周明哲[1]2004年在《棉铃虫核多角体病毒的传播动态及含SOD重组病毒的构建》文中研究说明本论文包括 2 个部分。 第一部分报道了野生型棉铃虫核多角体病毒（Helicoverpa armigera singlenucleocapsid nucleopolyhedrovirus, HaSNPV）和重组病毒 HaSNPV-AaIT（表达昆虫特异性蝎毒基因 AaIT；杀虫速度增加）的水平传播和垂直传播动态研究。在罩笼实验和田间开放实验中，两种 HaSNPV 水平传播能力随着感染幼虫龄期的增加而增强，在感染幼虫密度较高时（每株 1 头），病毒传播能力更强；重组病毒的水平传播率都显着性低于野生型病毒。根据实验数据确立了传播系数 ν，并用于田间对宿主昆虫种群数量的预测。在实验室中，HaSNPV-AaIT 的垂直传播率（感染雌蛾后代的死亡率）为 16.7 ± 2.1%，显着性低于野生型病毒（30.9 ±2.9%）；感染雄蛾中没有垂直传播率。同样，在田间重组病毒的垂直传播率（8.4± 1.1%）低于野生型病毒（12.6 ± 2.0%）。实验结果说明，重组病毒在棉铃虫中的传播能力低于野生型 HaSNPV；作为生物杀虫剂使用，HaSNPV-AaIT 在环境中的残留能力较差，影响了其长期杀虫效力，但是重组病毒的环境安全性更高。 第二部分针对杆状病毒的活性在田间受植物表面分泌的化学物质影响的特点，分析了 HaSNPV 的超氧化物歧化酶 sod 基因的特点并与其它 9 种核多角体病毒（NPV）和 4 种颗粒体病毒（GV）的 sod 基因编码产物进行了同源性比较。克隆了 HaSNPV 的 sod 基因并进行了原核表达，结果表明原核表达的 SOD 酶具有氧自由基的歧化活性。通过生测实验，证实 SOD 酶对棉铃虫病毒在棉叶上的感染性有增强作用。构建缺失 sod 基因以及超表达 SOD 酶的重组病毒，可以进一步分析 HaSNPV 的 sod 基因功能，并利用 SOD 酶与多角体蛋白融合表达，解决棉铃虫病毒在棉花表面因次生代谢产物作用而迅速失活的问题。构建了组建这两个重组病毒的中间载体，目前正在筛选重组体。
岳万福[2]2009年在《基于家蚕杆状病毒表达系统表达外源基因研究》文中提出家蚕杆状病毒表达系统作为一种真核表达系统,表达的蛋白具有折迭和糖基化,近于真实构相,表达量较大,而且能够可溶性地表达一些原核系统难以表达的大分子量蛋白。我们首先使用家蚕杆状病毒表达系统表达了Mn-SOD基因,并通过低温冷冻真空干燥,以SOD全蚕粉的形式,保持了SOD的活性。对SOD全蚕粉进行了以《保健食品检验与评价技术规范》为标准的安全性和功能性检验。经对小鼠进行人体推荐量360倍的急性毒性检验、90天的长期性毒性检验,小鼠生长正常,各器官无异常现象发生；SOD全蚕粉对ConA刺激导致的淋巴细胞转化,在体外法实验中,显示能明显增加淋巴细胞转化率,提示SOD全蚕粉具有免疫调节作用；经口给予小鼠不同剂量的SOD全蚕粉30天,能提高小鼠迟发型变态反应能力,在高剂量组达到显着水平,但与阳性对照(黄芪组)有较明显的差距。SOD全蚕粉促进小鼠的体重增长,对脾脏生长无影响,但明显增加小鼠的胸腺／体重比值；用SRBC免疫小鼠后,产生抗SRBC抗体,SOD全蚕粉对血凝素也有明显的作用,表明SOD全蚕粉对正常机体的体液免疫功能均有增强作用；经对小鼠巨噬细胞的功能实验,SOD全蚕粉提高了小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。