易犁[1]2003年在《弗兰克氏菌的分子鉴定和遗传多样性研究》文中研究说明本研究课题对来自杨梅(Myrica)、木麻黄(Casuarina)、桤木(Alnus)和马桑(Coriaria)的13株Frankia菌纯培养的16S rRNA基因进行了PCR-RFLP分析和部分菌株的序列测定，初步探讨了弗兰克氏菌的遗传多样性和系统发育地位。包括以下主要内容及结果。 通过比较已发表的原核生物，如大肠杆菌、根瘤菌和弗兰克氏菌的16S rRNA基因全序列的保守区，设计了8对引物并筛选出可适用于扩增13株供试菌株16S rRNA基因接近全长序列的引物：UF／UR和Ec27f／Fr1717r(产物大小约1500bp)。进一步试验和序列测定发现利用引物UF／UR所得扩增产物的重复性更好，并在随后的RFLP分析中能较一致地揭示出供试菌株的遗传多样性。 用限制性内切酶AfaⅠ、HaeⅢ、HhaⅠ、HinfⅠ、MspⅠ和Sau3AⅠ分别对引物UF／UR和Ec27f／Fr1717r的扩增产物进行RFLP(限制性酶切片段长度多态性)分析。后经测序选取与16S rRNA基因更符合的引物UF／UR的扩增酶切结果进行进一步的聚类分析。根据酶切图谱，通过Popgen2软件计算各供试菌株之间的遗传距离；用Shannon信息指数计算种群遗传多样性；利用UPGMA法(Mega2软件)对所获得的遗传距离矩阵进行聚类分析，得到13株供试Frankia菌株间系统发育的聚类分析树状图谱。结果显示弗兰克氏菌种群内的遗传多样性较高，种群分化较大，13株供试Frankia菌株平均每个位点的多样性指数为0.4498。根据酶切聚类树状图谱将13株供试Frankia菌株分为4个不同类群：马桑类群、木麻黄—杨梅类群、杨梅类群和杨梅—桤木—木麻黄类群。其中，马桑类群表现出与其他类群有着明显的差异，暗示其可能具有独特的系统发育地位。这一结果与胡传炯等(1998)对马桑菌株Cs030进行nif—RFLP分析所得的结论以及Nick等(1992)在检测马桑根瘤内生菌的部分序列后所得的结论都是相一致的。此外，聚类分析还表明，不同宿主来源的菌株之间存在着交叉，特别是来自于木麻黄和杨梅的菌株，其交叉尤其明显。但是，研究供试菌株得到的分群与较细的宿主种类划分和宿主的地理分布并无密切相关。 选取其中5株供试菌株进行16S rDNA全序列分析，通过网上BLAST、计算机软件聚类分析和与其它已发表序列的菌株相比较进一步表明来自木麻黄和杨梅的菌株有着明显的交叉，它们的分群结果比较混杂。5株供试菌株与其它已发表菌株的全序列比较结果可将所有菌株大致划分为4个簇，杨梅菌株FMr61、木麻黄菌株FCg07和木麻黄菌株FCe42具有较高相似性与桤木菌株聚为第Ⅰ簇；而杨梅菌株FMr16和2215与来自胡颓子科和沙棘的菌株聚在一起归为第Ⅳ簇。这些结果与Baker(1987)通过交叉感染试验将来自不同宿主的50株Frankia菌株分成4个类群的结果部分一致，但也暗示其可能具有局限性；此外，分析杨梅和木麻黄菌株所得到的结论支持了Normand等(1996)与华中农业大学硕十研究生学位论文李志真(2002)所得的结论，即木麻黄和杨梅的菌株比较混杂，两者都不能成为独立的类群。 本研究还尝试直接从植物根瘤中提取凡刁刀kz’a内生菌总DNA并对其165 rRNA基因做PCR一RFLP分析的工作。由于材料和时间有限没有获得成功，但积累了不少经验，为以后继续类似研究打下基础。
