碳源、氮源及其他条件对VB12发酵影响的研究

碳源、氮源及其他条件对VB12发酵影响的研究

李业英[1]2004年在《碳源、氮源及其他条件对VB_(12)发酵影响的研究》文中进行了进一步梳理本论文研究了碳源、氮源、温度、pH等因素对维生素B_(12)产生菌发酵的影响,并进行了补糖、补氨、以及丙酸对发酵影响的研究。其主要研究内容有以下几个方面: 1.碳源的筛选 实验结果表明碳源A是VB_(12)发酵的最佳碳源。 2.培养基中起始A浓度对发酵产素的影响 实验结果表明,培养基中A的含量对菌体的生长有较大的影响。在不同水平的A加量实验中,随着培养基中起始A浓度的增加,对数生长期的菌体生长速率逐渐下降;随着A浓度的增加,生物量经过了一个由低到高再到低的变化过程;发酵单位也经过了一个类似的过程,但与生物量的变化规律有所不同。同时,当培养基中A起始浓度达到7%以上时,会对菌体的生物量和发酵单位产生抑制作用。 3.发酵过程中补加A对发酵的影响 实验结果表明,补加A对发酵单位上升有促进作用,这种促进作用可能有两方面的原因1)可能是由于生物量的增加而产生的。2)可能是过程中较低的A浓度解除了其对VB_(12)合成的代谢反馈抑制,从而使发酵单位上升。 当A浓度维持在4%左右时并维持20—30小时,对发酵单位提高最为有利。 4.氮源的筛选 通过对氮源进行筛选得出氮源B是VB_(12)发酵的最佳氮源。 5.发酵过程中补加氨水对发酵的影响 实验结果表明,在一定的时期内补加氨水对发酵单位的上升有促进作用;补加时间过长会导致发酵单位的下降。 6.对氮源B的成分进行初步分析 氮源B对VB_(12)的发酵单位有很大影响,不同来源的B对发酵的影响也不一致,我们对其造成这种影响的原因进行了初步分析。 7.氨基氮变化规律 对发酵过程种氨基氮的变化规律进行了研究。表明初始A浓度和接种量的不同对氨基氮的变化有较大的影响。 摘要巴里里皿叁里里里巴里口里里口里里里里里巴里里孚里里里巴里里里里里8.温度及pH对VB:2发酵的影响 研究了温度及pH对菌体生长和A代谢的影响。9.前体添加时间和添加量对VB12发酵的影响及其它添加物对VB,2发酵的影响10.丙酸对VB12发酵的影响 丙酸作为VB12合成中的代谢产物,其产生对菌体的生长和A代谢有不利的影响。

周林[2]2007年在《高密度培养裂殖壶菌生产DHA》文中提出二十二碳六烯酸(DHA)是一种极其重要的ω-3系列高度不饱和脂肪酸,具有促进婴幼儿脑部发育、保护视力、提高机体免疫能力等重要生理功能。商业鱼油因DHA含量较低、有鱼腥味等诸多不利因素,难以满足市场需求,因此寻找微生物来源的DHA就显得日益迫切。本研究从浙江温州地区红树林中筛选得到一株产DHA真菌WZ-3,并通过18S rDNA鉴定为Schizochytrium sp.,经测定,Schizochytrium sp.油脂中几乎不含有EPA,是婴幼儿和孕期妇女比较理想的DHA来源。通过单因素实验对影响Schizochytrium sp.生长、油脂以及DHA积累的主要因素进行了选择,结果表明:葡萄糖、酵母粉分别是Schizochytrium sp.产DHA的最适碳源和氮源,最适摇瓶生长条件为:温度25℃、装液量100 ml/500 ml、初始pH6.0、种龄48h、接种量4%-6%、培养基盐度为自然海水的一半。采用Box-Behnken实验设计和响应面分析方法对Schizochytrium sp.发酵产DHA复合氮源培养基进行了优化,得到最佳培养基配方为:葡萄糖126 g·L~(-1)、酵母粉10 g·L~(-1)、玉米浆2 g·L~(-1)、大豆蛋白胨5 g·L~(-1)以及0.5倍自然海水。采用优化后的培养基及培养条件,发酵120 h菌体生物量干重最大可达42.9 g·L~(-1),油脂34.1 g·L~(-1),DHA13.8 g·L~(-1)。以合成培养基为基础,对B族维生素对Schizochytrium sp.油脂积累的影响进行了考察,发现:除维生素B_2对菌体油脂有一定的抑制作用以外,其余考察维生素对Schizochytrium sp.油脂积累都有不同程度的促进作用,其中生物素、硫辛酸、叶酸对油脂有比较好的促进作用。正交实验优化得到最佳维生素组合为:维生素B_1 5 mg·L~(-1)、维生素B_(12)14 mg·L~(-1)、生物素6 mg·L~(-1)、硫辛酸30 mg·L~(-1)、叶酸40 mg·L~(-1)。通过单一缺失实验设计对合成培养基中氨基酸氮源进行了考察,从20种基本氨基酸中挑选出10种Schizochytrium sp.发酵生产DHA必需的氨基酸种类,通过测量发酵过程中必须氨基酸的消耗量以及均匀实验设计对这10种必需氨基酸的用量进行了合理的优化,由多元线性逐步回归所得方程获得发酵DHA的最佳氨基酸组合为:丙氨酸2.0 g·L~(-1)、蛋氨酸1.2 g·L~(-1)、半胱氨酸0.2 g·L~(-1)、赖氨酸0.3 g·L~(-1)、组氨酸1.3 g·L~(-1)、谷氨酸1.4 g·L~(-1)、谷氨酰胺1.4 g·L~(-1)、异亮氨酸1.3 g·L~(-1)、苏氨酸1.0 g·L~(-1)、色氨酸1.6 g·L~(-1)。