在家蚕体内表达SOD基因后,经冷冻干燥制得SOD全蚕粉,设叁个剂量组和阴性、阳性对照组给小鼠灌胃；经口给予小鼠不同剂量的SOD全蚕粉30天,能增加小鼠血和肝脏中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,降低小鼠肝脏中丙二醛含量。在家蚕体内表达SOD基因后,经冷冻干燥制得SOD全蚕粉,小鼠灌胃45天,小鼠尾静脉注稀释的印度墨汁,以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力,碳廓清能力提高,说明加速碳粒的清除,显着提高自然杀伤细胞抗瘤活性,增强机体的非特异性细胞免疫功能。以NIH小鼠为研究模型,观察SOD全蚕粉对NK细胞活性的影响,证实了SOD全蚕粉有明显的能增强NK细胞的活性,从而增强机体的免疫机能。在此基础上,进行抑制肿瘤实验,结果表明提高小鼠抗肿瘤能力,SOD全蚕粉提高S180肿瘤荷瘤小鼠的淋巴细胞转化率、NK细胞活性,抑制小鼠的肿瘤生长；SOD全蚕粉组对肝癌H22的平均抑瘤率为40.3,表现出较强的抗肿瘤活性,能促进T淋巴细胞转化,提高NK细胞活性。经四氧嘧啶造模成功后小鼠,对其灌胃SOD全蚕粉30天(SOD全蚕粉为家蚕体内表达SOD基因后,经冷冻干燥制得),结果显示SOD全蚕粉能增加小鼠的糖耐量水平,对小鼠的空腹血糖值有降低趋势,达到显着水平。家蚕杆状病毒表达系统是一个功能强大,可利用范围较广的真核表达系统,然而,由于感染需要节间注射,限制了家蚕杆状病毒表达系统的应用,因此,我们对家蚕杆状病毒表达系统进行了几项攻进。采用荧光增白剂喷洒桑叶,增加家蚕经口对杆状病毒表达系统中携带外源基因病毒的易感性。构建了双表达载体系统,在表达Mn-SOD目的蛋白的同时,恢复表达了多角体基因；多角体基因和Mn-SOD基因被分别插在多角体启动子和P10启动子之下,实现了经口感染。摸索出重组杆状病毒DNA与转染剂混合比例和转染条件,在家蚕体内实现从DNA到病毒的转化,经口感染家蚕幼虫,大大简化外源基因表达的操作手续。表达的目的蛋白在感染后期常被降解,甚至在感染后期家蚕等昆虫组织器官也受到降解,给目的蛋白的纯化等处理带来许多麻烦,这已成为该表达系统,特别是在产业化开发时遇到的一个严重的问题。为了解决表达蛋白的稳定性。引进和采用了缺少半胱氨酸蛋白酶基因的Bacmid质粒载体(CPD),缺少半胱氨酸蛋白酶和几丁质酶基因的Bacmid质粒载体(CPPD),用这些改进后的Bacmid质粒载体表达外源基因,并在人胰岛素的表达中进行了对比；在猪蓝耳病病毒膜蛋白GP5和M基因表达实验中采用了缺少半胱氨酸蛋白酶基因的Bacmid质粒载体(CPD)。在家蚕体内表达出人胰岛素,开发出除大肠杆菌、酵母表达系统外,人胰岛素表达的第叁条途径。在家蚕体内表达出猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)表面抗原蛋白,经ELISA检验有抗原原性,开辟了用家蚕生产DNA等基因工程疫苗的新途径奠定了基础。
参考文献：
[1]. 棉铃虫核多角体病毒的传播动态及含SOD重组病毒的构建[D]. 周明哲. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）. 2004
[2]. 基于家蚕杆状病毒表达系统表达外源基因研究[D]. 岳万福. 浙江大学. 2009