陈明端林江波康明强通讯作者宋前程
福建医科大学附属协和医院胸外科福建福州３５００００基金项目:福建省医学创新课题项目编号(２０１２－CX－１８)
【摘要】目的建立更简单有效、能模拟肺移植后闭塞性细支气管炎(OB)的大鼠模型.方法使用２５０－３００g雄性Wistar大鼠和SD大鼠,通过原位气管移植建立实验组(Wistar→SD)和对照组(SD→SD),观察第７天、第３０天、第６０天移植气管的病理改变.结果大鼠术后生存状态良好,实验组移植气管H－E染色可见类似人类同种异体肺移植后OB的病理生理改变,而对照组移植气管H－E染色未见OB.结论大鼠原位气管移植模型能模拟肺移植后闭塞性细支气管炎,可用于研究OB的病因、发生机制、治疗方法等.【关键词】大鼠;原位气管移植;闭塞性细支气管炎【中图分类号】R３１８【文献标识码】B【文章编号】１００１－５３０２(２０１５)０９－０８６６－０１
肺移植是治疗终末期肺部疾病的有效治疗手段.近年来随着技术的进步,肺移植已经取得满意的近期疗效,但５年生存率仅５０％,１０年生存率＜２０％,是所有实质性器官移植中远期生存率最低的.临床和实验研究表明闭塞性细支气管炎(OB),即肺移植慢性排斥反应,限制了肺移植患者的长期生存.OB己经成为肺移植患者死亡的首要原因和进一步提高远期疗效的主要障碍[１].因此开展肺移植相关OB的研究是近年来肺移植研究领域的热点和重点.肺移植相关OB研究的一个重要障碍,就是缺乏有效模拟OB的动物模型.本实验通过建立大鼠原位气管移植模型,提供了一种研究肺移植相关OB更为理想的实验模型.１材料和方法
１．１实验动物清洁级Wistar大鼠,雄性,２５０~３００g,１５只;清洁剂SD大鼠,雄性,２５０~３００g,４５只,上海斯莱克实验动物有限责任公司提供【许可证号SCXK(沪)２０１２－０００２】.大鼠饲养于福建医科大学实验动物中心SPF级动物房.１．２实验器械及药剂１０％水合氯醛(福建医科大学附属第一医院制剂)、７－０带针尼龙缝合线(宁波市成和纤维器械厂)、外科手术器械(苏州医疗器械厂).１．３供体手术操作以Wistar大鼠和SD大鼠为供体,术前禁食、禁饮８小时,以１０％水合氯醛(０．３ml/１００g)腹腔内注射麻醉动物.麻醉成功后,仰卧固定于手术操作台(图１),前颈部备皮,用２％碘伏消毒,纵行切开颈部及上胸部皮肤,分离气管周围肌肉、血管,暴露气管(图２),切取甲状软骨下第２环至隆突上第２环气管,剥除气管外膜外粘连的其它组织,然后冲洗干净后浸泡于４℃生理盐水中备用.取用气管时剪取７个环气管段,修剪平整后,５个环为１段作为供体.
１．４受体手术操作以SD大鼠为受体,麻醉、备皮、消毒同上法,纵行切开颈部皮肤,充分暴露颈段气管,以甲状软骨下第４、５环间为中心,向上、向下钝性分离气管外筋膜结缔组织,小心剥离并保护双侧喉返神经,避免刺破血管,充分暴露气管.离断甲状软骨下第３软骨环,切去５个气管环(图３),采用端端吻合术植入供体的５个气管环.先吻合尾侧吻合口,膜部对膜部,软骨部对软骨部,７－０带针尼龙缝合线间断缝合,共３针完成.同法缝合头侧吻合口(图４).逐层缝合切口(图５).手术过程中,大鼠存在自主呼吸,应注意观察其通气情况,及时清理气管内渗血及分泌物,保持管腔通常,必要时可机械通气辅助.
１．５标本获取及检测指标１．５．１移植后大鼠饲养于SPF级动物房内,观察大鼠的生存状态及存活率,包括活动情况,精神状态等,并于术后第７天、第３０天、第６０天,随机抽取５只受体取移植气管标本进行检测.１．５．２移植气管固定于１０％福尔马林,然后石蜡包埋、切片,行H－E染色研究上皮破坏情况;气管腺的破坏情况;软骨环的破坏情况;间质组织破坏情况,包括水肿、血肿和淋巴细胞、单核细胞的浸润,肉芽组织样反应、坏死等.１．５．３计算移植气管通畅度气管通畅度指移植气管最狭窄处的横断面面积CSA２,与环状软骨环下第２个气管环处横断面面积CSA１之比.横断面面积CSA＝(a/２)×(b/２)×π(其中a为横向直径,b为矢向直径,均在内置测微尺的光学显微镜下测算).气管通畅度(％)＝CSA２/CSA１×１００％＝(a２×b２)/(a１×b１)×１００％.