杜军国[3]2013年在《蛹虫草生长发育条件研究》文中认为蛹虫草(Cordyceps militaris (L.) Link)是一种经济价值较高的药食两用真菌。由于其自然生长过程对环境条件有一定要求,目前,人们对其生长发育的规律还不十分明确,这制约了蛹虫草的规模化生产。本文通过对两株不同蛹虫草菌株进行优化筛选,确定出发菌株,然后对液体培养中营养因素和外界环境条件对菌丝体干重和虫草菌素含量的影响进行研究,探讨了碳氮源和无机盐以及温度、光照时间、空气湿度和通风时间对蛹虫草子实体生长发育的影响。同时对子实体生长过程中的还原糖、总糖的含量进行测定,考察了子实体发育过程中培养基中蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶的活性变化规律。1. CDM-003具有菌丝球大小均一,菌丝生长健壮,液体和固体发酵能力强等优点,确定为试验菌株。适合的斜面培养基配方为:马铃薯20%,葡萄糖1%,硫酸镁0.05%,琼脂1.5%;培养条件为:温度21-23℃,暗室培养。2.单因素试验和正交试验研究结果显示,CDM-003液体培养的最佳配方为:马铃薯20%,葡萄糖1.5%,蛋白胨0.5%,KH_2PO_40.15%,MgSO_4·7H_2O0.05%,VB10.005%,生长条件为:温度25℃,装液量48%,摇瓶转速160r/min,初始pH值为6.5。在此条件下菌丝体干重和虫草菌素含量分别为17.03g/L和14.39mg/L,比未优化前增加了25.6%和9.6%。各种因素对生长影响的重要性依次为KH_2PO_4>MgSO_4·7H_2O>VB1;对虫草菌素产量的影响依次为温度>摇床转速>装液量>初始pH值。3.固体培养研究表明:用麦粒培养基时菌丝浓密、整齐,生长速度快、粗壮,色泽橙黄,要优于大米培养基。配方为:小麦40%、马铃薯12%,葡萄糖1.2%,蛋白胨0.6%,KH_2PO_40.09%,MgSO_4·7H_2O0.03%,蚕蛹粉0.12%,料水比为1:1.5。4.单因素试验表明,通风时间为早晚各15min时子实体生长速度快。响应面优化试验得到了改良的固体培养条件:温度21.3℃、空气湿度为82.65%、光照时间为每天11.4h,在此条件下,菌丝生长旺盛,菌丝密,形成的原基数量多,子实体颜色鲜亮均一,质量好,畸形率低,55~60d即可成熟采摘。单瓶鲜重产量在20g~22g之间,比未优化前提高了18.3%,平均虫草菌素含量为0.4419mg/g。5.在蛹虫草的整个生长过程中,总糖含量呈“弓”形变化,在第45d时达到峰值0.6456mg/g,之后缓慢下降;还原糖含量呈“凸”形变化,在第35-45d时含量稳定在0.33mg/g左右,随后开始下降。6.液体和固体试验表明,虫草菌素一旦分泌到培养基中,就不会再被细胞吸收,呈不断累积的态势。单因素栽培试验同时表明,虫草菌素于菌株对生长环境的抗逆性有关7.对蛹虫草固体培养过程培养基中纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的活性进行测定,结果显示:在子座分化时,培养基中淀粉酶和蛋白酶活性出现一个极值;在子实体生长发育的高峰期,纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶活再出现一个极值,但纤维素酶活极值的出现滞后于淀粉酶活。

