王良喜[1]2004年在《防治SIRS寡核苷酸的分子设计及其活性研究》文中进行了进一步梳理目的 全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是严重烧伤、创伤的常见并发症，由其发展而来的MODS病死率高达30％～50％，但目前临床尚缺乏能有效防治SIRS的药物。细菌DNA是SIRS的主要启动因子之一，因此拮抗细菌DNA对于防治SIRS具有重要意义。自身无致炎作用的Adv2 DNA、Adv5DNA能够拮抗细菌DNA诱导的细胞因子释放，因此本研究旨在通过对Adv2、5 DNA的分析研究，寻找能够拮抗细菌DNA的活性片段CpG-N ODN。 方法 ①从Pub-Med中获取Adv2、5、12 DNA和EC DNA序列，采用BioEdit等3种软件对Adv2、5、12 DNA和EC DNA进行序列分析和比较，完成CpG-N ODNs的初步设计；从中挑选10个序列并合成，观察其诱导人外周血单个核细胞释放TNF-α的能力(初筛)以及抑制CpG-S ODN诱导的TNF-α释放的能力(复筛)；②根据上述结果，采用RNAstructure软件，从DNA结构与自由能之间的关系，对CpG-N ODN进行再设计。挑选11条CpG-N ODNs并对其生物学活性进行筛选；③对CpG-N ODN208拮抗CpG-S ODN的时效关系、以及对CpG-S ODN攻击小鼠的保护作用等进行了初步研究。 结果 ①确定了Adv2、5 DNA中特有的19种CpG基序，以及含上述CpG基序的12核苷酸CpG ODN，但均不具备CpG-N ODN的作用；②通过对CpG-N ODN的再设计，获得了6条具有抑制CpG-S ODN释放TNF-α作用的CpG-N ODN；CpG-NODN208抑制CpG-S ODN释放TNF-α的活性最强，并呈显著的时间-效应关系；③CpG-N ODN208对CpG-S ODN攻击小鼠具有显着的保护作用，小鼠7天死亡率由90％(9／10)下降至60％(6／10)。 结论 获得了6条对CpG-S ODN具有拮抗作用的CpG-N ODN，CpG-N ODN208对CpG-S ODN攻击小鼠具有显着的保护作用。
王良喜, 周红[2]2008年在《CpG-N ODN208的体外、体内活性初步研究》文中研究表明目的:细菌DNA能够诱发全身炎症反应综合征(SIRS),因此拮抗细菌DNA对于防治SIRS具有重要意义。刺激性CpG寡核苷酸(stimulating CpG ODN,CpG-S ODN)是细菌DNA的活性片段。2型、5型腺病毒的DNA(Adv2、5 DNA)不但无刺激性,而且还能够拮抗细菌DNA的刺激作用。推测Adv2、5 DNA的活性片段为抑制性CpG寡核苷酸(neutralizing CpG ODN,CpG-N ODN)。先前的研究中,我们利用生物信息学技术对Adv2、5 DNA进行了分析研究,并据此设计出了21个可能的CpG-N ODN分子;通过活性筛选,获得了6条CpG-N ODN,其中CpG-N ODN208活性最强。本研究旨在探讨CpG-N ODN208拮抗CpG-S ODN诱导的TNF-释放的时效关系、CpG-N ODN208的体外毒性作用、CpG-N ODN208对CpG-S ODN攻击小鼠的保护作用。方法CpG-S ODN加入前后的不同时相点加入CpG-N ODN208,ELISA法测定细胞培养上清TNF-水平:CpG-N ODN208溶血试验;MTT法检测CpG-N ODN208对细胞活力的影响。清洁级昆明小鼠50只,实验前1h腹腔注射D-GalN敏化,随机分为CpG-S ODN攻击组、CpG-N ODN208+CpG-S ODN治疗组、CDG-N ODN208对照组、D-GalN对照组和生理盐水对照组。CpG-N ODN208+CpG-S ODN治疗组在给予CpG-N ODN208后立即给予CpG-S ODN。观察7d内各组小鼠的死亡率及死亡时间分布。结果CpG-N ODN208抑制CpG-S ODN诱导的TNF-释放具有时间依赖性。在CpG-S ODN刺激前4h内至刺激后1h内加入CpG-N ODN208,均能非常显着地抑制CpG-S ODN诱导的TNF-释放:在CpG-S ODN刺激后2h加入CpG-N ODN208,能显着抑制CpG-S ODN诱导的TNF-释放:在CpG-S ODN刺激后4h加入CpG-N ODN208,对CpG-S ODN无拮抗作用。CpG-N ODN208拮抗CpG-S ODN的时效关系呈钟型分布:最大拮抗效应的时相点为0h,即CpG-N ODN208与CpG-S ODN同时加入时拮抗作用最强;在-4 h～0 h以及0 h～4h两个时间段内,CpG-N ODN208和CpG-S ODN加入的时间越接近,其拮抗作用越强;在CpG-S ODN刺激前或刺激后相等的时相点加入CpG-N ODN208(如-1 h和1 h),前者的拮抗作用明显强与后者。CpG-N ODN溶血试验阴性,对hPBMC活力无明显影响。CpG-N ODN208:CpG-S ODN=3:1时,CpG-N ODN208对CpG-S ODN攻击小鼠虽无显着的保护作用,但小鼠死亡时间明显后移;CpG-N ODN208:CpG-S ODN=5:1时,CpG-N ODN208对CpG-S ODN攻击小鼠具有显着的保护作用,小鼠死亡率由90%(9/10)下降为60%(6/10),死亡时间明显后移。结论CpG-N ODN208对CpG-S ODN的拮抗作用可能与二者竞争TLR9有关。CpG-N ODN208无明显的细胞毒性作用。CpG-N ODN208对CpG-S ODN攻击小鼠具有显着的保护作用。