２结果２．１３０例大鼠气管原位移植模型,建模平均用时(３０±１０)min,术后大鼠精神良好,进食正常,活动后有轻－中度喘息音,无死亡案例.２．２对照组共１５例大鼠,移植气管标本镜下观察均未见上皮组织、气管腺破坏,软骨环完整;间质组织中偶见少量淋巴细胞、单核细胞浸润,无明显水肿、血肿形成,间质无明显肉芽组织样反应,未见坏死(图B、图C).实验组共１５例大鼠,移植气管标本镜下均可见不同程度上皮破坏、气管腺消失,软骨环尚完整;间质组织见中－重度淋巴细胞、单核细胞浸润,伴水肿,肉芽组织样反应,无明显血肿、坏死;且随着移植时间延长,上述表现进行性加重(图D、图E).２．３应用SPSSStatistics１３．０软件分析,各时间段组间比较采用独立样本t检验,７天组比较,差异无统计学意义(P＞０．０５),３０天组、６０天组比较,差异有统计学意义(P＜０．０５).详见表１
表１实验组和对照组气管通畅度的比较(X±s)
２讨论本实验通过大鼠原位气管移植模拟肺移植后闭塞性细支气管炎,在３０天组、６０天组模型中,显微镜下均可见类似人类同种异体肺移植后OB的病理生理改变.而３０天组形成约４０％的气管狭窄,６０天组形成约５３％的气管狭窄.另７天组差异无统一学意义,原因主要是,移植时间短,移植气管尚处于术后急性反应期,尚未开始形成OB,故无法检测到OB相关的一系列病理生理改变.
早期研究,通过大鼠肺原位移植以形成OB,但后续研究证实该模型没有发生典型的OB病理改变,原因是该模型术后早期必须应用免疫抑制剂阻止急性排斥反应的发生,不能形成广泛的OB[２].由于气管移植的简便性,研究人员开始用气管移植来代替肺移植进行OB的研究.
图A－D国内研究人员曾采用小鼠原位气管移植模型,其缺点是小鼠气管直径小,术中操作困难,不利于神经、血管的保护,而且术中、术后易因渗血、分泌物堵塞气管引起小鼠窒息死亡,导致建模失败[３].本实验通过大鼠原位气管移植来模拟OB,大鼠在整个实验过程生存状态良好,移植气管标本显微镜下可见与人类同种异体肺移植后OB相似的病理生理改变,在３０天时气管狭窄约４０％,在６０天时气管狭窄约５０％.该模型优于鼠肺原位移植模型主要体现在:手术时间短,手术操作简单易掌握,术后大鼠存活率高,结果显示产生了OB相似的病理生理改变.该模型优于鼠异位气管移植模型主要体现在:术后移植物持续与外界空气相通,符合人肺移植后的生理学特点.另外,大鼠术后耐受性好,存活时间长,可用于研究OB的病因及可能的发生机制,也可同于研究OB的治疗方法、效果及副作用等.而本实验过程中应特别注意:１．大鼠在移植过程中保持自主呼吸,术中应及时清除气管内渗血及气道分泌物,以防大鼠窒息.２．术中应避免损伤气管旁血管及双侧喉返神经,保证术后大鼠能自主排痰.３．在剪取移植气管标本时,应标记好远近端,避免倒置,以保证气管纤毛的清除功能,促进排痰.
参考文献[１]ChristieJD,EdwardsLB,AuroraP,etal．Theregistryoftheinternationalsocietyforheartandlungtransplantation:twenty－sixthofficialadultlungandheart－lungtransplantationreport－２００９．[J]HeartLungTransplant,２００９,２８(１０):１０３１－１０４９．[２]MarckKW,WildevuurCR．Lungtransplantationintherat:Ⅰ．techniqueandsurvival[J]．AnnThoracSurg,１９８２,３４:７４－８０．[３]王建刚,等．模拟肺移植后闭塞性细支气管炎小鼠模型的建立[J]．同济大学学