袁蜜[4]2013年在《蛹虫草培植技术及有效成分分析》文中进行了进一步梳理本文主要对蛹虫草菌种进行人工培养获得成熟的子实体,然后以子实体为材料,建立了一种一次进样同时测定蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的高效液相色谱分析法。在此基础上,本文通过改变碳源、氮源、维生素种类、营养液p H值、培养基质及蚕蛹粉用量,探索培养因素对蛹虫草子实体鲜重干重、多糖、蛋白质、虫草素和腺苷含量的影响。主要结论如下:(1)菌种传代实验将F0-F5五代菌种分别接种于固体培养基上培养,虽然前3代培养过程出现了菌种退化现象,但3代以后,虫草菌种生成子实体的能力又出现了好转迹象,观察继代培养各虫草菌丝的产孢结构,发现各代菌丝均为串生产孢结构,并未观察到球状产孢结构。(2)采用高效液相色谱法建立了同时测定蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的方法,并对样品提取条件进行了优化。以超纯水-甲醇(体积比84:16)为流动相,流速1.0 mL/min,经色谱柱XBridgeTM C18(5μm,4.6×250 mm)分离,柱温30℃,进样量10μL,紫外检测波长254 nm。腺苷和虫草素的空白回收率分别为99.13%和99.18%,加标回收率分别为95.78%和94.35%,最低检出限为0.01μg/mL。经单因素及正交实验,最终确定的优化提取条件为水为提取液、提取时间40 min、提取温度30℃、超声功率700 W、提取次数1次。样品前处理及分析方法操作简便、回收率高,重复性好。(3)氮源种类、蚕蛹粉及培养基质对蛹虫草子实体的鲜重和干重均有较为明显的影响。综合鲜重和干重,蛋白胨为最佳氮源。当麸皮作为氮源时,蛹虫草产量(鲜重16.32 g、干重3.80 g)虽低于蛋白胨,但也明显高于对照组(鲜重13.78 g、干重3.02 g),且其价格低廉,经济效益高;每瓶栽培培养基中加入0.5 g蚕蛹粉即可以获得比对照组高7.06 g的鲜重和1.37 g的干重,但随蚕蛹粉含量的增加,蛹虫草子实体的鲜重和干重并没有随之增加;小米(27.16 g、5.01 g)和小麦(25.26 g、4.20 g)作为培养基质可以获得较高的鲜重和干重。氮源、维生素及培养基质等因素均可较为明显的影响蛹虫草子实体中多糖含量。氮源为蛋白胨,维生素为VB1,培养基质为大米时,最有利于蛹虫草子实体中多糖含量的提高。豆粉作为氮源、高粱米或玉米为培养基质时,蛹虫草子实体中蛋白质含量较高。葡萄糖作为碳源时,蛹虫草子实体中腺苷含量最高(169.5 mg/100g),其次是麦芽糖(163.1 mg/100 g),同时,葡萄糖作为碳源时虫草素含量最高(149.0 mg/100 g),综合考虑腺苷和虫草素两个指标,葡萄糖为最佳碳源;当麸皮和豆粉作为氮源时,蛹虫草子实体中腺苷含量分别为(184.6 mg/100 g)、(178.8 mg/100 g),虫草素含量分别为(172.8mg/100 g)、(146.9 mg/100 g),因此,最佳氮源为麸皮,其次是豆粉;玉米作为培养基时,腺苷含量最高(248.5 mg/100 g),其次为小麦(225.9mg/100 g),而大米作为培养基时,腺苷含量最低(186.1 mg/100 g)。高粱米作为培养基时,虫草素含量最高(248.2 mg/100 g);当蚕蛹粉添加量为0.5 g时,腺苷含量(204.4 mg/100 g)高于对照组(179.6 mg/100 g),但并未随蚕蛹粉含量的提高而提高。