蒋为薇[3]2007年在《抑制性寡核苷酸（CpG-N ODN）拮抗刺激性寡核苷酸（CpG-S ODN）的作用及其机制研究》文中研究说明目的脓毒症(Sepsis)是由感染因素引起的全身炎症反应综合征(SIRS),病死率高。细菌基因组DNA(细菌DNA)是SIRS的主要启动因子之一。研究发现只有含有未甲基化CpG为核心的特定六核苷酸序列的CpG ODN才具有刺激性,它的特征结构通常是5' -嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-嘧啶-3'。这些特定的六核苷酸既是脊椎动物免疫细胞特异性识别细菌DNA (CpG DNA)的结构基础,也是细菌DNA具有广泛免疫刺激效应的结构基础,因此被称为刺激性CpG基序(stimulatory CpG motif;CpG-S ODN)。此外,研究尚发现部分CpG ODN对细胞的刺激活性较弱,并能对CpG-S ODN活化细胞有抑制作用,因此推断这些序列可能是中和性CpG基序(neutralizing CpG motif;CpG-N ODN)。本研究旨在进一步寻找有效的CpG-N ODN,并对其可能的机制进行探讨,为CpG-N ODN的可能临床应用提供实验依据。方法①hPBMC分别用生理盐水(NS)、CpG-S ODN和CpG-S ODN+CpG ODN(101-211)刺激后,观察CpG ODN(101-211)对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的作用,寻找有效的CpG-N ODN。②hPBMC分别用生理盐水(NS)、CpG-S ODN和CpG-S ODN+CpG-N ODN刺激后,观察CpG-N ODN对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的抑制作用,并明确其量效、时效关系;ELISA法检测培养上清TNF-α的含量;③采用流式细胞术观察CpG-N ODN对hPBMC细胞表面结合和内化CpG-S ODN的影响;④采用生物传感技术观察CpG-S ODN与CpG-N ODN是否具有直接结合作用;⑤采用RT-PCR技术观察CpG-N ODN预处理对hPBMC中TLR9 mRNA表达的影响;⑥采用电泳迁移率改变分析(EMSA)方法观察CpG-N ODN预处理对hPBMC中NF-κB活化的影响;⑦采用MTT法检测CpG-N ODN对细胞活性的影响。结果①从CpG ODN(101-211)找出对CpG-S ODN诱导hPBMC释放细胞因子具有抑制作用的CpG-N ODN ;②当CpG-N ODN与CpG-S ODN浓度比为1:1时,hPBMC释放细胞因子的作用受到抑制,提前和与CpG-S ODN同时给CpG-N ODN均可抑制hPBMC分泌细胞因子,且抑制效果相当,约为25%;延后给予则未见抑制效应;③10μg/ml CpG-N ODN预处理可明显抑制10μg/ml CpG-S ODN的hPBMC表面结合和内化;④CpG-S ODN与CpG-N ODN没有直接结合作用;⑤CpG-N ODN预处理能显着抑制hPBMC中TLR9 mRNA的表达;⑥CpG-N ODN预处理能显着抑制hPBMC中核转录因子NF-κB的活化。⑦CpG-N ODN对细胞活性没有影响。结论从前期合成的CpG ODN中筛选出了有效的CpG-N ODN,CpG-N ODN处理可明显抑制CpG-S ODN诱导的hPBMC分泌TNF-α,其作用机制可能与其抑制CpG-S ODN在细胞表面的结合以及内化、抑制TLR9 mRNA的表达、进而抑制NF-κB的活化、导致细胞释放TNF-α等细胞因子减少有关。
朱桂军[4]2006年在《二烯丙基叁硫对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠的防治作用及其机制研究》文中研究表明目的:急性肺损伤(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指心源性以外各种肺内外致病因素(严重感染、创伤、休克等)导致的急性、进行性、顽固性呼吸衰竭。失控性炎症反应引发多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的理论强调了ALI/ARDS的本质是全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和MODS的肺部表现。ALI和ARDS是性质相同但程度不同的连续病理生理过程,ALI是ARDS的早期阶段,严重的ALI被定义为ARDS。ALI/ARDS发病急,病情凶险,尽管机械通气等治疗方法的综合应用,但至今无特效的治疗方法,病死率仍高达40～60%。脓毒症(sepsis),特别是革兰氏阴性杆菌内毒素是导致ALI/ARDS最常见的原因。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是内毒素的主要成份,是动物ALI/ARDS模型最常用的致伤剂。因此,注射LPS不仅可成功复制ALI/ARDS动物模型,而且可以很好地模拟临床严重感染引发的ALI/ARDS。LPS主要通过激活多种炎性细胞或效应细胞(中性粒细胞、巨噬细胞等),诱生大量细胞因子和炎症介质(如TNF-α、IL-1β、IL-6、PAF等)的失控性释放,从而引起肺泡毛细血管内皮和肺泡上皮损伤,肺微血管通透性增高,肺水肿及透明膜形成。因此参与炎症反应的炎性细胞,炎性细胞释放的细胞因子、炎症介质及相应的信号转导在ALI/ARDS的发生、发展中起关键作用,是形成ALI/ARDS的病理生理学基础。二烯丙基叁硫(diallyl trisulfide,DATS)是大蒜提取物的主要成分。大蒜为百合科葱属植物生蒜(Allium satirum. L)的鳞茎,其中DATS和二烯丙基二硫化物(diallyl disulfide,DADS)在大蒜提取物中含量最高,是大蒜提取物的主要有效活性成分。现代医学证实:大蒜提取物具有广谱抗菌消炎作用,对于细菌及深部真菌感染均有一定的治疗效果。新近德国慕尼黑大学药物研究中心Keiss等报道,大蒜提取物可抑制LPS诱导的人全血细胞核
周猛[5]2012年在《MtDNA导致SIRS的机制及氯喹与PDTC对SIRS保护效应的初步探讨》文中进行了进一步梳理目的创伤导致机体出现全身炎症反应综合征，甚至发生多器官功能衰竭。全身炎症反应综合征的发病机制及防治至今仍未完全了解。现已知创伤后机体可产生大量的mtDNA，而mtDNA可激活P38蛋白激酶通路产生炎症因子，导致全身炎症综合征，但是mtDNA否能通过TLR-9激活NF-κB通路并产生炎症因子依然未知。本文采用体内试验，首先注射不同浓度MtDNA，检测外周血各种炎症因子的水平变化，观察肺脏炎性浸润情况，探讨mtDNA导致SIRS的机制；在此基础上以氯喹与PDTC为阻滞剂，初步了解氯喹与PDTC对于mtDNA导致SIRS的保护效应,为严重创伤救治中降低SIRS发生，防治多器官损伤及相关并发症提供新思路。