徐瑞瑞[2]2011年在《沙棘弗兰克氏和非弗兰克氏放线菌的分离、培养及分子鉴定》文中认为沙棘(Hippophae rhamnoides L.)属胡颓子科沙棘属植物,是我国北方半干旱地区的先锋树种,因其能与弗兰克氏菌(Frankia)共生在根部形成固氮根瘤,能将大气中分子态的氮还原成氨供植物吸收利用,能在瘠薄土壤和较恶劣的环境中生长,是改良土壤、治理水土流失、改善生态环境的优良生态经济型树种。并且,沙棘的果、叶和种子中含有大量的营养成分和对人体有重要意义的生物活性物质。为了更好的开发利用沙棘共生固氮特性,本论文对沙棘根瘤弗兰克氏菌的分离培养条件及其系统发育地位进行了初步的研究,主要的实验结果如下:(1)沙棘根瘤弗兰克氏菌的系统发育地位。采集不同生态环境不同沙棘品种的根瘤,从根瘤内直接扩增DNA,共得到39条根瘤内生菌的16SrDNA序列,属于20个单倍型,其中磴口沙棘根瘤内生菌的16SrDNA序列有19条,属于4个单倍型,孙吴的根瘤内生菌的16SrDNA序列有20条,属于16个单倍型,两个地区间的根瘤内生菌没有共享的单倍型,不存在基因交流。基于基因库中下载的和沙棘根瘤扩增的16SrDNA序列构建系统发育树,将不同地域、不同宿主来源的弗兰克氏菌分为4个明显的分支,包括胡颓子侵染组、杨梅-木麻黄-赤杨侵染组、非典型菌株和未获得纯培养的根瘤弗兰克氏菌组。其中来自沙棘根瘤的内生菌以52%的支持率全部聚在了胡颓子侵染组,均属于弗兰克氏菌。(2)沙棘根瘤内生菌的分离、培养。实验选取新鲜幼嫩的沙棘根瘤,采用BAP培养基和QMOD培养基,经根瘤匀浆法和切片法从表面消毒的根瘤中分离根瘤内生菌,经纯化得到18个纯培养菌株,其中通过切片法分离到14株,匀浆法得到4株。研究发现,根瘤切片法、BAP培养基及液体培养的方式更适合沙棘根瘤内生菌的分离,液体培养能有效的分离菌株,菌落出现时间比固体分离早7-10天左右。(3)沙棘根瘤纯培养菌株的形态特征和分子鉴定。从沙棘根瘤中分离的18株纯培养菌株除了JYY61、JYY62,其余都具有发达的气生菌丝,在显微镜下所有菌株都有分支状的菌丝,但没有弗兰克氏菌典型的泡囊及孢子囊结构,均不属于弗兰克氏放线菌。根据基内菌丝和气生菌丝发育情况、菌丝与培养基结合程度、液体培养是否产生菌膜以及菌丝有无隔膜、孢子分化等形态培养特征,将来自沙棘根瘤的18个菌株分为两类,并初步判定第一类菌株属于诺卡氏菌属(Nocardia),第二类菌株属于小单孢菌属(Micromonospora)。基于网上下载和实验得到的16SrDNA基因序列构建的系统发育树(NJ树和MP树),18株非弗兰克氏放线菌被分为明显的两个分支,分别属于诺卡氏菌属分支和小单孢菌属分支,16SrDNA基因序列分析的系统分类结果支持基于菌株形态培养特征划分的两个类群。
黄金芳[3]2007年在《福建省弗兰克氏菌遗传多样性研究》文中研究表明弗兰克氏菌(Frankia)是一类能够在非豆科植物根部形成根瘤、进行共生固氮作用的放线菌。弗兰克氏菌可以侵染不同科、属、种的宿主植物，而且具有防止固氮作用受氧损伤的独特机制，因此比根瘤菌共生固氮系统更具优势。弗兰克氏菌的研究对农林业生产和生态环境保护均有重要的意义和应用前景。弗兰克氏菌分类中属以上的分类地位已经确定，属以下的分类和分群仍十分混乱，尚无统一标准。研究弗兰克氏菌的遗传多样性，明确弗兰克氏菌的类群组成，对于扩大利用其共生固氮体系具有积极的意义。本文从形态培养和分子遗传等两个层面研究了福建省非豆科固氮树种木麻黄(Casuarina)、杨梅(Myrica)、桤木(Alnus)和胡颓子(Elaeagnus)的共生固氮菌弗兰克氏菌的遗传多样性。研究了弗兰克氏菌的形态特征、培养特性和分子多样性等生物学特性，结果表明福建省弗兰克氏菌是个复杂的群体，有着丰富的遗传多样性，类群分化大；弗兰克氏菌的遗传变异与宿主来源、地理分布没有明确的对应关系；分子多样性分析比形态观察更能精确反应弗兰克氏菌的遗传差异。