张帆[5]2011年在《大马勃生药学及发酵工艺学的研究》文中认为大马勃Calvatia gigantea (Batsch ex Pets) Lloyd属马勃科药用真菌,本论文对大马勃进行了较系统的生药学研究,并采用生物发酵工程方法,开展大马勃菌种分离、纯化、选育,发酵工艺,化学成分含量测定及药理活性的研究,以期为大马勃的优质培育和资源开发提供实验依据和理论基础。将采集后的大马勃子实体进行了基源、性状、显微及理化鉴别。采用组织分离法对其斜面菌种进行分离、纯化和选育,通过对不同营养元素和培养条件的考核,筛选出生长旺盛,无杂菌污染的优良菌种,用于液体发酵工艺学的研究。在大马勃液体发酵工艺研究中首先对液体培养基的营养成分进行考核,其营养成分包括碳源、氮源、微量元素,再根据单因子实验结果设计正交试验L9(34),筛选出最佳培养基配方;其次是对培养条件的考核,确定出最佳摇瓶装量、培养基初始pH值、培养温度、接种量;最后利用摇瓶菌种培养模拟大生产中发酵罐培养,考核了实验室生产发酵培养终止指标(菌丝湿重、干重、pH值、蛋白质含量、多糖含量、麦角甾醇含量)。当以大马勃中多糖为发酵代谢产物时,结合发酵过程中pH值、菌丝生物量等多项指标的分析,可以选择发酵第168h-第192h作为液体发酵终点,以麦角甾醇为代谢产物时,可以将第168h确定为发酵终点。利用紫外分光光度计法和高效液相色谱法法分别对大马勃子实体、大马勃发酵液、大马勃菌球中多糖及麦角甾醇进行含量测定,结果表明两种实验方法简单、准确,可作为质量控制的标准。本论文还通过抗炎镇痛及体外抑菌实验考察了大马勃子实体、大马勃发酵液、大马勃菌球的药理活性,叁个样品都含有相同或相似的抗炎镇痛活性及抑菌活性,并且其中大马勃发酵液效果最佳,所以初步认为大马勃液体发酵得到的产物可代替大马勃子实体作为药用。

杨娟娟[6]2016年在《冠突散囊菌固体发酵及其次级代谢产物影响因素的研究》文中研究表明冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是茯砖茶在加工过程中“发花”工艺的优势菌,并且具有较好的抗氧化、抑菌和抗肿瘤等功能,但是这些功能研究主要基于液体培养和纯培养发酵。为了更深入的研究冠突散囊菌的次级代谢产物及活性,论文探究了糖、氨基酸、无机盐因素对冠突散囊菌发酵的影响,并同时进行了冠突散囊菌与细菌、真菌及植物内生菌混合发酵产物影响的研究。后续对其发酵产物进行化学成分分离和结构鉴定,获得的单体化合物进行初步的细胞毒活性评价,为筛选抗肿瘤活性天然药物提供理论基础。通过碳源、氮源和无机盐因素对冠突散囊菌发酵的影响研究得出,在蛋氨酸3 g/L、CaBr2200 mM和NacL 100 mM条件影响下发酵产物活性较强。以及采用冠突散囊菌(E.cristatum)与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)进行共培养研究可知,共培养与纯培养冠突散囊菌发酵产物相比有差异显着性,由此为研究共培养产物的单体化合物提供实验基础,为挖掘活性次级代谢产物提供有利来源。并采用硅胶柱、凝胶柱和高效液相色谱等方法对冠突散囊菌与金黄色葡萄球菌固体混合发酵提取物进行分离纯化,从中分离鉴定了7个化合物,分别为echinulin(1),cristatumin F(2),neoechinulin A(3),preechinulin(4),flvoglaucin(5)和tetrahydroauroglaucine(6),epiheveadride(7)。抗肿瘤活性结果表明,7个化合物对4种肿瘤细胞株均具有不同程度的细胞毒活性,化合物(3)、(5)和(7)对肝癌Bel-7402细胞毒活性较强,并且发现化合物6和7目前为止并未有文献报道分离于纯培养的冠突散囊菌中,故共培养途径是拓宽次级代谢产物的来源之一。同时论文从一株山楂Crateagus Pinnatifida Bge根部分离的植物内生真菌,并通过形态学和分子生物学rDNAITS序列分析鉴定菌株为拟茎点霉Phomopsis mali。并从拟茎点霉固体发酵提取物中分离纯化了4个化合物,分别为交链孢酚单甲醚(8)、交链孢酚(9)、3-hydroxy-5,4′-dimethoxy-6′-methyl-6H-benzo[c]chromen-7-one(10)、(Z)-10-nonadecenoic acid(11)。细胞毒活性评价得出9和11对4种肿瘤细胞株均具有不同程度的细胞毒活性,9对肺癌A549和乳腺癌MCF-7细胞毒活性较强,11对肺癌A549细胞毒活性较强。并进行了冠突散囊菌与拟茎点霉的共培养研究,结果显示,共培养与纯培养冠突散囊菌HPLC谱图不一,为后续研究共培养代谢产物提供实验基础。

