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植物OPA3-like基因功能的初步研究

2020-12-08阅读(123)

植物OPA3-like基因功能的初步研究

论文摘要

3型视神经萎缩（Optic atrophy type 3,OPA3）又被称为视神经萎缩综合征,是一种常染色体隐性神经眼病综合征,其症状包括早发性双侧视神经萎缩和晚期发育痉挛。3型视神经萎缩是由OPA3蛋白功能缺失引起的。OPA3是由核基因组编码,定位于线粒体的蛋白质。OPA3的同源基因也存在于真菌和植物中。植物中,马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）的辅助蛋白酶（Helper component proteinase,HC-Pro）可以帮助马铃薯Y病毒入侵植物,影响叶绿体分裂。而番茄OPA3-like蛋白与HC-Pro蛋白在酵母细胞中可以相互作用,同时HC-Pro蛋白与番茄OPA3-like蛋白在洋葱表皮细胞的质膜上也可以互作。因而猜测这两种蛋白可能存在相关性。在烟草表皮细胞中,番茄OPA3-like蛋白定位于叶绿体,说明该蛋白可能于叶绿体有关。目的:通过对番茄OPA3-like（SlOPA3L）基因和烟草OPA3-like（NtOPA3L）基因的研究,初步探究植物OPA3-like基因的功能。方法:使用在线软件ProtParam、SignalP、SOPMA、ProtScale、TMHMM和WoLFPSORT分析蛋白质理化性质、信号肽、二级结构和跨膜结构域;构建了NtOPA3L基因的过表达载体pBP-Nt-OPA3L1、pBP-Nt-OPA3L2和干扰载体pBRi-Nt-OPA3L1、pBRi-Nt-OPA3L2,通过农杆菌介导转化烟草;构建SlOPA3L基因的CRISPR/Cas9载体pKAN-sgRNA-Cas9-OPA3,通过农杆菌介导转化番茄;将实验室前期构建的SlOPA3L基因的过表达载体SlpBP-OPA3-like和干扰载体SlpBRi-OPA3-like通过农杆菌介导转化番茄;利用过量表达SlOPA3L基因的转基因烟草T2代种子进行分析统计实验和盐抗逆实验。结果:（1）生物信息学预测植物OPA3-like是不稳定蛋白,无跨膜结构域,定位于叶绿体和线粒体,拟南芥OPA3-like蛋白的N端信号锚定序列的24位有一个信号肽剪切位点,且为分泌蛋白。（2）T1代过表达SlOPA3L基因的转基因番茄植株矮化,分枝多,易玻璃化;T1代干扰SlOPA3-like基因的转基因番茄植株高大,分枝少,顶端分枝易枯黄。（3）T2代过表达SlOPA3-like基因的转基因烟草子叶上部分组织失绿,叶片呈花叶状,而绝大多数转基因植株的真叶与WT烟草的没有明显区别,少数早期真叶呈花叶表型的转基因植株,后期生长的叶片又恢复了正常。（4）成功构建了NtOPA3L基因的过表达载体pBP-Nt-OPA3L1和pBP-Nt-OPA3L2、干扰载体pBRi-Nt-OPA3L1和pBRi-NtOPA3L2;成功构建了SlOPA3L基因CRISPR/Cas9载体pKAN-sgRNA-Cas9-OPA3。（5）获得了过量表达NtOPA3-like基因的转基因烟草pBP-Nt-OPA3L1;获得了SlOPA3-like基因的CRISPR/Cas9载体表达的转基因番茄pKAN-sgRNA-Cas9-OPA3。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 OPA3 基因的功能研究及现状
  •     1.1.1 动物OPA3 基因功能研究
  •     1.1.2 植物OPA3-like基因和研究
  •     1.1.3 OPA3 的信息学分析
  •     1.1.4 OPA3 的亚细胞定位
  •   1.2 敲除载体的研究
  •     1.2.1 CRISPR的序列发现
  •     1.2.2 CRISPR-Cas系统三种类型
  •     1.2.3 CRISPR-Cas9 编辑系统作用机理
  •     1.2.4 CRISPR-Cas9 技术的的应用
  •   1.3 RNAi技术的研究
  •     1.3.1 RNAi技术的起源
  •     1.3.2 RNAi技术的原理
  •     1.3.3 RNAi技术的应用
  •   1.4 叶绿体的发育的研究
  •     1.4.1 叶绿体的起源
  •     1.4.2 叶绿体参与细胞凋亡
  •   1.5 研究内容及意义
  • 第二章 生物信息学分析
  •   2.1 方法
  •     2.1.1 植物OPA3-like基因序列的获取
  •     2.1.2 植物OPA3-like蛋白生物信息学分析