徐宽[4]2011年在《几种药用植物内生放线菌的分离、抗菌活性初探及遗传多样性研究》文中研究指明放线菌广泛分布于自然界的各种生态环境,又因为放线菌能够产生多种具有重要的经济价值和广泛的实际用途的天然次生代谢产物而备受国内外学者关注。四川省的地质地貌和气候特征复杂多样,适宜多种多样的药用植物生长。与这些药用植物形成内生关系的放线菌,在长期的共同进化过程中,具有与药用植物相似,或者相同的遗传与代谢特性,极有可能存在可以产生新的活性物质的新的放线菌,因此药用植物内生放线菌作为一类新的微生物资源,具有很好的开发潜力。本研究以四川雅安地区采集的野生药用植物为研究对象,对其内生放线菌的种群和系统发育进行了研究,并对其抗菌活性进行了初探,以期为开发利用野生药用植物内生放线菌资源奠定基础。本研究取得了如下结果：本研究用5种不同的放线菌分离培养基,从四川省雅安市采集的7种野生药用植物中分离出内生放线菌106株。其中改良高氏一号培养基分离得到的放线菌数量最多,分别为33株,柠檬酸盐培养基分离的数量最少。内生放线菌在植株内的分布也有很大差异,其中从根内分离获得了63株放线菌,占分离总数的59.5%,叶中分离的比例最小,仅有7.5%。对42株内生放线菌代表菌株以Haelll、Rsa I两个限制内切酶进行16S rDNA-RFLP分析,再由聚类结果选取10株内生放线菌测定16S rDNA全序列。供试的内生放线菌菌株在66%的相似性上聚在一起。在73%相似水平上,供试的内生放线菌菌株分成了6个ARDRA遗传类型。其中,群Ⅱ是最主要的类群,包含了24株。16S rRNA序列分析表明,分离得到的内生放线菌分布于7个属,分别是链霉菌属(Streptomyces sp.)、厄氏菌属(Oerskovia sp.)、野野村菌属(Nonomuraea.sp.)、小单孢菌属(Micromonospora sp.)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis),糖霉菌属(Glycomyces)和纤维菌属(Cellulosimicrobium)。显示了药用植物内生放线菌具有较为丰富的多样性。对分离出的42株内生放线菌代表菌株进行抗菌活性初探发现,供试的42株内生放线菌菌株对2株细菌和9株病原真菌均具有不同程度的抗菌活性。其中,对玉米小斑病(Bipolaris maydis)抑菌效果最佳,90%的菌株具有抑菌活性,最大抑菌圈达到15mm；对西瓜枯萎病(Fusarium oxysporum)、玉米弯孢病(Curvularia lunata)以及禾谷镰刀菌病(Fusarium graminearum)抑制作用较强,抑菌率在70%以上。但对棉花黄萎病(Verticilliam wilt)、大肠杆菌(Escherichia coli)抑菌效果不明显。具有较好抑菌活性的菌株大多数是属于链霉菌属(Streptomyces)。本研究的结果表明,药用植物内蕴藏着种类丰富的内生放线菌,具有不同程度的抗菌活性,该类微生物是寻找新型生物活性物质的重要资源。
参考文献：
[1]. 弗兰克氏菌的分子鉴定和遗传多样性研究[D]. 易犁. 华中农业大学. 2003
[2]. 沙棘弗兰克氏和非弗兰克氏放线菌的分离、培养及分子鉴定[D]. 徐瑞瑞. 中国林业科学研究院. 2011
[3]. 福建省弗兰克氏菌遗传多样性研究[D]. 黄金芳. 福建师范大学. 2007
[4]. 几种药用植物内生放线菌的分离、抗菌活性初探及遗传多样性研究[D]. 徐宽. 四川农业大学. 2011