脾益气，紫河车益肾填精。驱邪：板蓝根清热解毒。活血化瘀：鳖甲，入肝、肾经，既可软坚散结，又可滋阴潜阳。当归养血活血，莪术行气祛瘀。其临床有效率达81.67%，治愈率达55.23%。本方系国家级中药新药(批准文号：国药准字1999，2-102号)已上市。本研究拟采用复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠离体肝星形细胞作用机理开展实验研究。目的在于进一步深入了解复方鳖甲软肝方药物血清对HSC的增殖，活化以及对ECM降解和合成的影响。此外，本研究还从活化的HSC细胞内信号转导及核转录因子方面探讨复方鳖甲软肝方对HSC活化所产生的影响。1.复方鳖甲软肝方药物血清对HSC增殖影响的实验研究本实验从离体的角度观察复方鳖甲软肝方药物血清对肝星形细胞(HSC)增殖的影响，以探讨其抗肝纤维化的作用机制。研究表明，肝纤维化是一种常见的慢性进行性肝病，肝星形细胞的活化增殖以及细胞外基质(ECM)的沉积是肝纤维化的两个重要环节。肝星形细胞的大量增殖，可以合成过多的胶原、蛋白多糖等ECM成分，与肝纤维化的发生、发展过程密切相关。本实验结果显示，不同剂量的复方鳖甲软肝方药物血清作用48 h、72 h均可抑制肝星形细胞的增殖，尤以高、中剂量组明显，提示复方鳖甲软肝方药物血清抑制肝星形细胞增殖的药物效应与药物浓度呈量效依赖关系，其机制可能与药物中的有效物质能阻止HSC分泌血小板衍生生长因子(PDGF)和阻止HSC已分泌的PDGF与HSC受体结合有关，从而起到抑制肝星形细胞的活化增殖，达到治疗肝纤维化的作用。而培养24h，各组无显着性差异，提示HSC的增殖需要一个从接受细胞信号刺激活化到HSC增殖数量发生显着变化的时间过程，从本实验结果提示，该时间过程无疑要大于24h。因此，如何在早期通过抑制HSC的增殖途径达到遏止HSC的迅速增殖，无疑具有重要的临床意义。与本室以往活血化瘀方药物血清的MTT实验结果相比，培养48h、72h，复方鳖甲软肝方药物血清与活血化瘀方药物血清均可显着抑制肝星形细胞的活化增殖，表明复方鳖甲软肝方药物血清与活血化瘀方药物血清均能抑制肝星形细胞的增殖。2.复方鳖甲软肝方药物血清对HSC活化影响的实验研究本实验采用免疫组化技术观察复方鳖甲软肝方药物血清对肝星形细胞(HSC)中α-SMA、desmin、突触素表达的影响，以探讨其抗肝纤维化的作用机制。研究表明，肝星形细胞的活化是肝纤维化的中心环节。活化的主要特征包括肝星形细胞中α-SMA、desmin和突触素的表达。本实验结果显示在时间上desmin、突触素的表达早于α-SMA的表达。突触素作为一种较新的HSC活化指标，可通过自分泌、旁分泌等方式参与肝纤维化发生、发展过程。并为肝纤维化的发生发展过程中神经调节的参与提供了指标依据。实验结果还显示，复方鳖甲软肝方药物血清作用24h、48h、72h均可显着抑制desmin和突触素的表达；复方鳖甲软肝方药物血清作用48h、72h还可显着α-SMA的表达，提示复方鳖甲软肝方药物血清可抑制HSC的活化。由于肝纤维化时α-SMA、desmin和突触素在表达时间上存在差异，而复方鳖甲软肝方药物血清抑制α-SMA、desmin和突触素的表达时间上也同样存在差异，故推测复方鳖甲软肝方药物血清抑制α-SMA、desmin和突触素表达的作用机制可能存在差异，详情有待进一步研究。实验结果还显示，培养24h，各组α-SMA表达并不显着，提示HSC中α-SMA的表达同样需要一个时间阶段，同增殖实验结果提示一样，如在早期加以积极治疗，则可取得更好的疗效。与本室以往活血化瘀方药物血清对α-SMA影响的实验结果相比

参考文献：

[1]. 复方鳖甲软肝方药物血清干预TGF-β_1影响大鼠离体肝星形细胞活化的研究[D]. 戴敏. 北京中医药大学. 2004

[2]. 复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠离体肝星形细胞作用机理研究[D]. 张玮. 北京中医药大学. 2003

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