方法第一部分将大鼠分为8组；①缓冲液组（n=2）②nDNA（10ug/ml）组（n=14）③mtDNA（15ug/ml）组（n=14）④线粒体碎片（终浓度含mtDNA1μg/ml，MTD1）组（n=14）⑤mtDNA（5ug/ml）组（n=14）⑥线粒体碎片（终浓度含mtDNA5μg/ml，MTD5）组（n=14）⑦mtDNA（15ug/ml）组（n=14）⑧线粒体碎片（终浓度含mtDNA15μg/ml，MTD15）组（n=14）。第二部分将大鼠分为4组：①mtDNA（15ug/ml）+氯喹（10mg/kg）组（n=14）②mtDNA（15ug/ml）+氯喹（30mg/kg）组（n=14）③mtDNA（15ug/ml）+PDTC（30mg/kg）组（n=14）④mtDNA（15ug/ml）+PDTC（120mg/kg）组（n=14）。两部分分别在1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时和48小时，利用多通道生理检测仪检查大鼠生命体征变化；用酶联免疫吸附试验法（ELISA）观测外周血中TNF-α、IL-10、IL-6、的表达水平；用实时定量PCR(Real-time PCR)检测肺组织中NF-κB亚单位p65mRNA、I-κBmRNA、TLR9mRNA的表达；荧光定量PCR检测外周血中mtDNA的水平；HE染色观察肝、肺、肾、肠的病理学变化。实验资料采用均数±标准误(x±s)表示。所有数据运用SPSS17.0统计软件采用单因素方差分析(one way ANoVA)及回归与相关分析， P<0.05为差异有显着性。结果1.各组之间的大鼠血压与呼吸没有明显变化，各实验组在不同时间点体温明显变化，但各组之间的体温变化没有统计学意义。2.注射缓冲液大鼠和nDNA的大鼠在各个时间点外周血炎症因子水平未见明显变化；线粒体碎片和mtDNA组在1小时炎症因子水平开始升高，8小时到达高峰，随着注射线粒体碎片和mtDNA浓度升高，炎症水平越高，且含相应mtDNA浓度的线粒体碎片比这种浓度的mtDNA炎症因子水平高。3. p65mRNA、I-κBmRNA在肺组织中的表达水平和炎症因子、TLR9的表达水平升高有线性相关性。4. p65mRNA、I-κBmRNA在肺组织中的表达水平呈现负相关。5.氯喹与PDTC浓度越高，炎症因子表达水平越低，阻滞效果越好，但是氯喹与PDTC的阻滞效果未见明显差异。结论mtDNA能通过刺激TLR9引起的NF-κB通路导致机体出现全身炎症反应综合征。氯喹和PDTC均能对mtDNA引起的SIRS起保护作用。
路延之[6]2014年在《人补体受体1型衍生分子融合蛋白CR1-SCR2D的构建及对小鼠脓毒症炎症损伤的保护作用》文中提出脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatoryresponse syndrome, SIRS)，是住院危重患者的主要死亡原因之一。脓毒症的发病机制比较复杂，涉及到各个系统的共同作用。其始动环节之一，是补体系统识别病原微生物发生过度活化。病原菌的菌体成分、内毒素、外毒素等使得补体系统过度激活，产生大量的炎症效应片段，造成后续级联放大的炎症反应。目前抑制补体的过度活化已成为防治脓毒症炎症损伤的重要策略之一。在经典、旁路、凝集素叁条通路中，补体激活的起始位点不同，但都形成C3转化酶，在C3处汇合，进而形成C5转化酶，共同进入终末途径。如果能在C3处防止C3/C5转化酶的形成，可减少炎症效应片段如C3a、C5a、C5b-9等的释放，在一定程度上就能够防止或减轻SIRS的发生与发展。我室曾研制了人补体受体1型(complement receptor type1，CR1)的两个活性片段短同源重复序列(short consensus repeats，SCR)1-3和SCR15-17，分别用毕赤酵母进行表达，证明其具有体外抑制补体的生物活性作用和体内抗炎保护作用。这两个片段分别结合C4b和C3b，只能抑制一条或两条补体激活通路，保护作用有限。因此，本研究构建了能结合C4b、C3b的双功能域CR1衍生分子(complement receptor type1-shortconsensus repeats of two domains, CR1-SCR2D)，检测融合蛋白在体外抑制补体的生物活性，并进行了小鼠脓毒症损伤的保护性研究。本研究主要获得了以下实验结果：1．表达质粒pPICZαB-SCR2D的构建。将毕赤酵母质粒pPIC9k原有的多克隆位点替换为新的多克隆位点pPIC9k(+)；用我室前期构建的pPIC9k-SCR1-3和pPIC9k-SCR15-17作模板，PCR扩增基因SCR1-3和SCR15-17，依次克隆连接到pPIC9k(+)上，在二者中间加入linker序列，构建含有目的基因的重组质粒pPIC9k(+)-SCR2D；最后将目的基因SCR2D克隆到载体pPICZαB上，得到表达载体pPICZαB-SCR2D。双酶切和测序鉴定表明，表达质粒pPICZαB-SCR2D构建成功。2．表达质粒pPICZαB-SCR2D电转化毕赤酵母后进行表达及鉴定。表达质粒pPICZαB-SCR2D经过Sac I单酶切后电转毕赤酵母X-33感受态，从博来霉素(Zeocin)的YPD平板上挑取单克隆，行PCR鉴定阳性重组子。确立目的蛋白在重组酵母X-33/CR1-SCR2D中有分泌表达。采用小鼠抗人CR1抗体经Western blot鉴定，在分子量约90kDa处出现阳性条带。3．目的蛋白CR1-SCR2D经Ni-NTA柱纯化及糖基化鉴定。表达上清过Ni-NTA柱后，低浓度咪唑洗脱杂蛋白，高浓度咪唑洗脱目的蛋白。SDS-PAGE电泳显示，在分子量约90kDa处有弥散条带，目的蛋白纯度较高。目的蛋白经29kDa的Endo H糖苷酶处理后，分子量达到理论大小的45kDa，带型也变规则，证明CR1-SCR2D存在糖基化。4．目的蛋白CR1-SCR2D的体外抑制补体生物活性鉴定。用CH50和AH50对目的蛋白CR1-SCR2D进行经典途径和旁路途径抑制补体活性检测，结果显示CR1-SCR2D均可抑制两条通路的激活，并且抑制补体活性分别高于SCR1-3和SCR15-17。去糖基化后的CR1-SCR2D对CH50和AH50溶血活性没有影响。另外证明CR1-SCR2D对旁路和MBL途径激活片段C4b、C3b在酵母多糖上沉积有抑制作用。5．目的蛋白CR1-SCR2D对脓毒症小鼠炎症损伤的保护性效应。用盲肠结扎穿刺术(CLP)成功构建小鼠的脓毒症模型。进行分组实验，结果表明CR1-SCR2D在一定程度上能保护小鼠96h的生存率。CR1-SCR2D可以降低脓毒症小鼠24h后血清C5a、IL-6和TNF-α的水平，降低脓毒症小鼠肺脏的MPO水平，降低脓毒症小鼠血液的细菌水平。免疫组化结果表明，CR1-SCR2D使脓毒症小鼠C4b、C3b在肺脏上的沉积减少。小鼠肺脏病理学检查结果显示，CR1-SCR2D明显减轻了肺泡间隔和肺泡腔内出血、水肿、炎细胞浸润、局部实变的病理损伤。综上所述，本实验成功构建毕赤酵母表达质粒pPICZαB-SCR2D，实现了目的蛋白CR1-SCR2D在毕赤酵母中的分泌表达，经过纯化获得了目的蛋白。体外生物活性结果证明，目的蛋白CR1-SCR2D可以抑制补体叁条通路的激活。在小鼠体内，补体在脓毒症炎症损伤中起了重要作用，CR1-SCR2D通过抑制补体的过度激活达到了对脓毒症小鼠炎症损伤的保护效应。研究结果为脓毒症治疗的深入研究提供了新的思路和途径。