张立宏[7]2008年在《混合菌种生物技术(MCB)光合产氢的试验研究》文中研究指明随着能源的日益紧张以及环境污染的日益严重,作为清洁能源的氢能的研究逐渐受到重视。相对于传统的制氢方法,生物产氢由于低能耗、高效率、无污染以及可再生等优点而备受关注。其中光合生物产氢集太阳能利用、可再生资源利用、有机废弃物处理以及产氢相联合,将成为最有潜力的产氢技术。认识光合微生物产氢的规律,能动地利用这些客观规律指导能源工作,同时也是地球生态平衡、物质循环极为重要的一个环节。混合菌种是值得重视并需要加强研究和利用的微生物资源。混合菌种多种类细菌间发生协同效应,使代谢产物不易积累,相互创造有利的生存环境,使各菌种的代谢活性充分发挥,从而提高了混合菌种的产氢能力。混合菌种生物技术(MCB,mixed culturebiotechnology)可以成为超越基于传统单一纯菌株生产化学产物或者/和生物能源的生物技术的一种新的选择。与工业化生物技术的纯菌株相对比,利用混合菌种生物技术(MCB)光合产氢具有以下优点:不需要灭菌;由于微生物的多样性具有很强的适应能力;对于多种底物具有适应能力以及持续生产过程的可能性。本文对从沼气池活性污泥富集培养出以多种光合细菌为主的混合菌种进行了光合产氢的实验研究,同时以纯菌种沼泽红假单胞菌Rh.Palustris Z02作了相应的对比试验,并利用修正的Gompertz方程进行产氢动力学分析。结果表明,混合菌种比纯菌种的光合细菌表现出更好的产氢能力和更高的稳定性。尤其在对蔗糖和可溶性淀粉的利用上,混合菌种对这两种碳源的利用比较充分,产氢率分别为3.47 mol H_2/mol蔗糖和6.68 mmol H_2/g可溶性淀粉,氢气含量分别为83.30%和76.06%,且气相中没有甲烷气产生。此外,对各种参数,如pH、温度、接种量以及光强等对产氢率的影响进行了研究。表明混合菌种的产氢条件较Rh.Palustris Z02更为宽松。同时利用Arrhenius模型较好地反映混合菌种产氢速率与反应温度的关系。本文同时对影响光合细菌产氢的固氮酶的叁大调控因素:气相条件、NH_4~+、二价铁系金属离子对混合菌种生物技术(MCB)光合产氢影响进行了试验研究。结果表明气相中大量的O_2对固氮酶以及氢酶的毒害导致无法产氢,而微量O_2的存在却能对产氢有促进作用,尤其是在Ar与微量O_2的混合气相条件下,产氢率达到最高的2.38molH_2/mol乙酸钠,且产氢延迟期最短。同时发现气相条件对混合菌种产氢较纯菌种Rh.Palustris Z02的影响小。通过pH值的控制与不控制时不同NH_4~+浓度的对比产氢试验,发现不控制pH值时,NH_4~+对混合菌种光合产氢的抑制作用显着;而控制pH=7.0时,适当低浓度的NH_4~+可以提高混合菌种的光合产氢率以及产氢速率。无论是否控制pH值,只有NH_4~+被菌体的生长所消耗掉,才开始产氢,这表明NH_4~+对产氢的抑制作用在一定范围内是可恢复的。同时通过混合菌种与纯菌株Rh.Palustris Z02的对比试验发现,无论对于生长还是产氢,NH_4~+对混合菌种的影响均小于对纯菌株Rh.Palustris Z02的影响。二价铁系金属离子Fe~(2+)、Co~(2+)和Ni~(2+)作为金属酶的辅基对光合细菌的生长和产氢有重要的作用。通过对不同浓度的Fe~(2+),Co~(2+)和Ni~(2+)对光合细菌的生长与产氢的影响实验研究发现,适当浓度的二价铁系离子对产氢具有一定的促进作用,Fe~(2+),Co~(2+)和Ni~(2+)最佳产氢浓度分别为9μmol/L、0.45μmoI/L和0.1μmol/L。对产氢的影响作用大小顺序为:Fe~(2+)>Ni~(2+)>Co~(2+)。二价铁系离子在适当的浓度范围内可提高生长速率,其中Co~(2+)对生长的促进作用最大。pH值影响二价铁系离子对固氮酶活性的作用,当pH=7.0时,Fe~(2+)浓度的变化对产氢的影响最显着。随着pH值偏离7.0,Fe~(2+)浓度的变化对产氢的影响逐渐减小。碳源与氮源的种类和数量也是影响产氢活性的重要因素。通过对混合菌种利用不同氮源和碳源进行的产氢试验,确定了适合混合菌种光合产氢的氮源和碳源,并进一步确定了产氢最佳的C/N浓度比。本文最后通过对模拟含淀粉废水进行光合产氢的试验研究,确定了淀粉产氢的影响因素。结果发现淀粉浓度是影响光合产氢的一个主要因素,虽然淀粉是混合菌种光合产氢的非抑制性底物,即提高淀粉浓度可以提高产氢量,但对于产氢率来说则是随着淀粉浓度的增高而逐渐减小的,所以产氢过程中如何确定淀粉浓度,还需要综合考虑产氢速率、产氢延迟期等相关参数。结果表明混合菌种利用含淀粉废水光合产氢是可行的。本文同时对反应的菌液进行了DNA提取、纯化以及PCR扩增,通过对DGGE图谱分析,发现混合菌种利用淀粉光反应和暗反应产氢的样品条带在数量和亮度上都存在一定的差异,说明暗反应条件下产氢的优势菌群要略多于光合反应的菌群。