  •   2.2 结果分析
  •     2.2.1 植物OPA3-like蛋白质氨基酸序列比对
  •     2.2.2 植物OPA3-like蛋白质理化性质分析
  •     2.2.3 植物OPA3-like二级结构预测
  •     2.2.4 植物OPA3-like蛋白质亲水性与跨膜区预测
  •     2.2.5 植物OPA3-like蛋白的亚细胞定位预测
  •     2.2.6 植物OPA3-like蛋白信号肽预测
  •   2.3 小结与讨论
  • 第三章 植物表达载体的构建
  •   3.1 材料
  •     3.1.1 实验载体
  •     3.1.2 主要实验仪器
  •     3.1.3 主要实验试剂
  •     3.1.4 培养基的配置
  •   3.2 方法
  •     3.2.1 NtOPA3-like基因片段的PCR引物设计及扩增
  •     3.2.2 NtOPA3-like基因片段的T载体的构建及测序
  •     3.2.3 SlSg-OPA3 基因敲除载体的构建
  •     3.2.4 NtOPA3-like基因过表达载体的构建
  •     3.2.5 NtOPA3-like基因干扰载体的构建
  •   3.3 结果分析
  •     3.3.1 NtOPA3-like基因目标片段的获取及鉴定
  •     3.3.2 NtOPA3-like基因过表达载体的鉴定
  •     3.3.3 NtOPA3-like基因干扰载体的鉴定
  •     3.3.4 Sl OPA3-like基因敲除载体鉴定
  •   3.4 小结与讨论
  • 第四章 植物表达载体的遗传转化
  •   4.1 材料
  •     4.1.1 菌株和植物材料
  •     4.1.2 主要仪器设备
  •     4.1.3 主要试剂
  •   4.2 方法
  •     4.2.1 电击转化农杆菌
  •     4.2.2 种子的无菌种植
  •     4.2.3 农杆菌转化植物
  •     4.2.4 植物组织培养
  •     4.2.5 转基因植株的PCR检测
  •   4.3 结果分析
  •     4.3.1 转基因植株的鉴定
  •     4.3.2 转基因植株表型观察
  •   4.4 结果与讨论
  • 第五章 番茄OPA3-like基因功能初步分析
  •   5.1 材料
  •     5.1.1 植物材料
  •     5.1.2 实验试剂
  •     5.1.3 试剂配置
  •   5.2 方法
  •     5.2.1 Sl OPA3-like基因的T2 代转基因烟草的分离比统计
  •     5.2.2 Sl OPA3-like基因的T2 代转基因烟草的表型观察
  •     5.2.3 盐胁迫实验
  •     5.2.4 机械摩擦接毒实验
  •     5.2.5 Sl OPA3-like基因的转基因烟草叶片横细胞形态观察
  •   5.3 结果分析
  •     5.3.1 Sl OPA3-like基因的T2 代转基因烟草的获得
  •     5.3.2 Sl OPA3-like基因的转基因烟草的子叶表型观察
  •     5.3.3 Sl OPA3-like基因的转基因烟草的子叶花叶现象在T2 代烟草中的表达
  •     5.3.4 Sl OPA3-like基因的转基因烟草真叶表型恢复现象
  •     5.3.5 Sl OPA3-like基因烟草真叶细胞形态观察
  •     5.3.6 机械接毒烟草的现象
  •     5.3.7 高盐对Sl OPA3-like基因转基因烟草的影响
  •   5.4 小结与讨论
  • 第六章 结论与讨论
  •   6.1 植物OPA3-like的生物信息学分析
  •   6.2 T1 代转基因烟草和番茄表型分析
  •   6.3 T2 代转基因烟草Slp BP-OPA3-like表型分析及生理检测
  •   6.4 后续实验与展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介
  • 附件

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 柏鸽

    导师: 崔百明

    关键词: 叶绿体,子叶,花叶

    来源: 石河子大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 石河子大学

    分类号: Q943.2

    总页数: 64

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