肖雪飞[7]2012年在《姜黄素对脓毒症急性肺损伤大鼠的保护作用及分子机制研究》文中研究说明脓毒症是机体由感染所引发的全身炎症反应综合征,是各种严重创伤、烧伤、缺氧、再灌注损伤及外科大手术后常见的并发症,是重症监护室患者的首位死亡原因。肺脏是脓毒症时最易受损伤的靶器官,脓毒症时急性肺损伤出现最早,发生率最高。脓毒症时,由于内毒素等刺激炎症细胞产生大量的炎性介质及脂质代谢产物,促使炎性反应细胞尤其是中性粒细胞和巨噬细胞在肺组织中募集和活化,进一步产生细胞因子、趋化因子、氧自由基及蛋白酶等,扩大炎性反应,形成瀑布样级联反应,导致肺泡上皮细胞及血管内皮细胞受损、通透性增加,影响细胞间隙、水钠转运及表面活性物质的产生,大量富含蛋白及细胞成分的液体以较快速度进入肺组织,形成渗透性肺水肿,导致透明膜形成和肺泡塌陷,并伴有肺间质纤维化。姜黄素(Curcumin,Cur)是姜黄类植物中提取的一种多酚,具有广泛的药理作用,传统医学中应用于恶性肿瘤、糖尿病、风湿病等。近年的研究揭示其具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗纤维化以及防癌抗癌等作用,可能与其抑制NF-κB和激活剂蛋白-1(AP-1)等转录因子的激活及表达有关,而且无明显的毒副作用。研究表明姜黄素在炎症性疾病的治疗上有广阔的应用前景。但目前,姜黄素抗炎的生化基础及路径仍未阐明,能否作为脓毒症急性肺损伤的治疗用药也须作进一步评价。本研究拟利用大鼠盲肠结扎穿刺(CLP)致脓毒症急性肺损伤(ALI)的动物模型,从整体动物和分子水平观察姜黄素治疗脓毒症急性肺损伤后肺换气功能的改变、肺通透性变化、髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平、病理学指标以及细胞因子如TNF-α、IL-10、IL-6及ICAM-1、MIP2的变化,并结合NF-κB及MAPK叁条信号转导通路(ERK、JNK和p38MAPK)的变化等,旨在阐明姜黄素治疗脓毒症急性肺损伤的机制,为脓毒症急性肺损伤的预防和临床救治提供一种新的研究思路。目的：观察姜黄素对脓毒症急性肺损伤大鼠的保护作用。方法：采用盲肠结扎穿刺致脓毒症急性肺损伤大鼠模型。SD大鼠随机分为5组：假手术组；模型对照组；溶媒干预组；低(50mg/kg)、高剂量(200mg/kg)姜黄素干预组。术后不同时间点(6h、12h、24h)处死大鼠8只收集血液及肺组织标本。测定实验各组多项动脉血气指标、肺水含量(肺湿干重比)、支气管肺泡灌洗液中蛋白含量及细胞(总数,中性粒细胞和淋巴细胞)计数、光镜观察肺组织病理形态变化、测定肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平及髓过氧化物酶(MPO)活性及细胞因子如’TNF-α、IL-1β、IL-6水平,并比较观察实验各组72小时生存率。结果：1.与假手术对照组比较,模型组各项指标均出现有统计学意义的显着改变：表明本研究制备的脓毒症致ALI模型成功可靠。与假手术对照组比较,(1)模型组大鼠肺部气体交换功能降低,表现为PaO2/FiO2和Pa O2均显着降低(P<0.05或P<0.01)；(2)模型组大鼠肺泡上皮细通透性及微血管通透性增加,表现为肺水含量(肺湿干重比)、BALF中的蛋白含量及细胞(总数,中性粒细胞和淋巴细胞)计数明显增高(P<0.05或P<0.01)；(3)模型组大鼠发生明显炎症反应,表现为肺组织病理评分明显增高,BALF细胞因子TNF-α、IL-1β、 IL-6水平明显增高(P<0.05或P<0.01)；(4)模型组大鼠肺部中性粒细胞浸润、氧自由基增多及抗氧化能力减弱,表现为模型组MPO活力水平及MDA水平明显增高,而SOD水平下降(P<0.05或P<0.01)。2.与模型组比较,不同剂量姜黄素干预组多项反应肺组织损伤的指标均得到显着改善,高剂量组效果基本上都优于低剂量组。与模型组比较：(1)姜黄素干预能改善大鼠肺部气体交换功能,不同剂量姜黄素干预组大鼠PaO2/FiO2和Pa02均有显着改善(P<0.05或P<0.01),提高了肺组织的氧合状况。(2)姜黄素干预能抑制大鼠肺泡上皮细胞通透性及微血管通透性的恶性增加,不同剂量的姜黄素均能够显着降低CLP诱导ALI大鼠肺水含量(肺湿干重比)、BALF中的蛋白含量、细胞(总数,中性粒细胞和淋巴细胞)计数上调的指标(P<0.05或P<0.01)。(3)姜黄素干预能抑制大鼠炎症反应,不同剂量姜黄素干预组肺组织病理评分显着降低,不同剂量姜黄素干预组能够不同程度抑制CLP致ALI的BALF细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平(P<0.01),抑制肺部炎症反应。(4)姜黄素干预能抑制肺部中性粒细胞浸润及氧化应激反应,不同剂量姜黄素干预组MPO活力水平及MDA水平均显着的降低,SOD活性水平却显着上升(P<0.05或P<0.01)。3.假手术对照组、模型组及姜黄素干预组72h生存率观察发现姜黄素干预组能有效提高CLP大鼠72h生存率：其中50mg/kg剂量组72h生存率为80%,较CLP组提高了40%；200mg/kg剂量组72h生存率为90%,较CLP组提高了50%；而溶媒干预组72h生存率为40%,与CLP组相同。结论：姜黄素通过减轻脓毒症ALI大鼠肺部微血管内皮细胞损伤,改善肺部气体交换功能,抑制ALI大鼠肺部炎症反应和通透性增高等对脓毒症ALI大鼠发挥保护作用；最终显着提高大鼠的生存率。目的：通过观察姜黄素对脓毒症急性肺损伤大鼠中IKK/NF-κB信号通路的影响,探讨其对脓毒症急性肺损伤保护作用的分子机制。