栾美丽[8]2006年在《根瘤土壤杆菌发酵生产辅酶Q_(10)的研究》文中研究说明辅酶Q_(10)(Coenzyme Q_(10),简写为CoQ_(10)),又称泛醌,在自然界中分布广泛,主要存在于酵母、植物叶子和种子及动物的心脏、肝脏和肾脏中。辅酶Q_(10)是细胞呼吸链上的一种递氢体,是细胞自身产生的天然抗氧化剂、细胞代谢激活剂。具有抗氧化性、消除自由基、提高机体免疫力、抗衰老等功能,广泛应用于各类心脏病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗。本文对根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens KY-3085)发酵制备辅酶Q_(10)的发酵条件及代谢途径进行了研究。 本文以根瘤土壤杆菌为出发菌株,对发酵培养基组成进行了优化,优化培养基组成为:蔗糖4%、牛肉粉1%、蛋白胨0.5%、硫酸铵0.2%、K_2HPO_4 0.05%、KH_2PO_4 0.05%,MgSO_4·7H_2O 0.03%。并确定了种子液的最佳培养时间为24h和最佳发酵时间为120h。另外,还确定了最佳的发酵条件为:初始pH值为7.5、接种量为5%、装液量为60mL。 在对代谢途径分析的基础上,研究添加前体物质(对羟基苯甲酸、茄尼醇和CoQ_0)对辅酶Q_(10)合成的影响,并确定了最佳添加方式。结果表明,添加前体物质对辅酶Q_(10)含量均有提高。其中,在发酵48h添加0.6g/L茄尼醇时,辅酶Q_(10)含量最高为8.92mg/L,比不添加茄尼醇时提高了43%。本文还探讨了添加维生素B_(12),甘油和甲硫氨酸对辅酶Q_(10)合成的影响。 由于CoQ_(10)是胞内产物,必须将细胞破壁,使之得以释放,才能进一步提取,故细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤。考察了研磨法、有机溶