方法：SD大鼠随机分为3组(每组10只)：假手术组；模型对照组；姜黄素干预组(200mg/kg)。CLP术后12h后,收集血液及肺组织标本。ELISA法检测血清中TNF-α、ICAM-1及MIP-2水平；RT-PCR检测肺组织TNF-α、ICAM-1及MIP-2mRNA的表达；EMSA法检测肺组织NF-κB DNA结合活性；Werstern blotting测定肺组织细胞核内NF-κB p65和肺组织中p-IKKser180/pser181和IκBα蛋白的表达。结果：1.与假手术对照组比较,模型组血清TNF-α、ICAM-1及MIP-2水平和肺组织TNF-α、ICAM-1及MIP-2mRNA的表达均明显增加(P<0.05或P<0.01)；与假手术对照组比较,模型组肺组织NF-κB DNA结合活性和肺组织细胞核内NF-κB p65蛋白及肺组织p-IKKser180/pser181蛋白水平明显增加(P<0.05或P<0.01),肺组织IKBa含量明显降低(P<0.05或P<0.01)。2.与模型组比较,姜黄素干预组血清TNF-α、ICAM-1及MIP-2水平和肺组织TNF-α、ICAM-1及MIP-2mRNA的表达均明显降低(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较,姜黄素干预组肺组织NF-κB DNA结合活性和肺组织细胞核内NF-κB p65蛋白及肺组织p-IKKser180/βser181蛋白水平明显降低(P<0.05或P<0.01),肺组织IκBα含量明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论：姜黄素对脓毒症ALI大鼠的保护作用可能与其抑制IKK/NF-κB信号通路减少相关炎性基因和蛋白表达有关。目的：通过观察姜黄素对脓毒症急性肺损伤大鼠中MAPK(ERK、 JNK和p38MAPK)信号通路的影响,探讨其对脓毒症急性肺损伤保护作用的分子机制。方法：SD大鼠随机分为4组(每组6只)：假手术组；模型对照组；姜黄素干预组(200mg/kg)。CLP术后12h后,收集血液及肺组织标本。免疫组织化学染色和Werstern blotting检测pERK、pJNK及pp38MAPK蛋白表达；RT-PCR检测肺组织TNF-α mRNA的表达；ELISA检测血清中TNF-α水平。结果：1.与假手术对照组比较,模型组肺组织pERK、pJNK及pp38MAPK和TNF-α mRNA的表达水平及血清中TNF-α水平均明显增加(P<0.05或P<0.01)。2.与模型组比较,姜黄素干预组肺组织pERK、pJNK及pp38MAPK和TNF-α mRNA的表达水平及血清中TNF-α水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论：姜黄素对脓毒症ALI大鼠的保护作用可能与其抑制MAPK叁条信号通路(ERK、JNK和p38MAPK)的活化,减少相关炎性基因和蛋白表达有关。
刘宿[8]2007年在《创伤、内毒素诱导炎症反应对凝血启动功能的影响及抗凝活性的调控》文中提出目的:在严重创伤、感染所致全身炎症反应综合征或脓毒症时,常不可避免地出现凝血、抗凝和纤溶功能异常,而弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)是其最严重的临床表现,是严重创伤患者死亡的重要原因之一。由于创伤、感染时病情的复杂性,在DIC早期(非显性DIC阶段)其临床症状易被忽视,而此阶段的治疗对提高病人的存活率至关重要。目前临床上对非显性DIC的认识并不是很充分;对创伤、感染过程中各种炎性产物与凝血过程间复杂的相互关系的了解还不够深入;治疗上用药的盲目性较大,尤其是止血药的应用过于普遍。为此,本研究采用撞击伤并注入内毒素的方法,形成临床上常见的致伤因素,建立实验性非显性DIC动物模型对上述问题进行探讨。主要方法与结果如下:第一部分:创伤合并内毒素诱导兔非显性DIC模型的建立采用BIM-Ⅱ型水平式生物撞击机撞击兔胸部,并静脉注入内毒素,形成创伤、内毒素及创伤合并内毒素等单一或复合的致伤因素。选择800kpa驱动压、30%压缩量和1.77cm2撞击面积作为撞击致伤参数,LPS静脉注射作为感染致伤因素。实验分为四组:创伤组(T组)、内毒素组(L组)、创伤合并内毒素组(T+L组)、对照组。各组观察凝血指标(凝血酶原时间PT、活化部分凝血活酶时间aPTT、凝血酶时间TT、纤维蛋白原Fib)、血栓弹性描记图指标(反应时间R、凝块形成时间K、最大振幅MA、凝血形成速率α角)、D-二聚体含量、抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)活性等生化指标及重要脏器组织病理学的变化。并根据上述变化对创伤、感染后机体的凝血功能进行评分。1、两种致伤因素分别单独致伤时,实验动物在致伤早期(1h)PT、aPTT缩短、纤维蛋白原升高、AT-Ⅲ活性明显降低;TEG示R值、K值缩短,MA值增大。2、两种致伤因素共同致伤的动物模型中,早期机体AT-Ⅲ活性明显降低,凝血指标显示仍呈高凝状态,其肺、肾、肝的损伤程度均比单纯创伤或内毒素感染严重,重要脏器中有多量的微血栓形成。DIC评分<5分。第二部分:创伤合并感染时炎症反应与凝血异常的关系致伤条件及分组同第一部分。采用酶联免疫法测定白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)含量的变化;采用发色底物法测定组织因子(TF)、组织因子途径抑制物(TFPI)活性的变化;采用原位杂交法对各组动物24h肺和肾组织的TF、TFPI mRNA阳性表达进行测定。1、在创伤感染所致的非显性DIC动物模型中,血清IL-1β、IL-6明显增高,血浆TF活性增加,IL-1β和IL-6与TF的活性变化呈正相关。2、致伤动物血清IL-10含量明显增加,24h仍维持较高水平。3、在损伤较严重的创伤合并感染组,TF/TFPI比值明显增加,而损伤程度轻、存活率高的单纯创伤组其比值在早期是降低的。4、原位杂交法测定TF mRNA和TFPI mRNA在肺组织中表达增高;肾组织中仅TF mRNA表达增高,TFPI mRNA表达降低。第叁部分:低分子量肝素对创伤感染后非显性DIC兔的保护作用各组实验动物致伤的方法与第一部分实验T+L组相同。致伤后分为四组:创伤合并内毒素未治疗组、低分子量肝素治疗组(LMWH组)、氨甲环酸治疗组(TA组)、合并用药组(L+TA组)。采用酶联免疫法测定白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)含量的变化;采用发色底物法测定组织因子(TF)、组织因子途径抑制物(TFPI)活性的变化;采用原位杂交法对各组动物24h肺和肾组织的TF、TFPI mRNA阳性表达进行测定;采用Real time PCR对血单核细胞TFPI mRNA的相对表达量进行测定。1、LMWH组IL-1β、IL-6的含量降低。2、LMWH组TF在血浆中的活性和在肺、肾组织中的表达降低;用实时荧光定量测定血单核细胞中TFPI mRNA的表达,发现LMWH可使单核细胞早期(伤后1h)TFPI mRNA的表达明显增高,检测其在血浆中的活性亦增加,TF/TFPI比值降低,LMWH治疗组脏器中微血栓的形成减少。3、TA组发现血栓形成的机率增加。但在已使用抗凝剂的基础上,再应用TA,并没有造成肺动脉血栓发生率增加和重要脏器微血栓形成的增多。结论:本课题采用撞击及内毒素注入的方法成功模拟了非显性DIC动物模型;促炎介质参与了创伤感染后凝血异常的发生,促进TF的释放,并激活外源性凝血途径。IL-1β、IL-6与TF的活性变化呈正相关;严重创伤合并感染组的TF/TFPI比值升高,表明其值与损伤程度相关,而DIC的存活率与TFPI升高导致的比值降低有关;TFPI mRNA在不同器官中的表达不一致,与脏器损伤程度相关;低分子量肝素除了抗凝之外,还可抑制炎症反应,降低TF的释放,减轻凝血反应;在已用LMWH基础上用氨甲环酸,不会造成血栓形成,而单用氨甲环酸则相反。实验研究结果可为临床诊断和治疗创伤、感染诱发的非显性DIC提供理论和实验依据。
李军[9]2007年在《类固醇受体辅活化子-3在炎症/免疫反应中的作用》文中研究说明研究证实,严重创伤或感染后发生明显的GCR(GR表达或功能下调)、炎症介质(NF-κB、AP-1)功能增强和炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)大量分泌,叁者相互影响,互为因果,形成级联式放大效应,引发SIRS。SIRS是创伤或感染后天然免疫反应过度激活所致,是导致继发性全身性损害的主要原因。伴随SIRS的发生发展,由于内源性抗炎症介质的过量释放,可引起机体发生以细胞免疫为主的免疫功能抑制。因此,深入探讨SIRS发生发展及随后免疫抑制的分子机制,具有重要的临床意义。SRC家族作为核受体和其它转录因子的转录辅活化子,由SRC-1、SRC-2和SRC-3组成,以配体依赖模式与核受体相互作用,通过组蛋白乙酰化/甲基化和募集另外的辅因子,显着增强核受体依赖的转录。尽管目前关于SRC蛋白在调节机体生长发育、能量代谢以及部分肿瘤形成等方面的研究已积累了很多资料,但关于它在炎症/免疫反应中的作用,目前知之甚少。我们通过海外合作的方式从美国休斯顿贝勒医学院成功引进SRC-3基因敲除小鼠的亲代小鼠,并进行了繁殖。在成功繁殖并鉴定的基础上,我们分两个部分探讨了SRC-3在炎症和免疫反应中的作用。首先分别从体内、体外两方面探讨了SRC-3在SIRS发生发展中的作用:1)以5mg/kg体重LPS腹腔注射为炎症反应动物模型,观察SRC-3基因敲除对炎症反应早期炎性细胞因子分泌及肝、脾组织中GR、NF-κB、AP-1表达及核转位的影响;2)在腹腔巨噬细胞原代培养的基础上,在10μg/ml培养体系LPS诱导下,从炎性细胞因子的基因转录、炎症介质的活性等方面观察了SRC-3蛋白缺失对腹腔巨噬细胞激活的影响。其次通过细菌负荷实验观察了SRC-3在天然免疫反应中的作用,并在此基础上,进一步通过烧伤和LPS诱导炎症反应模型,探讨SRC-3与机体免疫功能抑制的关系。主要结果:1、在成功繁殖逐渐扩大种群的基础上,通过PCR和Western blot方法分别对子代小鼠进行基因表型和蛋白表型鉴定,成功获得一批SRC-3基因敲除小鼠,为下步实验打下了良好的基础;2、SRC-3~(+/+)小鼠肝、脾组织均表达SRC-3蛋白,且脾组织表达水平显着高于肝组织,超出约55.8%;3、5mg/kg LPS腹腔注射后,SRC-3~(-/-)组小鼠一般情况较SRC-3~(+/+)组小鼠轻,两组肝、脾、肾、心肌及胸腺病理变化未见明显差别;4、LPS腹腔注射后1h、4h两组血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的水平均显着升高,但SRC-3~(+/+)组、SRC-3~(-/-)组小鼠相比,血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平SRC-3~(-/-)组显着低于SRC-3~(+/+)组,IL-10水平SRC-3~(-/-)组却显着高于SRC-3~(+/+)组;5、正常情况下,SRC-3~(+/+)组腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 mRNA与SRC-3~(-/-)组相比,表达差异无统计学意义;体外LPS刺激后两组表达水平均显着升高,其中SRC-3~(-/-)组TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA显着低于SRC-3~(+/+)组,IL-10 mRNA显着高于SRC-3~(+/+)组;6、在肝组织,无论是SRC-3~(+/+)组小鼠还是SRC-3~(-/-)组LPS刺激引起GR蛋白表达及核转位均显着降低,但SRC-3~(-/-)组下降幅度显着低于SRC-3~(+/+)组;同样,LPS刺激后SRC-3~(-/-)组脾组织GR表达水平下降幅度显着低于SRC-3~(+/+)组,SRC-3~(+/+)组小鼠GR核转位明显降低,而SRC-3~(-/-)组无显着变化;7、LPS刺激早期两组小鼠肝、脾组织IκB-α蛋白水平显著降低,以1h降低最明显,其中SRC-3~(-/-)组小鼠下降幅度显着低于SRC-3~(+/+)组;两组小鼠肝、脾组织NF-κB p65/p50蛋白表达水平及核转位程度显着增加,SRC-3~(+/+)组、SRC-3~(-/-)组相比,SRC-3~(-/-)组小鼠NF-κB