崔筱[9]2012年在《虫生真菌—莱氏野村菌Nr1001菌株的生物学研究与应用》文中研究表明本文以从河南省农业科学院现代农业试验与示范基地的花生田罹病甜菜夜蛾幼虫虫尸上分离获得一株虫生真菌菌株(编号为1001)为研究对象,从形态学及分子生物学方面对其进行准确鉴定,并对该菌株的生物学特性、大规模培养方法、室内及田间防治效果等方面进行了研究,主要结果如下:通过室外采集样品,用组织分离法在PDA培养基上对所获得的菌株进行分离筛选,获得一株对鳞翅目夜蛾科幼虫具有较高毒力的虫生真菌菌株,编号为1001。将该菌株在PDA和SMAY培养基上培养,并对其进行形态学观察,结果表明,在PDA培养基上,菌落呈致密的短绒毛状,初时白色,且生长缓慢,一个月内直径才达0.6~1.8cm。在SMAY培养基上10天后的菌落直径2.6cm,约5-7天后产孢,产孢后菌落为黄绿色或绿色,大约10-15天后,孢子会被新萌发的菌丝所覆盖,无霉味和渗出物,背面无色或微黄。通过对该菌株进行显微观察,结果表明,其分生孢子呈椭圆形或圆筒形,一端稍尖,一端略钝,表面光滑,有些孢子之间有连接,淡绿色。分生孢子大小为(4.5~5.2)×(2.8~3.5)μm。营养菌丝光滑,分隔,透明或稍带颜色,菌丝直径2μm-3μm,无孢梗束。该菌株初步鉴定为莱氏野村菌。用分子生物学方法对该菌株的rDNA-ITS序列进行测序并在NCBI网站GenBank数据库中进行序列比对,结果表明,该菌ITS序列长度为619bp,与Nomuraea rileyi MAFF830007同源性为99%;与另外两个Nomuraea rileyi菌株的序列也只有3个碱基的差别,由此,进一步判定该菌株为莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)。将该菌株在含有不同C、N源、C/N及维生素和微量元素的培养基上进行培养,并通过DPS软件进行分析,结果表明,适宜菌丝生长和产孢的的碳源分别为葡萄糖和棉子糖,氮源为酵母粉;当C/N比分别为15:1和30:1时,最适宜其菌丝生长和产孢,添加微量元素锰、铁和维生素VB3、VB12等对莱氏野村菌的生长和产孢有促进作用。将该菌株在不同的温度、pH、湿度、光照、接种量及摇床转速下进行固体和液体培养,并用DPS软件进行分析,结果表明,在固体培养条件下,最适宜生长和产孢的温度、pH和光照和湿度分别为30℃和25℃、pH=7、8L/16D和95%。在液体培养条件下,当pH为6时最适宜其生长,当接种量和摇床转速分别为1ml和180rpm时,菌丝干重达到最大值。通过四因素五水平的正交试验,用SPSS软件进行分析,筛选出了最利于其产孢的固体培养基配方为麦芽糖20g/L、酵母5g/L、Mn15mg/L、VB120.1mg/L。用液固双相法大量培养莱氏野村菌分生孢子,结果表明:以60g大豆为基质加入6%麦芽糖的组合为大量培养莱氏野村菌分生孢子最优配方。以浓度分别为1.14×109孢子·mL-1、1.14×108孢子·mL-1、1.14×107孢子·mL-1、1.14×106孢子·mL-1、1.14×105孢子·mL-1的Nr1001孢悬液对棉铃虫叁龄幼虫进行室内毒力试验,经过SPSS软件分析,死亡率分别为70.53%、46.4%、34.4%、22.19%、19.12%,接种后第13天的致死中浓度为LC50=1.163×108个孢子·mL-1,毒力回归方程式为:Y=0.383X-3.088。用9种不同药剂进行田间试验并用DPS软件进行分析,结果表明,莱氏野村菌Nr1001菌株对大豆田夜蛾科幼虫具有较好的防治效果,施药后3天、7天、14天虫口减退率和校正防效分别为76.65%和55.18%、95.15%和58.75%、99.43%和98.77%,略低于化学药剂康宽的虫口减退率和校正防效(3天的分别为88.51%和63.40%、7天的为99.39%和95.93%、14天的为100%和100%),且持效性高于市售的白僵菌高孢粉,表明该菌株具有较好的开发应用前景。