p65/p50蛋白表达上升幅度显着大于SRC-3~(+/+)组,而核转位程度显着低于SRC-3~(+/+)组;无论是SRC-3~(+/+)组还是SRC-3~(-/-)组小鼠,LPS刺激引起肝、脾组织IRF-1蛋白表达水平显着增加,并且在相应时相点SRC-3~(-/-)组小鼠均显着低于SRC-3~(+/+)组;8、SRC-3~(+/+)组、SRC-3~(-/-)组小鼠肝、脾组织在LPS刺激后c-Jun/c-Fos蛋白表达及核转位程度均显着增加,1h为峰值,在相应时相点SRC-3~(-/-)组小鼠均显着低于SRC-3~(+/+)组;9、LPS刺激后SRC-3~(+/+)组、SRC-3~(-/-)组小鼠肝组织SRC-1蛋白表达均显着降低,SRC-3~(-/-)组小鼠变化程度显着小于SRC-3~(+/+)组;肝组织SRC-1蛋白核内水平在SRC-3~(+/+)组小鼠明显降低,而SRC-3~(-/-)组小鼠却显着增加;两组脾组织均未明确检测到SRC-1蛋白表达;10、LPS刺激后SRC-3~(-/-)组小鼠SRC-2蛋白表达及核内水平在相应时相点均显着高于SRC-3~(+/+)组,其中在肝组织,SRC-3~(+/+)组、SRC-3~(-/-)组小鼠均显着增加,而在脾组织,SRC-3~(+/+)组降低,SRC-3~(-/-)组升高;11、正常情况下,SRC-3~(+/+)组腹腔巨噬细胞GR蛋白表达水平与SRC-3~(-/-)组相比无显着差异,LPS刺激4h后两组均显着降低,但SRC-3~(-/-)组降低程度显着低于SRC-3~(+/+)组;12、正常情况下,SRC-3~(+/+)组腹腔巨噬细胞NF-κB p65显着高于SRC-3~(-/-)组,LPS刺激4h后两组表达水平均显着升高,但SRC-3~(-/-)组升高幅度远远高于SRC-3~(+/+)组;13、正常情况下,SRC-3~(+/+)组腹腔巨噬细胞c-Jun/c-Fos蛋白表达水平与SRC-3~(-/-)组相比无显着性差异,LPS刺激4h后两组表达水平均显着升高,但SRC-3~(-/-)组升高幅度远远低于SRC-3~(+/+)组;14、通过细菌清除实验发现,SRC-3~(-/-)小鼠血液中活菌量显着多于SRC-3~(+/+)小鼠;注射后24h、48h SRC-3~(-/-)小鼠肝、脾及胸腺组织内细菌含量显着多于SRC-3~(+/+)小鼠,而肾组织中细菌含量均较少,两者相差不显着;15、正常情况下,两组小鼠血浆IL-2、sIL-2R水平没有显着差别;15%-20%Ⅲ°烧伤后24h,无论是SRC-3~(+/+)组还是SRC-3~(-/-)组,血浆IL-2、sIL-2R水平均显着升高,其中SRC-3~(-/-)组小鼠血浆IL-2显着低于SRC-3~(+/+)组,血浆sIL-2R含量升高幅度却显着大于SRC-3~(+/+)组;5mg/kg体重LPS刺激24h后,无论是SRC-3~(-/-)组小鼠还是SRC-3~(+/+)组,血浆IL-2水平均未见显着变化,而血浆sIL-2R含量却均显着升高,且SRC-3~(-/-)组小鼠升高幅度显着高于SRC-3~(+/+)组;16、正常情况下,SRC-3~(-/-)组小鼠外周血、脾脏和胸腺CD3~+、CD4~+及CD4~+/CD8~+比值不同程度降低,CD8~+升高;烧伤或LPS刺激后24h两组小鼠外周血和脾脏CD3~+、CD4~+及CD4~+/CD8~+比值均不同程度下降,且SRC-3~(-/-)组CD3~+、CD4~+显着低于SRC-3~(+/+)组,CD4~+/CD8~+比值与SRC-3~(+/+)组相比无显着差别。结论:1、SRC-3与炎性细胞因子的合成释放有关,其蛋白缺失可抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6的基因转录及释放,改善炎症反应中机体的整体效应,缓解腹腔巨噬细胞的激活程度;2、SRC-3对GR蛋白表达及核转位有抑制作用,LPS刺激后GR蛋白表达及核转位显着降低,产生明显的GCR,SRC-3蛋白缺失可缓解其程度;3、SRC-3对NF-κB炎症信号转导通路有正性调控作用。SRC-3蛋白缺失可通过抑制炎症反应早期IκB-α水平下调,减少NF-κB核转位,从而导致其基因转录调控功能下降;4、SRC-3参与AP-1炎症信号转导通路的激活,SRC-3蛋白缺失可抑制LPS诱导的AP-1蛋白表达水平及活性,这可能是由于TNF-α、IL-1β等致炎细胞因子合成释放相对不足所致;5、SRC家族成员间存在相互补偿,SRC-1、SRC-2对SRC-3蛋白缺失具有不同程度的补偿效应,但这种补偿效应是有限的;6、SRC-3在维持机体正常的免疫反应中起重要作用。SRC-3缺失可抑制炎性细胞因子的转录和释放,引起对细菌及产物的吞噬及清除功能下降,导致天然免疫功能减弱,同时引起CD3~+、CD4~+及CD4~+/CD8~+比值显着下降,使细胞免疫功能低下;7、SRC-3可能通过“双向性”作用精细地调节着细胞免疫,其缺失一方面可促进IL-10表达,导致机体免疫功能抑制加重,另一方面可减轻CD3~+、CD4~+及CD4~+/CD8~+比值的下降程度,也表明SRC-3可能部分参与了SIRS后免疫抑制的发生发展。
尹朝奇[10]2007年在《HSR对烧伤血清诱导的巨噬细胞TNF-α、HMGB1和IL-10基因表达调控及其分子机制》文中研究表明第一章烧伤血清诱导的巨噬细胞系RAW264.7释放TNF-α、HMGB1及lL-10的规律及意义目的：从细胞水平探讨烧伤血清处理的RAW264.7细胞释放炎症介质TNF-α、HMGBl、IL-10的规律及意义。方法：制备严重烧伤大鼠模型获取烧伤大鼠血清；采用小鼠RAW264.7巨噬细胞，分别以烧伤大鼠血清处理制备细胞模型；细胞随机分为两组：(1)正常血清处理组(2)烧伤血清处理组。两组的剂量效应分别用含有体积分数0％、5％、10％、20％的正常血清及烧伤血清的培养基与RAW264.7细胞系共培养24h，分别收取烧伤血清刺激组及对照组细胞培养上清，3500g离心后留取上清于-20℃保存备用。两组的时间效应分别以含有体积分数20％的正常血清及烧伤血清培养基分别培养RAW264.7细胞0h，4h，12h，24h，同上留取离心后的培养液上清。以上每组均设3个复孔，用双抗体夹心ELISA法测定RAW264.7培养上清中TNF-α和IL-10含量，Western blot分析RAW264.7细胞HMGBl的含量。结果：实验发现，正常培养的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞经不同体积分数的正常血清处理24h后TNF-α分泌量极低，而经不同体积分数的烧伤血清分别处理24h后RAW264.7细胞能分泌大量的TNF-α，(0.06±0.02ng／ml)，(0.14±0.03ng／ml)，(0.16±0.04 ng／ml)，(0.21±0.02ng／ml)(P＜0.05)；Western blot检测发现，发现①正常RAW264.7巨噬细胞中有少量HMGBl表达；②应用正常SD大鼠血清干预RAW264.7细胞，发现HMGBl的表达量与正常RAW264.7巨噬细胞HMGBl表达量无显着差异，无统计学意义(P＞0.05)；③应用烧伤血清干预的RAW264.7巨噬细胞，其HMGBl的表达量至18小时达到高峰，至24小时仍维持高水平表达。烧伤血清诱导RAW264.7的IL-10分泌量与烧伤血清浓度无显着的剂量依赖性关系，经ELISA法测定，无烧伤血清对照组RAW264.7细胞IL-10分泌量极低，烧伤血清组在培养24h后RAW264.7分泌IL-10量逐渐升高。结论：烧伤血清能以时间和剂量依赖方式诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的TNF-α的分泌增加，以时间依赖方式诱导HMGBl和IL-10的分泌增加。第二章热休克反应对烧伤大鼠的保护作用及对烧伤血清诱导的巨噬细胞TNF—a，IL—10及HMGBl的影响目的：探讨HSR对烧伤大鼠的保护作用及对烧伤血清诱导的TNF-α、IL-10和HMGBl的影响。方法：制备烧伤大鼠模型，观察72h内死亡率；伤后6h取各组动物血清观测各项血清学指标，一部分大鼠于HSR(42℃，15min，室温下恢复24h)后再进行烧伤，24h后摘取肝、肺组织行病理切片检查。将传代RAW264.7细胞随机分为叁组：(1)正常血清处理组。(2)烧伤血清处理组。(3)热休克预处理后烧伤血清处理组：热休克(HSR)处理：将细胞置于42℃的水浴箱中热休克1h，然后在37℃恢复12h，然后加入烧伤血清处理。叁组的剂量效应分别用含有体积分数0％、5％、10％、20％的正常血清及烧伤血清的培养基与小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7共培养24h，分别收取烧伤血清刺激组及对照组细胞培养上清，3500g离心后留取上清备用。叁组的时间效应分别以含有体积分数20％的正常血清及烧伤血清的培养基分别培养RAW264.7细胞0h，4h，12h，24h，同上留取离心后的培养液上清，以上每组均设3个复孔。用双抗体夹心ELISA法测定RAW264.7培养上清中TNF-α和IL-10含量，Western blot分析HMGBl的含量，RT-PCR检测TNF-αmRNA的表达、IL-10mRNA的表达。结果：大鼠严重烧伤后72h存活率为40％，较对照组明显下降(P＜0.05)；HSR组大鼠烧伤后存活率为60％，较单纯烧伤组明显上升(P＜0.05)；大鼠严重烧伤后6h血清中细胞因子TNF-α水平较伤前明显升高，IL-10水平稍增高，HSR后与烧伤组比较，IL-10水平升高，TNF-α水平下降，显示HSR明显抑制大鼠严重烧伤后血清中TNF-α水平，并上调IL-10水平。细胞在经热休克预处理后能抑制烧伤血清诱导的HMGBl释放，热休克预处理后(热休克后恢复1h)再给予烧伤血清刺激，TNF-αmRNA水平表达逐渐降低，细胞经热休克预处理后上调IL-10mRNA的表达。结论：HSR抑制烧伤血清诱导的RAW264.7细胞HMGBl释放和TNF-αmRNA的表达；HSR上调烧伤血清诱导的RAW264.7细胞IL-10mRNA的表达。第叁章HSFI过表达对RAW264.7巨噬细胞TNF-a，IL-10及HMGBl基因表达的影响目的：探讨热休克因子1(heat shock factorl，HSFl)过表达对烧伤血清处理的巨噬细胞炎症介质TNF-α、高迁移率族蛋白-1(HMGBl)、IL-10基因表达的影响。方法：制备严重烧伤大鼠模型，获取烧伤大鼠血清；构建HSFl基因的真核表达载体，继而将HSF1真核表达载体转染RAW264.7巨噬细胞，建立稳定转染HSFl的巨噬细胞株，最后将转基因细胞经烧伤血清处理，探讨HSFl过表达对烧伤血清处理的RAW264.7巨噬细胞TNF-a，HMGBl和IL-10基因表达的影响。结果：建立了稳定表达HSFl的RAW264.7细胞株，在该细胞株中有HSFl的部分活化；RT-PCR检测发现，正常血清处理的RAW264.7巨噬细胞中没有发现TNF-αmRNA和HMGBl mRNA的表达，而烧伤血清刺激能明显诱导TNF-αmRNA和HMGBl mRNA表达；与转空载体相比，HSFl过表达可明显抑制烧伤血清处理的RAW264.7巨噬细胞中TNF-αmRNA和HMGBl mRNA的表达；正常情况下IL-10 mRNA在RAW264.7巨噬细胞中有少量表达，而烧伤血清处理能诱导IL-10 mRNA表达增加；与转空载体相比，HSFl过表达对烧伤血清处理的RAW264.7巨噬细胞IL-10 mRNA的表达具有上调作用。结论：HSFl过表达可以抑制烧伤血清诱导的RAW264.7巨噬细胞TNF-a mRNA和HMGBlmRNA的表达，同时上调IL-10 mRNA的表达。第四章HSFl对IL-10的转录调控研究目的：探讨HSFl对IL-10的转录调控机制。方法：合成IL-10基因启动子区含HSE位点的寡核苷酸探针进行凝胶滞留实验(EMSA)，分析HSFl与IL-10基因启动子区的HSE的结合情况，并构建IL-10基因启动子的萤光素酶报告基因质粒，与HSFl表达质粒共转染RAW264.7细胞，检测萤光素酶活性，观察HSFl转染对启动子活性的影响。结果：生物素标记的HSFl结合片段(-376bp～-369bp)和核蛋白提取物孵育后能观察到阻滞带，阻滞现象能够被自身非标记探针竞争，但不被非标记的突变探针竞争，加入HSFl单克隆抗体，可以观测到超阻滞带，表明HSFl可以特异性结合于“HSFl识别序列”，HSE核心结合位点突变后，相对萤光素酶活性突变体(34.23±2.14)相对野生型(110.09±5.48)下降3.2倍，P值＜0.01，通过EMSA证实了IL-10启动子区域(-688bp～+64bp)存在HSFl的结合位点HSE(-376bp～-369bp)；突变体双萤光素酶活性分析发现HSFl的结合位点核心碱基的突变，其转录活性下降。结论-HSFl可以特异性结合于IL-10启动子区HSE(-376bp～-369bp)，相对萤光素酶活性分析提示HSFl可以转录激活IL-10，上调其表达。
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