陆震[10]2011年在《埃博霉素生产菌株选育及埃博霉素抑瘤活性研究》文中指出粘细菌是一种革兰氏阴性细菌,它具有复杂的多细胞行为,纤维堆囊菌是粘细菌中能够降解纤维素的类群之一。纤维堆囊菌能够产生多种抗真菌、抗细菌和抗肿瘤作用的生物活性物质,其中,通过稳定微管来抑制肿瘤细胞生长的大环内酯类抗生素埃博霉素尤为引人注目。到目前为止,埃博霉素类药物已成功上市,在抗击肿瘤细胞中起到十分重要的作用。然而,埃博霉素的生产主要依赖于化学合成法,相比之下,微生物生产法却并未广泛应用,主要限制是由于其产生菌纤维堆囊菌发酵产量水平较低,选育高产纤维堆囊菌来提高埃博霉素产量具有工业指导意义。本文对纤维堆囊菌So 0157-2进行了高效的菌株选育,筛选到了埃博霉素A、B产量均有大幅度提高的突变株LG3111776,其高产菌株埃博霉素A、B产量分别为出发菌株的5倍和3倍左右。接下来,我们又对埃博霉素抗肿瘤机理进行了深入的分析,阐述了埃博霉素A、B混合制剂之间的协同作用以及埃博霉素对凋亡、自噬的作用现象进行了说明。在菌株选育中,文中以纤维堆囊菌So 0157-2作为出发菌株,引进pH极端环境胁迫选育法对出发菌株进行驯化,富集优势菌株,并对四株耐受菌株通过高效液相色谱法检测其发酵液中埃博霉素A、B,以埃博霉素标准曲线进行拟合分析其产量变化,筛选产量提高的优势菌株LG31。LG31再次作为出发菌株,利用传统的紫外诱变和硫酸二乙酯诱变,结合96孔板高通量筛选法初筛、高效液相色谱法验证,进一步筛选出了突变株LG31-11-7。随后,菌株LG31-11-7采用紫外诱变与推理选育相结合的方法,分别以耐受高浓度前体乙酸钠和耐受高浓度终产物两个角度进行了高效的选育工作,并配合生物指示法和TLC薄层层析法快速筛选正突变株,得到了最终的高产菌株LG3111776。对高产菌株LG3111776进行了发酵条件优化,使埃博霉素产量稳定提高,最终稳定在43.1 mg/L和22.9 mg/L左右,较初始菌株产量提高了5倍多和3倍多。不但为原生质体融合提供了菌株多样性的亲本,并且为工业生产提高了良好的菌株资源。当埃博霉素作用于多株肿瘤细胞系时,埃博霉素表现出了良好的抗肿瘤活性。其中,PC3、HELA、KB、K562、MCF-7、U87对埃博霉素最为敏感,并且埃博霉素A、B混合制剂作用后,发现了独特的协同效应。通过细胞周期、细胞凋亡以及Xcelligence监控细胞生长叁种方法进一步验证了这种协同效应。我们推断这种协同效应出现的可能原因是埃博霉素A、B之间的竞争作用以及埃博霉素与肿瘤细胞表面蛋白之间离子电荷吸引作用力达到不同程度的饱和而引起的。另外,当埃博霉素A、B作用于U87/LC3肿瘤细胞时,荧光显微镜的观察显示埃博霉素能够引起LC3蛋白(微管相关蛋白)点聚状典型性变化,说明埃博霉素可以诱导U87细胞发生自噬现象,而自噬现象是细胞程序性死亡的途径之一。通过对U87细胞LC3蛋白进行GFP荧光转染标记,我们可以清晰的观察到由于自噬现象而引起细胞质中的点状结构。DAPI染色细胞核的变化过程则从另一方面说明了埃博霉素在诱导U87细胞凋亡和自噬的之间具有一定依赖作用,这将有助于对埃博霉素药物抑制肿瘤细胞活性机理的分析。

参考文献:

[1]. 碳源、氮源及其他条件对VB_(12)发酵影响的研究[D]. 李业英. 河北大学. 2004

[2]. 高密度培养裂殖壶菌生产DHA[D]. 周林. 厦门大学. 2007

[3]. 蛹虫草生长发育条件研究[D]. 杜军国. 陕西科技大学. 2013

[4]. 蛹虫草培植技术及有效成分分析[D]. 袁蜜. 上海交通大学. 2013

[5]. 大马勃生药学及发酵工艺学的研究[D]. 张帆. 长春中医药大学. 2011

[6]. 冠突散囊菌固体发酵及其次级代谢产物影响因素的研究[D]. 杨娟娟. 塔里木大学. 2016

[7]. 混合菌种生物技术(MCB)光合产氢的试验研究[D]. 张立宏. 浙江大学. 2008

[8]. 根瘤土壤杆菌发酵生产辅酶Q_(10)的研究[D]. 栾美丽. 北京化工大学. 2006

[9]. 虫生真菌—莱氏野村菌Nr1001菌株的生物学研究与应用[D]. 崔筱. 河南大学. 2012

[10]. 埃博霉素生产菌株选育及埃博霉素抑瘤活性研究[D]. 陆震. 山东轻工业学院. 2011

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碳源、氮源及其他条件对VB12发酵影响的研究
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